704 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 15 卷 度凝胶电泳仪 DGGE-2401, 美国 C.B.S 公司 ;UVI 紫外成像系统 OMega10, 美国 Ultralum 公司 ;YQX 型厌氧培养箱, 上海跃进医疗器械厂 ; 高速冷冻离心机 Allegra

应用与环境生物学报 2009,15 ( 5 ): 703~707 Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X 2009-10-25 DOI: 10.3724/SP.J.1145.2009.00703 * 亚麻温水脱胶液中细菌菌群结构分析 凌宏志葛菁萍魏薇平文祥 ** ( 黑龙江大学生命科学学院, 微生物黑龙江省高校重点实验室哈尔滨 150080) 摘要为了探讨实验室条件下模拟的工厂亚麻温水脱胶液中细菌菌群结构, 采用纯培养技术和 PCR-DGGE 技术 (Denaturing gradient gel electrophoresis) 对细菌菌群结构进行了研究. 用纯培养方法分离获得 9 类菌落, 其中假单胞菌属 (Pseudomonas) 在有氧培养条件下总是处于优势. 梭菌属 (Clostridium) 在厌氧培养过程中总是处于优势. 微球菌属 (Micrococcus) 和葡萄球菌属 (Staphylococcus) 只有亚麻脱胶初期才有发现. PCR-DGGE 指纹图谱显示, 亚麻温水脱胶过程中条带数量较少且没有明显种群群落结构演替过程. 通过对不同时期沤麻液中 16S rdnav3 片段 PCR 产物 d e 两个 DGGE 条带进行分子克隆 序列测定和 Blast 分析, 发现 e 条带包含的 16S rdnav3 片段除 e_35 外均属于假单胞菌属. d 条带包含着较多不同的 16S rdnav3 片段, 其中有传统方法没有分离到的泛菌属 (Pantoea) 细菌 一些 NCBI 未收录的 序列及一些非可培养微生物序列. 纯培养技术和 PCR-DGGE 技术的共同使用, 可以更全面准确地提供细菌多样性方面的信息. 图 4 参 15 关键词亚麻 ; 细菌多样性 ; 变性梯度凝胶电泳 (DGGE); 温水脱胶 CLC Q938.15 : Q939.97 Analysis of Bacterial Community in Water Retting of Flax* LING Hongzhi, GE Jingping, WEI Wei & PING Wenxiang ** (Key Laboratory of Microbiology, College of Life Sciences, Heilongjiang University, Harbin 150080, China) Abstract The bacterial community structure in water retting systems of Bei an flax in Heilongjiang, China was studied by using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and culture-dependent method, respectively. The results obtained from the culture-independent method showed that Pseudomonas and Clostridium were found the dominant genera using aerobic and anaerobic cultivation in water retting, respectively. Micrococcus and Staphylococcus were only observed within initial 16 h. The profile of DGGE fingerprints in water retting of different periods revealed that the bacterial groups group were relatively fewer. As a result, two major bands of 16S rdna genes fragments from DGGE profiles were further eluted from gel, prior to be reamplified and sequenced. The sequences of these fragments were compared with the database of GenBank (NCBI). 