T7 High Yield RNA Transcription Kit

T7 High Yield RNA Transcription Kit Vazyme Biotech Co., Ltd 网站 /Web: 咨询热线 /Tel: 400-600-9335 销售 /Sales: sales@vazyme.com 技术支持 /Support: support@vazyme.com 技术服务 /Service: service@vazyme.com Vazyme biotech co., ltd. 使用说明书 Version 5.1

目录 Catalog 产品概述 T7 High Yield Transcription Kit 是使用 T7 RNA 聚合酶进行体外转录的优化反应体系, 适用于体外转录合成大量的 RNA 产物, 以及将修饰过的核苷酸掺入到 RNA 中形成生物素或者染料标记的 RNA 本试剂盒每个 20 μl 的反应可以从 0.5 μg 的对照模板中产生 150-200 μg 的 RNA 产物, 转录合成的 RNA 适用于多方面的下游应用, 比如 RNA 结构与功能研究,RNA 酶保护实验, 探针杂交,RNAi, 显微注射, 体外翻译等 产品组成 组分 TR101-01(50 rxn) TR101-02(100 rxn) T7 RNA Polymerase Mix Reaction Buffer(10 ) ATP Solution UTP Solution GTP Solution CTP Solution DNase I Control Template (0.5 µg/µl) 10 µl 1 ml 40 µl 2 1 ml 产品概述产品组成贮存及有效期适用范围其它必需材料 DNA 模板准备体外转录方案转录产物纯化 RNA 产物定量常见问题及解决方案 贮存及有效期 -20 保存, 有效期一年 适用范围 体外 RNA 合成 其它必需材料 DNA 模板 : 待转录的 DNA 模板上游必需有正确的 T7 RNA 聚合酶启动子, 建议模板浓度为 0.5 µg/µl, 溶于水或者 TE 缓冲液 (10 mmtris-hcl (ph 7 8),1 mm EDTA) 中 RNase-free EP 管和移液器吸头 37 度水浴锅或者 PCR 仪 RNA 产物纯化所需的试剂和仪器 01/ 02

DNA 模板准备 序列上游带有双链 T7 启动子的 DNA 包括线性化的质粒 DNA,PCR 产物或者合成的 DNA 片段都可以用做 T7 High Yield RNA Transcription Kit 体外转录的模板 推荐使用浓度为 0.5 µg/µl 溶于水或者 TE 缓冲液 (10 mmtris-hcl (ph 7 8),1 mm EDTA) 的 DNA 作为体外转录的模板 图 1 简单的描述了 T7 RNA 聚合酶启动子 体外转录的起始位点以及 RNA 产物的形式 3. 合成的 DNA 片段作为模板合成的带有双链 T7 启动子的 DNA 片段也可以作为体外转录的模板使用 每 反应体系中使用 0.1-0.5 µg 合成的 DNA 片段 体外转录方案 在进行体外转录反应操作之前, 强烈建议佩戴手套并使用无核酸酶 EP 管和试剂, 以避免引入 RNA 酶污染 1. 标准方案 1) 溶解所需试剂后震荡混匀并短暂离心 (1-2s) 收集到管底, 使用前请将所有成分置于冰上 2) 按以下顺序配制反应 : 体积 图 1. T7 RNA 聚合酶介导的转录反应 1. 质粒模板以质粒做为转录模板时, 质粒的线性化和纯度对转录产量以及 RNA 完整度有重要影响, 普通提取的质粒在保证绝大多数质粒保持超螺旋状态并且无 Rnase, 蛋白, RNA 和盐残留的情况下可作为转录模板使用 环状质粒做为模板时由于没有有效终止, 会转录出不同长度的 RNA 产物, 为了得到特定长度的 RNA, 用质粒作为转录模板时必须完全线性化, 可以选取插入片段后的酶切位点作为线性化位置 请使用酶切后产生平末端或者 5 突出末端的限制性内切酶进行质粒的线性化 线性化之后的 DNA 推荐在过柱纯化或者酚 / 氯仿抽提纯化后用于体外转录 纯化的线性化质粒作模板时请使用 1 µg 质粒每 反应体系 2.PCR 产物作为模板带有 T7 启动子的 PCR 产物可以作为模板用于体外转录 使用 PCR 扩增制作体外转录模板时请将 T7 启动子序列 (TAATACGACTCACTATAGGG) 加在待转录链的上游引物的 5 端 PCR 产物可以不经纯化直接作为模板, 但纯化后会得到更高的 RNA 产出 使用 PCR 产物用作体外转录的模板前, 请通过电泳确认条带单一性并估计浓度, 每 反应体系中使用 0.1-0.5 µg PCR 产物 Reaction Buffer(10 ) ATP GTP UTP CTP DNA 模板 (0.1-1 µg) T7 RNA Polymerase Mix 总体积 3) 混匀反应混合液并短暂离心 (1-2s) 收集,37 孵育 2 个小时 注 : 为了避免蒸发对反应体系的影响, 推荐使用 PCR 仪进行反应 对于小于 0.3 kb 的短片段 RNA 的合成, 为了达到最大产量, 可以延长 37 孵育时间到 4 小时或者更长,16 小时的过夜反应不会影响产物质量 4) 可选 : 向反应体系中加入 1 µl Dnase,37 孵育 15 分钟消化用于转录的 DNA 模板 5) 合成的 RNA 稀释后可电泳分析或者纯化后用于下游实验 注 : 一个正常的转录反应可以产物大量 RNA 产物, 浓度高达 10 µg/µl, 推荐使用无核酸酶的水稀释后使用 03/ 04

