猪流产衣原体MOMP基因的克隆与表达

猪流产嗜性衣原体 omp1 基因的克隆及其原核表达栗绍文江涛赵俊龙姚宝安 (1. 华中农业大学动物医学院, 武汉 430070;2. 湖北省预防兽医学重点实验室, 武汉 430070) 摘要 :omp1 基因编码的主要外膜蛋白是流产嗜性衣原体主要的保护性抗原 本研究通过 PCR 扩增了猪流产嗜性衣原体 omp1 基因, 并进行了测序鉴定 在此基础上将其连接到 pgex-kg 表达载体上, 构建原核表达质粒, 转化 E.col ibl21-codonplus 表达菌,IPTG 诱导表达, 表达产物经 SDS-PAGE 和 Western-blot 分析鉴定 结果表明质粒可以融合表达, 且表达产物与衣原体阳性血清具有特异性结合能力 本研究为进一步研究猪流产嗜性衣原体诊断和免疫预防奠定了基础 关键词 : 猪 ; 流产嗜性衣原体 ;omp1 基因 ; 克隆 ; 原核表达 流产衣原体 (Chamydophilia abortus,ca) 属于衣原体科嗜衣原体属, 过去称为鹦鹉衣原体 -1 型 (Chlamydia psittaci 1,Cps-1), 是一种介于细菌和病毒之间的专性细胞内寄生的革兰氏阴性微生物 CA 主要寄生于猪 牛 羊等多种动物生殖道黏膜表面的上皮细胞内, 造成生殖道黏膜受损, 导致以母畜流 产 死胎 弱胎, 公畜睾丸炎 尿道炎 龟头包皮炎等为特征的慢性接触性传染病 本病也是引起集约 化猪场繁殖障碍的主要疾病之一, 可造成巨大经济损失 另外 CA 作为一种人兽共患病病原, 孕妇感染后 [13] 可发生流产或者其他疾病, 因此也具有重要的公共卫生意义 40kD 的主要外膜蛋白 (Major outer membrane protein,momp) 是流产嗜性衣原体最主要的的一种保护性抗原, 它是由全长 1170bp 的 omp1 基因编码 其主要结构包括 5 个保守区和 4 个可变区, 具有衣原体属 种 型和亚型的特异性抗原决定 簇 ; 该蛋白通过二硫键使衣原体形成一个整体, 同时具备黏附宿主细胞 辅助衣原体侵染的功能, 也是 [5,8,11] 衣原体从宿主细胞摄取 ATP 等物质的离子信道 其保护性抗原的特点使其成为衣原体分子诊断和基 因工程疫苗研究的热点 [1-8,] 本研究克隆了猪流产嗜性衣原体的 omp1 基因, 并进行了原核表达, 初步探 讨了表达产物的免疫学活性, 为进一步研究流产嗜性衣原体的诊断方法和基因工程疫苗奠定了基础 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 猪流产嗜性衣原体 HB 分离株由本室保存 ; 1.1.2 菌株与质粒 E.coli DH5α E.coli BL21-CodonPlus 及 pgex-kg 表达载体由本室保存 1.1.3 主要试剂 DNA Ladder 2000 15000 购自晶美生物工程有限公司 ;EcoRⅠ SalⅠ SmaⅠ 限制性内切酶 T 4 DNA 连接酶 rtaq DNA 聚合酶 dntps pmd18-t Vector 为宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司产品 ; 细菌 DNA 提取试剂盒 UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒 HRP 标记兔抗山羊 IgG 购自武汉凌飞科技有限公司 ; 异丙基硫代 -β-d- 半乳糖苷 (IPTG) 购自 Merk 公司 ; 衣原体阳性血清购自兰州畜牧兽医研究所 ; 其它试剂均为分析纯 1.2 方法 1.2.1 PCR 引物的设计与合成根据流产嗜性衣原体 omp1 基因的已知序列, 设计引物如下 :P1:5, -ATG AAA AAA CTC TTG AAA TCG G-3, ;P2:5, -TTA GAA TCT GAA TTG AGC ATT CAT-3, 引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成 1.2.2 猪流产嗜性衣原体基因组 DNA 的提取取感染鸡胚卵黄囊, 加适量灭菌生理盐水充分研磨, 取适量研磨液于 1.5ml 离心管中,3000r/min 离心 10min, 取上清, 再 15000r/min 离心 30min, 取沉淀, 1

按细菌 DNA 提取试剂盒的操作步骤提取基因组 1.2.3 omp1 基因的 PCR 扩增以提取的猪流产嗜性衣原体基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增 反应体 系为 25μL: 模板 5μl, 引物 P1(10μM) 和 P2(10μM) 各 1μl,10 Taq Buffer 2.5μl,dNTP Mixture2.0 μl,rtaq DNA Polymerase(5U/μl) 0.3μl, 加去离子水至总体积 25μl; 反应条件 :94 预变性 5min, 然后 94 30sec,58 30sec,72 1min, 共 35 个循环, 最后 72 延伸 5min 扩增产物经 1.0 % 琼脂糖 