9 genera were identified from the water retting with the culture-dependent method. Compared with the database of GenBank, the results displayed that 11 sequences of band d shared 92%~99% homology of the known sequences (Pantoea, Bacillus, unidentified bacterium and new bacteria), while the 12 sequences of band e shared 96%~100% homology of the known sequences (Pseudomonas). This suggests that a combination of molecular and culture-dependent methods can be used to analyze and monitor the community structure of water retting effectively, and will give us more information of microorganism community structure. Fig 4, Ref 15 Keywords flax; bacterial diversity; denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE); water retting CLC Q938.15 : Q939.97 亚麻纤维作为一种古老的纺织原料在我国已有近千年的使用历史. 我国亚麻纤维生产主要采用温水脱胶法, 而对该方法的研究都集中于脱胶菌种的开发 脱胶用酶制剂的开发和工艺本身的改造 [1~4], 并没有开展对脱胶过程中细菌菌群结构的基础性研究. 本研究选择黑龙江省北安市种植的亚麻原茎为研究对象, 利用 PCR-DGGE 技术 [5~6] 和传统微生物 收稿日期 :2008-09-23 接受日期 :2009-01-06 * 黑龙江省自然科学基金项目 (No. C200505), 黑龙江省博士后启动基金项目 (No. LBH-Q05113), 黑龙江省人事厅留学回国择优资助项目, 黑龙江省教育厅振兴老工业基地成果转化项目 (No. 1152GZH03) 和哈尔滨市科技攻关项目 (No. 2007AA6CN032) 资助 Supported by the Natural Science Foundation of Heilongjiang, China (No. C200505), the Post Doctorial Startup Fund of Heilongjiang, China (No. LBH-Q05113 ), the Advanced Program of Department of Personnel of Heilongjiang, China, the Education Department of Heilongjiang, China (No.1152GZH03) and the Science and Technology Foundation of Harbin, China (No. 2007AA6CN032) ** 通讯作者 Corresponding author (E-mail: wenxiangp@yahoo.com.cn) 培养方法对脱胶过程中的细菌菌群结构进行了分析和比较, 以期阐明温水脱胶过程中细菌菌群结构的类型和变化规律, 为开展亚麻温水脱胶过程中微生物生态学的研究奠定基础. 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品来源黑龙江省北安市种植亚麻原茎, 采样后经 日晒风干备用. 1.1.2 培养基牛肉膏蛋白胨培养基作为一般细菌分离用培 养基. 果胶酶产生菌分离培养基 : 果胶 4 g, 蛋白胨 3 g,nacl 5 g, 琼脂 15~20 g,ph 7.0~7.2,115 灭菌 20 min. 1.1.3 主要试剂和仪器 DNA 纯化试剂盒购于北京天为时 代科技有限公司 ; 引物由上海博亚生物技术有限公司合成 ; Taq DNA 聚合酶及其他试剂购于宝生物工程 ( 大连 ) 有限公 司 ;PCR 扩增仪 Eppendorf GA, 德国 Eppendorf 公司 ; 变性梯

704 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 15 卷 度凝胶电泳仪 DGGE-2401, 美国 C.B.S 公司 ;UVI 紫外成像系统 OMega10, 美国 Ultralum 公司 ;YQX 型厌氧培养箱, 上海跃进医疗器械厂 ; 高速冷冻离心机 Allegra 21R Centrifuge, Beckman coulter, INC.,Millipore 纯水仪,Millipore S.A. FRANCE. 1.2 温水脱胶方法选择长度 50~60 cm 粗细均匀的亚麻原茎经去土 去杂处理, 按照麻 : 水 =1 : 10( 质量比 ) 的比例散放入六孔水浴锅中, 用不锈钢网使麻茎完全浸于水中, 在 35 条件下开始脱胶. 1.3 温水脱胶过程中采样方法 [7] 沤麻过程主要由 3 个时期组成, 即起泡发酵期 ( 脱胶开始的前 24~30 h, 此时麻茎膨胀但纤维没有和茎秆分离 ) 主生物期 ( 脱胶过程中 30~50 h, 此时在麻茎根部纤维已有分离迹象 ) 发酵末期 (50 h 以后, 纤维开始和麻茎分离 ), 所以在实验室脱胶过程中分别在这 3 个时期采集样品. 用 5 ml 无菌移液管, 在水浴锅中取 5 ml 发酵液进行相关研究. 1.4 厌氧培养方法采用 YQX 型厌氧培养箱进行厌氧培养. 1.5 沤麻液中细菌菌群的分类研究根据菌落和细胞的形态对所得微生物进行初步分类, 然后选择具有典型形态的优势菌落纯化后依据生理生化特 [8] 征进行分类. 最后进行菌群多样性的初步分析. 