2. 使用修饰核苷酸的 RNA 合成方案 1) 溶解所需试剂后震荡混匀并短暂离心 (1-2s) 收集到管底, 使用前请将所有成分置于冰上 图 2. 三种不同长度模板在标准转录反应中产物积累曲线 2) 按顺序配制反应 : 体积 Reaction Buffer(10 ) ATP GTP CTP UTP 1.5 µl Modified UTP(10 mm) 5 µl DNA 模板 (0.1-1 µg) T7 RNA Polymerase Mix 总体积 3) 混匀反应混合液并短暂离心 (1-2s) 收集,37 孵育 2 个小时 注 : 为了避免蒸发对反应体系的影响, 推荐使用 PCR 仪进行反应 对于小于 0.3 kb 的短片段 RNA 的合成, 为了达到最大产量, 可以延长 37 孵育时间到 4 小时或者更长,16 小时的过夜反应不会影响产物质量 修饰过的核苷酸会降低转录效率, 导致最终产量低于标准方案 4) 可选 : 向反应体系中加入 1 µl Dnase, 37 孵育 15 分钟消化用于转录的 DNA 模板 5) 合成的 RNA 稀释后可电泳分析或者纯化后用于下游实验 注 : 一个正常的转录反应可以产物大量 RNA 产物, 浓度高达 10 µg/µl, 推荐使用无核酸酶的水稀释后使用 图 3. 不同起始量的 0.8 kb PCR 产物模板在标准转录反应中 2 个小时后产物累积量 转录产物纯化 未经修饰的 RNA 产物可以通过酚 / 氯仿抽提或者过柱纯化, 修饰的 RNA 产物推荐使用过柱纯化, 如果实验对全长的 RNA 产物要求很高, 推荐使用切胶回收纯化 1. 酚 / 氯仿抽提纯化 酚 / 氯仿抽提可以去除蛋白和绝大部分未掺入的游离核苷酸 1) 加入 160 µl RNase-free water 将反应稀释到 180 µl 并混匀 2) 加入 3M 的醋酸钠 ( ph5.2 ) 到稀释后的反应体系中并混匀 3) 使用等体积的酚 / 氯仿 ( 体积比 1:1) 抽提一次, 并使用等体积的氯仿抽提 2 次 收集上层水相到新的 EP 管中 4) 加入 2 倍体积的无水乙醇并混匀,-20 孵育至少 30 分钟, 离心机冷却至 4 后 使用最大转速离心 15 分钟沉淀 RNA 5) 弃上清并加入 500 µl 预冷的 70% 乙醇洗涤 RNA 沉淀 6) 离心弃上清并使用 Rnase-free water 或者其它需要的缓冲液溶解 RNA 7) -70 保存 05/ 06