凝胶电泳鉴定 1.2.4 omp1 基因的克隆回收特异性扩增片段后, 将其与 pmd18-t 载体连接 ; 转化大肠杆菌 DH5α, 挑取菌落摇菌过夜, 小提质粒, 酶切鉴定为阳性者送上海华诺公司测序 1.2.5 重组表达质粒 pgex-kg-omp1 的构建根据测序结果重新设计引物 :P3:5 -G CGA ATT CCG ATG AAA AAA CTC TTG-3,5 端带有 EcoRⅠ 酶切位点 ;P4:5, -GT CGA CTC GAG TTA GAA TCT GAA TTG-3,,5 端带有 XhoⅠ 酶切位点 以带有目的片段的 pmd18-t 质粒为模板, 采用引物 P3 P4 进行 PCR 反应, 回收 PCR 产物 将 PCR 产物和 pgex-kg 表达载体分别用 EcoRⅠ XhoⅠ 进行双酶切后进行回收 连接, 转化大肠杆菌 BL21-CodonPlus 感受态细胞, 筛选阳性克隆送上海华诺公司测序 1.2.6 重组表达质粒 pgex-kg-omp1 的原核表达将重组阳性菌落加于有氨苄青霉素的 LB 液体培养基 中,37 300r/min 振摇培养 8 h, 置 4 过夜 次日按 1.. 100 比例接种于含有氨苄青霉素的 LB 培养基 中,37 200 r/min 振摇培养至 OD 600 达 0.4~0.6 时, 加入终浓度为 0.4~0.9 mmol/l 的 IPTG, 继续培养 3.5 h, 离心收集菌体 进行 SDS-PAGE, 检查诱导表达情况 1.2.7 包涵体的提取取诱导表达后的菌液,4 8000r/min 离心 5min, 弃上清 沉淀以 1/10 体积缓冲 液 A(50 mmol/l Tris-HCl ph 8.0,0.5 mmol/l EDTA,0.5mmol/L NaCl,5 % 甘油,0.5 mmol/l DTT) 重悬, 高强度超声波处理 8 次, 间隔 10 s/ 次 4 8000 r/min 离心 5 min, 弃上清 沉淀用 PBS(pH 7.4) 洗涤 2 次后, 加入 19.7 ml 缓冲液 A 及 0.3 ml 20 % 的 N- 十二烷基肌氨酸钠 (SKL) 溶液, 剧烈搅动, 使其 缓慢溶解, 室温静置 2 h 然后 4 12000 r/min 离心 10min, 上清中加入终浓度为 0.2 % 的 PEG4000, 1.0mmol/L 的氧化型谷胱甘肽,2.0 mmol/l 的还原型谷胱甘肽, 室温静置 2h 以 PBS 透析 3d, 取出 -20 保存备用 1.2.8 重组融合蛋白的免疫学活性初步研究重新进行 SDS-PAGE, 同时设空质粒对照, 切下凝胶的 Maker 道, 考马斯亮蓝染色, 脱色 ; 其余按凝胶面积以相应恒定电流将蛋白质转移到聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜上, 以 Washing Buffer(TBS,0.05%Tween-20) 清洗膜 3 次后, 用 Blocking Buffer(TBS,5%BSA) 封闭 30min; 用以 Blocking Buffer1:500 稀释的猪衣原体标准阳性血清 4 孵育过夜, 洗膜 3 次后用同 样 1:500 稀释的 HRP 标记兔抗羊二抗室温孵育 2h, 清洗后加入显色液 (18ml Tris-HCl ph7.6,12 mg 二氨 基联苯胺 DAB,2ml 0.3% NiCl 2,20μl H 2 O 2 ) 中显色, 待出现带后立即以去离子水终止显色, 合并 Maker 道, 观察结果, 拍照 2 结果 2.1 omp1 基因的克隆 应用 PCR 方法扩增并经琼脂糖凝胶电泳检测, 获得大小约为 1100 bp 的特异性片段 连接 pmd18-t 载体后进行测序, 通过 Blast 工具比对后确定为流产嗜性衣原体 omp1 基因, 用 DNAMAN 软件分析其 与其它衣原体代表株核苷酸序列相似性, 结果表明 : 与流产嗜性衣原体 OCLH196 株 鹦鹉热嗜性衣原 体 6 BC 株 肺炎嗜性衣原体 L71 株和沙眼衣原体 K/UW-31 株同源性分别为 99.7% 82.7% 69.3% 和 67.2% 2

2.2 重组表达质粒的构建及其在 E.coli 中的表达 omp1 的 PCR 产物和 pgex-kg 经双酶切 回收后连接构建重组质粒 pgex-kg-omp1 酶切鉴定为阳性的菌液进行测序, 确认目的基因与表达载体已正确连接 阳性重组质粒转化入 E.coli BL21-CodonPlus 中诱导表达, 表达产物经 SDS-PAGE 鉴定 可见经 IPTG 诱导后,pGEX-KG-omp1 菌出现一条表观相对分子质量约 63 ku 的蛋白质迁移带 pgex-kg 载体表达的 GST 单体蛋白为 26 ku, 表达的 omp1 大小约为 37ku, 表明 omp1 以融合蛋白的形式进行了表达 1 2 3 M 116kDa 66.2kDa 45kDa 35kDa 25kDa 18kDa 图 1 诱导表达后的 SDS-PAGE 结果 Fig.1 SDS-PAGE analysis of expression of recombinant plasmid after inducing M. 