1.6 亚麻脱胶过程中细菌的 PCR-DGGE 分析 1.6.1 亚麻脱胶过程中细菌总 DNA 的提取和纯化分别于 16 h,28 h,40 h,52 h,64 h 取 1.5 ml 沤麻液, 加入 1.5 ml 离心管 中, 10 000 r/min 离心, 使用天为时代细菌基因组 DNA 提取试剂盒抽提沤麻系统中的总基因组. 1.6.2 16S rdna 的 PCR 扩增采用适用于细菌 16S rdna 基 因 V3 区的通用引物对, 其序列分别为 :F338GC:5 -CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG CGGGG CGGGG GCACG GGGGG ACTCC TACGG GAGGC AGCAG-3 ;R518:5 -ATTAC CGCGG CTGCT GG-3. 反应程序 :94 5 min 预变性 ;95 30 s,55 1 min,72 40 s,35 个循环 ;72 7 min. 扩增产 物采用 1% 琼脂糖分析检验. 1.6.3 变性梯度凝胶电泳 (Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) PCR 产物浓缩后, 采用 DGGE-2401 突变检测系统对样品进行 DGGE 分析. 所用的聚丙烯酰胺凝胶浓度为 6.5%, 变性梯度为 25%~55%(100% 的变性剂为 7 mol/l 尿素,40% 甲酰胺 ),150 V,60 恒温,1 TAE 中电泳 200~220 min, 银染 30 min,uvi 成像系统拍照. 用 Gel-Pro Analyzer 4.5 分析软件确定样品电泳条带的多少和条带的亮度峰值. 1.6.4 优势条带的基因克隆和测序将 DGGE 图谱中优势性条带标记后割胶回收 捣碎, 加入灭菌去离子水 离心 50 水浴 30 min 后离心取上清作为 PCR 的模板进行 PCR 扩增. 所用引物是 :P1(5 -CCTACGGGAGGCAGCAG-3 -CCTACGGGAGGCAGCAG-3 ) 和 P2 (5 -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 ). 反应程序为 :94 5 min 预变性 ;95 30 s,55 1 min,72 40 s,35 个循环 ;72 7 min. 将经过 UNIQ-10 柱纯化的 PCR 产物用 T4DNA 连接在 pgm-t Easy 载体上, 而后热激转化到 E. coli DH5α 菌株细胞中. 以氨苄青霉素 (100 μg/ml) 抗性和蓝白斑筛选选择阳性转 化子, 沸水浴煮沸 离心后取 2 μl 上清进行 PCR 扩增确认阳性克隆. 所用引物为载体引物 T7 及 SP6,PCR 扩增体系和程序与 16SrDNA-V3 区扩增相同. 送样到上海博亚生物技术公司进行 测序. 登陆 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast), 将所得的序列提交到 GenBank 登记, 在 GenBank 数据库中用 BLAST 进行检索和同源性比较. 2 结果与分析 2.1 温水脱胶过程中可培养细菌菌群初步分析温水脱胶液中下可培养的细菌菌落类型很少, 共分离得到 10 类菌落, 分别编号为 B1~B10, 其中 B8 较难培养, 在传代过程中逐渐死亡. 因此仅对其余的 9 类菌落进行了菌落形态和生理生化特征的初步鉴定, 将结果与 常见细菌鉴定手册 进行比对分析可知,B1~B7 分属于肠杆菌科 (Enterobacteriaceae) 假单胞菌属 (Pseudomonas) 葡萄球菌属 (Staphylococcus) 类芽孢杆菌属 (Paenibacillus) 节杆菌属 (Arthrobacter) 微球菌属 (Micrococcus) 芽孢杆菌属 (Bacillus),B9 为黄杆菌属 (Flavobacterium) B10 为梭菌属 (Clostridium). 在有氧培养过程中假单胞菌属的数量在沤麻过程中总是处于优势, 最多为 2.5 10 7 cfu/ml. 梭菌属在厌氧培养过程中总是处于优势, 最多为 5.4 10 5 cfu/ml. 而芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属厌氧培养时菌数最多为 2.1 10 5 cfu/ml 和 1.8 10 5 cfu/ml, 有氧培养时菌数最多为 6.7 10 4 cfu/ml 和 5.4 10 4 cfu/ml. 微球菌属和葡萄球菌属只有亚麻脱胶初期才有 发现. 余下菌属是在不同时期分离得到并且数量很少应不属于优势菌群. 这一结果与文献 [7] 所述的由温水沤麻液中共分离得到 12 类菌落比较接近. 因此, 亚麻温水脱胶过程中细菌菌群可能并不十分丰富, 而菌群不丰富的原因可能与脱胶过程中脱胶液 ph 值的变化有关, 也可能与分离培养基的分离效果有关, 需要进一步的研究. 2.2 16S rdna V3 高变区的 PCR 扩增将沤麻液中总 DNA 纯化物的 PCR 产物用 1% 的琼脂糖凝胶进行电泳, 发现所有以总 DNA 纯化物为模板的 PCR 反应都获得特异性扩增片段, 长度在 200~250 bp( 图 1). 图 1 不同时间各地沤麻系统中的胶回收结果 Fig. 1 Purification of PCR fragments from different samples in 16 h, 28 h, 40 h, 52 h and 64 h Lane 1: 16 h; Lane 2: 28 h; Lane 3: 40 h; Lane 4: 52 h; Lane 5: 64 h; Lane 6: DL2000 marker 2.3 DGGE 分析将从不同脱胶时期提取的 DNA 样品进行 16S rdnav3 区扩增, 扩增产物进行 DGGE 分析. 从银染结果可以看出, 不同脱胶时间样品的电泳图谱从条带的位置 多少 亮度上看均比较接近 ( 图 2), 说明不同时期脱胶液中可能存在相同的菌群结构, 这一结果与传统纯培养所得结果有一些差异, 这可能是由于 DGGE 电泳中不同序列的条带出现共迁移所引起的. 其中 a b d e f 四种条带在不同时期的样品中均有存在, 可