2. 柱纯化柱纯化可以去除蛋白和未掺入的游离核苷酸 加入 80 µl RNase-free water 将反应稀释到 并混匀, 依照柱纯化说明书纯化合成的 RNA, 请注意每个反应产生 150-200 µg 的 RNA 产物, 可能超出结合柱的承载能力, 需要更多的结合柱用于纯化 RNA 产物定量 RNA 产物可以通过紫外吸收来定量, 但未掺入的游离核苷酸会影响定量的准确性, 如果使用此方法时行定量推荐将产物 RNA 纯化去除游离核苷酸后再用于定量 推荐使用 RiboGreen 染料进行 RNA 定量, 未掺入的游离核苷酸不会影响定量, 可以对纯化或者未纯化的反应产物中的 RNA 进行准确定量 常见问题及解决方案 4. RNA 产物电泳分析显示目的条带下有拖尾降解用作体外转录的 DNA 模板被 RNA 酶污染, 体系中的 RNA 酶抑制剂只能抑制痕量的 RNA 酶残留, 如果模板中 RNA 酶过多请重新纯化模板 5. RNA 产物大于预期大小如果变性胶图上显示产物大小大于预期, 质粒模板可能没有完全线性化 即使少量环状模板也能产生大量转录产物, 请确认模板已完全线性化 另一个跑胶条带偏大的原因是 RNA 存在未完全变性的二级结构 6. RNA 产物小于预期大小如果变性胶上显示 RNA 条带小于预期大小, 则很有可能是由于转录提前终止 有些序列由于类似于 T7 RNA 聚合酶的终止序列会导致转录的提前终止, 这种情况可以通过降低反应温度到 30 以增加全长产物的比例, 但同时也会降低总体产量 对于高 GC 或者存在高级结构的模板提高反应温度到 42 或者使用单链结合蛋白可能会有助于增加全长产物的产出 1. 对照反应对照模板是带有 T7 启动子的 1.4 kb 的 DNA 片段, 对照反应在两个小时的孵育之后可以产生 150-200 µg 的 RNA 产物, 如果对照反应产量低 :a, 重新定量 RNA 产物, 推荐使用两种不同的方法进行定量, b, 检查实验过程并重复一次对照反应, 如果两次对照反应均低于预期请联系诺唯赞寻求技术支持 2. 反应产量低正常情况下一个反应可以产生 150-200 µg 的 RNA 产物, 但由于模板的不同会出现比较大的产量差别, 如果使用您的实验模板进行的反应产量过低, 请首先做一个对照反应, 如果对照反应也不能达到正常产量, 请联系诺唯赞寻求技术支持 如果对照反应正常, 但您的实验模板产物的 RNA 量明显低于对照反应, 可能的原因是实验模板中有抑制反应的成分, 为了区分出这种可能, 建议同时做一个对照反应, 一个实验反应, 一个对照和实验混合反应, 如果混合反应中对照模板的产量也显著降低, 即说明实验模板中有抑制反应的成分 ; 如果对照模板产量正常但实验模板产量低, 说明实验模板本身原因导致产是低, 请尝试以下方案解决 : 1, 尝试其它的启动子和 RNA 聚合酶 ;2, 检查 DNA 定量是否准确以及模板是否完整并且条带单一 ;3, 延长 37 孵育时间到 6-10 小时或者过夜 3. 短片段转录产物产量低 如果转录产物小于 300 nt, 延长反应时间或者增加模板 DNA 使用量可以提高最终 RNA 产量 过夜反应 (16 小时 ) 或者使用 2 µg 模板可以最大化 RNA 产量 07/ 08