蛋白质分子量标准 ; 1. 诱导的 pgex-kg-omp1 /BL21-CodonPlus 2. 未诱导的 pgex-kg-omp1/bl21-codonplus 3. 诱导的 pgex-kg /BL21-CodonPlus; M. Protein marker; 1. Induced pgex-kg- omp1 /BL21-CodonPlus 2.pGEX-KG- omp1 /BL21-CodonPlus without induction; 3. Induced pgex-kg/bl21-codonplus 2.3 重组融合蛋白的免疫学活性研究以重组融合蛋白初步分离提纯后, 进行 Western-blot 检测 结果表明该蛋白带能被特异的衣原体阳性血清发生特异性结合 见图 2 图 2 重组蛋白质的 Western-blot 分析 Fig.4 Analysis of the recombinant protein by Western-blot M. 蛋白质分子量标准 (Protein marker); 1. GST-MOMP 蛋白 (GST-MOMP protein); 2. GST 蛋白 (GST protein) 3 讨论 3.1 流产嗜性衣原体 omp1 核苷酸序列分析 omp1 基因编码的 40kD 的主要外膜蛋白是流产嗜性衣原体最主要的的一种保护性抗原, 也是目前流产嗜性衣原体诊断和免疫预防研究的热点 [1-8,] 国内刘向伟(2002) 邱昌庆(2002) 杨琪(2005) 等进行了猪流产嗜性衣原体 omp1 基因的克隆及测序 [9,10,12] 本研究利用自行设计的引物进行 PCR 扩增, 获得了猪流产嗜性衣原体 omp1 目的基因 并通过 Blast 工具和 DNAMAN 软件分析, 表明该基因基因序列与 3

Genebank 中收录的流产嗜性衣原体 OCLH196 株 鹦鹉热嗜性衣原体 6 BC 株 肺炎嗜性衣原体 L71 株和 沙眼衣原体 K/UW-31 株同源性分别为 99.7% 82.7% 69.3% 和 67.2% 3.2 重组蛋白的表达与免疫学活性 [12] 杨琪 (2005) 将流产嗜性衣原体 omp1 基因克隆到 PET-32a 表达载体并进行了原核表达 本实验 将流产嗜性衣原体 omp1 基因克隆到 pgex-kg 原核表达载体中构建重组质粒,E.coli 中表达了表观相对 分子质量约为 63ku 的融合蛋白, 其中载体 GST 为 26 ku, 目的蛋白 MOMP 约为 37ku, 与 GST 融合存在, Western-blot 分析表明获得的融合表达产物与衣原体特异性抗血清有较强的反应原性 本研究也这为进 一步研究流产嗜性衣原体诊断方法和免疫预防奠定了基础 参考文献 [1] Héchard C., Grépinet O., Rodolakis A., Evaluation of protection against Chlamydophila abortus challenge after DNA immunization with the major outer-membrane protein encoding gene in pregnant and non-pregnant mice[j]. J. Med. Microbiol. 2003,52 :35 40. [2] Igietseme J U, Black C M, Caldwell H D, et al. Chlamydia Vaccines: Strategies and Status[J]. BioDrugs, 2002, 16: 19-35. [3] Igietseme J U, Eko F O, Black C M. Contemporary approaches to designing and evaluating vaccines against Chlamydia [J].Vaccines, 2003, 2(1): 129-146. [4] Kim L. Millman,Simon Tavare,And Deborah Dean. Recombination in the ompa Gene but Not the omcb Gene of Chlamydia Contributes to Serovar-Specific Differences in Tissue Tropism, Immune Surveillance, and Persistence of the Organism[J]. Journal Of Bacteriology, 2001,193(20):5997 6008. [5] Longbottom D.,Chlamydial vaccine development[j].j Med Microbiol,2003 (52):537-540 [6] Ludwig E. Hoelzle, Katharina Hoelzle, Max M. Wittenbrink. Expression of the Major Outer Membrane