5 期凌宏志等 : 亚麻温水脱胶液中细菌菌群结构分析 705 能是亚麻脱胶过程中的主要优势菌群, 对亚麻脱胶过程起决定性的作用. 其中 a 条带只是脱胶 40 h 时显示最亮, 在其他脱胶时间带亮度相当, 表明可能在亚麻脱胶的主生物期起主要作用. b d 条带在发酵 28 h 所显示出的亮度最强, 在其他发酵时间条带亮度较弱, 可能在起泡发酵期起主要作用. e 条带在各个泳道都是最亮的条带, 可以认为该条带代表脱胶过程中最为优势的菌群. f 条带在沤制初期 16 h 最弱, 而随着沤制时间的延长这个条带的亮度逐渐增强, 这表明该条带所代表菌群随沤制时间的延长, 逐渐成为优势菌菌群, 可能在脱胶过程中起的作用越来越大. c g 两个条带在亚麻沤制的不同时期产生, 而且条带亮度均非常微弱, 应属于亚麻沤制过程中的劣势菌群, 对于亚麻的脱胶过程不起主要的影响. c 条带只是在 60 h 产生,g 条带出现在脱胶 16 h, 可能这两种菌分别在亚麻脱胶的特定时期其特殊的作用. 由以上结果可知, 纯培养法和 PCR-DGGE 方法所获的菌 图 2 北安沤麻系统中不同时间的 DGGE 结果 Fig. 2 DGGE profiles of Bei an flax system in different time Lane 1: 16 h; Lane 2: 28 h; Lane 3: 40 h; Lane 4: 52 h; Lane 5: 64 h 群信息有一定的差异, 这也同其他一些微生物多样性研究中所遇到的问题相类似. PCR-DGG 方法以其灵敏的检测效果能检测到更加准确的菌群动态信息, 而自身的缺陷又使其有一定的误差. 而通过纯培养获得菌种数量较少, 并且通过纯培养获得的菌种也并不一定是起主要作用的 [9]. 本研究中所用细菌分离培养基营养较为丰富, 这也可能对沤麻系统中的细菌有一定的选择性 [10]. 2.4 DGGE 条带基因片段的测序分析亚麻温水脱胶系统中 e 条带的亮度最强, 因此应代表了脱胶过程中的主要菌群. 而 d 条带则是相对亮度最低的条带, 也就是亚麻沤制沤制过程中的非主要菌群. 从而选取北安 28h 脱胶系统中 e 条带和 d 条带进行回收并克隆, 经连接转化 后分别随机挑取 13 个 11 个白色单菌落, 经过克隆测序后, 在 GenBank 数据库中用 BLAST 进行检索和同源性比较, 并构建 系统发育树, 结果如图 3 4 所示. 由图 3 可见,DGGE 图谱的 d 条带中可能主要含有 4 类菌群, 即泛菌属 芽孢杆菌属 不可培养细菌及未知细菌. 其中 d_3 d_5 d_9 和 d_12 之间的遗传距离较近, 同源性达 95%, 以泛菌属为主, 归为一族, 名为 Group Ⅰ;d_7 d_21 d_28 属未知细菌, 虽然相似性较低, 最高才 52%, 但三者在 GenBank 数据库中均没有与其同源性高的序列, 因此将它们归为一族, 名为 Group Ⅱ;d_22 d_20 d_6 之间总的同源性达 67%, 在系统进化树上属同一分支, 将其归为一族, 名为 Group Ⅲ, 其中 d_22 与 d_20 两个菌种的同源性相对较高, 达 92%. 系统发育树 ( 图 4) 结果显示, 起源于条带 e 的测序片段所代表的菌和与其相对应的标准菌之间同源性都较高, 介于 96%~100% 间. 其中除 e_43 与 e_21 e_28 e_31 之间的同源性能达到 99% 外, 其余各菌之间的同源性均较低, 最高才 53%, 这可能是由于脱胶系统中其他优势菌群遗传距离都较 图 3 脱胶系统中 DGGE 差异条带 d 的系统发育分析 Fig. 3 Phylogentic analysis of the sequences of the excised DGGE band d. The numbers in parentheses represent the sequences accession number in GenBank. The number at each branch point is the percentage supported by bootstrap. Bar, 5% sequence divergence. The same below