Protein (MOMP) of Chlamydophila abortus, Chlamydophila pecorum, and Chlamydia suis in Escherichia coli using an Arabinose-inducible Plasmid Vector[J]. J. Vet. Med. B,2003 50:383 389. [7] Ludwig E. Hoelzle, Katharina Hoelzle, Max M. Wittenbrink. Recombinant major outer membrane protein (MOMP) of Chlamydophila abortus, Chlamydophila pecorum, and Chlamydia suis as antigens to distinguish chlamydial species-specific antibodies in animal sera[j]. Veterinary Microbiology,2004,103:85 90. [8] Nicholas R. Thomson, Corin Yeats, David Longbottom et al.the Chlamydophila abortus genome sequence reveals an array of variable proteins that contribute to interspecies variation [J]. Genome Research,2005,15:629-640. [9] 刘向伟, 端青, 张浩杰等. 鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白基因序列的扩增 克隆和原核表达 [J]. 微生物学免 疫学进展, 2002, 30(2): 32-34. [10] 邱昌庆, 周继章, 谷玉辉. 猪源鹦鹉热衣原体外膜主蛋白编码基因的克隆和序列测定 [J]. 中国兽医科技, 2002, 32(6): 10-14. 萨姆布鲁克 J, 拉塞尔 D.W. 分子克隆实验指南 [M]. 第 3 版. 黄培堂等译. 北京 : 科学出版社, 2002.1123-1126. [12] 杨琪, 何诚, 雷鸣等. 猪流产衣原体 CP/12 株 omp-1 基因的克隆与表达 [J]. 中国农业大学学报,2005,10(3): 56-59. [13] 于恩庶, 李子华, 焦新安等. 新发现和再肆虐的传染病续编 [M]. 香港 : 亚洲医药出版社, 2000. 169-170. 4

Cloning and prokaryotic expression of omp1 gene of Chlamydophila abortus of swine Li Shaowen Jiang Tao Zhao Junlong Yao Baoan (1. College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. Preventive Veterinary Key Lab of Hubei Province, Wuhan,430070,China) Abstract:Major outer membrane protein (MOMP) encoded by omp1 gene is the major protective protein of Chlamydophila abortus. In our study, the omp1 gene of Chlamydophila abortus of swine was amplified by PCR and was sequenced. The gene was cloned into pgex-kg prokaryotic expressive vector, and the constructed recombinant plasmid was transformed into the host bacteria E.coli ibl21-codonplus. The expressive product induced by IPTG was identified by SDS-PAGE and Western-blot. The results showed that the plasmid could fusion express and the recombinant expression protein could react specifically with immune serum against Chlamydophila. The study is the basis of research on the diagnosis and prevention of Chlamydophila abortus. Keywords: Swine;Chlamydophila abortus; omp1 gene;clone; prokaryotic expression 5