706 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 15 卷 图 4 脱胶系统中 DGGE 优势条带 e 的系统发育树 Fig. 4 Phylogentic analysis of the sequences of the excised DGGE band e 远的原因. 3 讨论 [11~12] 虽然温水亚麻脱胶方法生产亚麻纤维的历史很长, 但温水脱胶过程中细菌群落的作用和生态学特性一直没有得到深入的研究. 而只有了解细菌群落多样性和动态性等信息, 才能提高对亚麻温水脱胶的人为控制能力和优良脱胶菌种的选育能力. 本研究在实验室条件下模拟工厂亚麻温水脱胶过程, 其 3 个脱胶时期亚麻茎秆的变化和液面的变化与工厂亚麻温水脱胶现象基本吻合. 用传统纯培养方法在亚麻温水脱胶的不同时期共获得 9 个种属的细菌, 而在不同的采样时间种属数量最多为 4 个 (16 h 采样 ). DGGE 指纹图谱所出现的条带数也很稀少, 清晰可见为 4~5 条. 这表明, 在亚麻脱胶过程中, 脱胶系统中细菌菌群多样性可能并不十分丰富. 分析可能主要存在两方面的原因 : 一方面, 亚麻原茎脱胶过程中, 由于微生物的生长代谢产生大量的酸性物质, 从而使沤麻液中的 ph 值不断下降最终可达 5~5.5, 因此很多种属不能适应这一 环境而遭淘汰 ; 另一方面,DGGE 作为一种微生物多样性的分析方法有其特有的一些技术优势, 但也存在这一些缺陷 [13~15]. 在对 d 条带测序结果比对中, 发现同一个条带中含有几类不同的种群, 即具有不同序列的条带可能出现共迁移的问题, 对不同序列共迁移问题的解决是目前 PCR-DGGE 方法尚待改进的主要原因之一. 可以利用 PCR-DGGE 与其他分子生物学技术相结合的方法来共同反应生物多样性, 使多样性的分析结果更为客观准确. References 1 Danny EA, Morrison WH, Rigsby LL. Influence of water presoak on enzyme-retting of flax. Ind Crop Prod, 2003, 17: 149~159 2 Sharma HSS, Faughey G, Lyons G. Comparison of physical, chemical, and thermal characteristics of water-, dew-, and enzyme-retted flax fibers. J Appl Polym Sci, 1999, 74: 139~143 3 Gang J ( 冮洁 ), Liu XL ( 刘晓兰 ), Zheng XQ ( 郑喜群 ), Wu GH ( 吴耕红 ). Effects of NH 4 HCO 3 on retting flax. Chin J Appl Environ Biol ( 应用与环 境生物学报 ), 2004, 10 (1): 53~55 4 Liu XL ( 刘晓兰 ), Zheng XQ ( 郑喜群 ), Gang J ( 冮洁 ), Li CZ ( 李传柱 ). Studies on the process and biotechnology of flax degumming. Chin J Appl Environ Biol ( 应用与环境生物学报 ), 2001, 6 (4): 392~395 5 Muyzer G, Waal ED, Uitterlinden AG. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymer aw chain reaction-amplified gene coding for 16S rrna. Appl Environ Microbiol, 1993, 59: 695~700 6 Yu Z, Morrison M. Comparisons of different hyper variable regions of rrs genes for use in fingerprint of microbial communities by PCRdenaturing gradient gel electrophoresis. Appl Environ Microbiol, 2004, 70 (8): 4800~4806 7 Wei DL ( 卫德林 ). Mechanism and New Technology of Water-retting. Haerbin, China ( 哈尔滨 ): Heilongjiang Press of Science ( 黑龙江科学技 术出版社 ), 1988. 46~84 8 Dong XZ ( 东秀珠 ), Cai MY ( 蔡妙英 ). Manual of Determinative Common Bacteriology. Beijing, China ( 北京 ): Science Press ( 科学出版 社 ), 2001. 253~298 9 Chen TS ( 陈桐生 ), Li JJ ( 李建军 ), Cen YH ( 岑英华 ), Sun GP ( 孙国 萍 ). Analysis of microbial diversity and community composition after enrichment with deodorizing biofilter by DG-DGGE. Chin J Appl Environ Biol ( 应用与环境生物学报 ), 2006, 12 (1): 113~117 10 Sun XT ( 孙晓棠 ), Yao Q ( 姚青 ), Liu QG ( 刘琼光 ), Zhu HH ( 朱红惠 ). Capacity evaluation of different media for isolating bacteria populations from the rhizospere of tomato plants with DGGE. Acta Microbio Sin ( 微 生物学报 ), 2006, 46 (3): 482~486

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