微生物学通报 Microbiology China tongbao@im.ac.cn Jul. 20, 2013, 40(7): 1225 1230 2013 by Institute of Microbiology, CAS 研究报告 印第安纳沙门氏菌对氯霉素类药物耐药性分析 陆彦 1 晏志勋 1 赵红玉 2 侯晓林 1 吴国娟 (1. 北京农学院动物科学技术学院 北京 102206) (2. 中国科学院生物物理研究所 北京 100101) 1* 摘要 : 目的 调查鸡源沙门氏菌对氯霉素类药物的耐药特征和相关耐药基因的流行情况 方法 从山东省部分地区鸡孵化场 养殖场 屠宰场分离样品进行沙门氏菌鉴定和药物敏感性试验 ; 设计引物, 对氯霉素类药物的耐药基因进行 PCR 扩增和序列分析 结果 试验分离到印第安纳沙门氏菌, 分离率为 23.28% 孵化场 养殖场 屠宰场印第安纳沙门氏菌对氯霉素耐药率分别为 50.00% 83.33% 和 93.30%, 对氟苯尼考耐药率为 83.33% 100% 和 100%, 对甲砜霉素耐药率为 63% 65% 和 77% 在 80 株氯霉素类耐药菌株中, 54 株检测到 cata1 基因, 74 株检测到 flor 基因, 5 株检测到 cmla 基因 结论 不同来源印第安纳沙门氏菌对氯霉素类药物耐药率存在差异, cata1 和 flor 基因广泛存在于耐药菌株中 关键词 : 沙门氏菌, 药敏试验, 氯霉素类药物, 耐药基因 Resistance analysis of Salmonella Indiana to the chlmphenicols LU Yan 1 YAN Zhi-Xun 1 ZHAO Hong-Yu 2 HOU Xiao-Lin 1 WU Guo-Juan 1* (1. Beijing University of Agriculture, Animal Science and Technology College, Beijing 102206, China) (2. Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China) Abstract: [Objective] To investigate the characteristics of chloramphenicols resistance and 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (No. 31201949, 31172362); 北京市人才强教深化计划 ; 北京农学院 2012 年度科研质 量提高经费资助项目 (No. GJB2012003, PXM2012_014207_000010) * 通讯作者 :Tel: 86-10-80796702; : wgj9288@sina.com 收稿日期 :2013-03-05; 接受日期 :2013-05-09
1226 微生物学通报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.7 the prevalence of resistance genes in Salmonella Indiana from chicken. [Methods] The samples were isolated from chicken hatcheries, farms and slaughterhouses in Shandong Province. The isolates were identificated and tested the drug susceptibility, designing primers for the resistance genes of chloramphenicols in strains were detected by PCR and sequence analysis. [Results] The results showed that the isolation rate of Salmonella Indiana was 23.28%. The resistance rates of Salmonella Indiana from hatcheries, farms, slaughterhouses to chloramphenicol were 50%, 83.33%, 93.30%, florfenicol were 83.33%, 100%, 100%, thiamphenicol were 63%, 65%, 77% respectively. In 80 chloramphenicols resistant strains, 54 strains had detected cata1 gene, 74 strains had detected flor gene, and the 5 strains had detected cmla gene. [Conclusion] These results indicated that the resistance rates of Salmonella Indiana to chloramphenicols were different from hatcheries, farms and slaughterhouses. The cata1 gene and flor gene were widely existed in chloramphenicols resistant strains. Keywords: Salmonella Indiana, Drug susceptibility testing, Chlmphenicols, Resistance genes 沙门氏菌是一种无芽孢 无荚膜的革兰氏阴性杆菌 [1], 多数血清型的沙门氏菌对人和动物有致病性 同时, 沙门氏菌病也是鸡场中高发的细菌性疾病 [2], 对养鸡业造成极大的危害 氯霉素类药物是广谱抗生素, 特别对沙门氏菌和大肠杆菌等革兰氏阴性菌有较强的抑菌作用 因此, 氯霉素类药物在临床上广泛使用及滥用导致沙门氏菌产生耐药性 [3] 廖成水等报道致病性沙门氏菌对氯霉素耐药率高 [4] 达 76.9%, 美国 Elmadiena 等报道沙门氏菌对氯霉素的耐药率达到 98.4% 监测数据表明, 致病性沙门氏菌耐药问题已成为全球关注的热点 [5 6], 国内沙门氏菌对不同种类抗菌药物耐药率的研究比较普遍 [7], 但主要针对氯霉素类药物耐药的相关研究还较少, 本实验主要研究沙门氏菌对氯霉素类药物的耐药特征, 开展致病性沙门氏菌携带氯霉素耐药基因的检测, 从而了解耐药性的产生和传播途径 为指导兽医临床合理选择和使用氯霉素类药物, 控制耐药性的传播提供实验依据 1 材料与方法 1.1 菌株和药品从山东省部分地区 ( 临沂 烟台 泰安和邹平 地区 ) 的鸡孵化场 (120) 养殖场(120) 和屠宰场 (136) 共采集 376 个样品, 在中国山东省农科院畜牧所分离沙门氏菌, 北京农学院兽医药理研究室保存 鸡白痢沙门氏菌标准株 C79-13 大肠杆菌 ATC25922 和氯霉素 甲砜霉素 氟苯尼考标准品购自中国兽医药品监察所 ; 营养肉汤 MH 肉汤购自北京奥博星生物技术有限公司 ; 科玛嘉沙门氏菌显色培养基购自郑州博赛生物技术研究院 1.2 方法 1.2.1 菌株的分离 鉴定和血清分型 : 从中国山东省不同地区鸡孵化场 养殖场和屠宰场采集肉 [8] 鸡肠内容物样品, 菌株的分离和鉴定按照 Cui 等所述方法进行 样品在 37 C 无菌亚硒酸盐胱氨酸培养液中培养 24 h, 将培养液划线接种沙门氏菌显色培养基, 培养 24 h 后观察菌落形态特征, 紫色边缘整齐的单个菌落判定为疑似沙门氏菌 菌株纯化培养后通过 PCR 方法检测 inva 基因 [9], 阳性菌株确认为沙门氏菌 采用宁波天润 60 种沙门氏菌属诊断血清, 通过玻片凝集法对沙门氏菌进行血清型鉴定, 根据 Kauffmann- White 抗原表检索沙门氏菌血清型 鸡白痢沙门氏菌标准菌株 CVCC533 和鼠伤寒沙门氏菌标准
陆彦等 : 印第安纳沙门氏菌对氯霉素类药物耐药性分析 1227 菌株 CVCC541 为阳性对照, 生理盐水为阴性对照 1.2.2 药物敏感性试验 : 采用美国临床实验室标准委员会 (CLSI) [10 11] 推荐的微量肉汤稀释法对分离株进行 3 种氯霉素类药物 ( 氯霉素 氟苯尼考和甲砜霉素 ) 的 MIC 值测定, 每种药物做 3 个平行对照 以大肠杆菌 ATC25922 作为质控菌株, 结果判定参照 CLSI 标准 1.2.3 耐药基因的检测与序列分析 : 采用煮沸法提取细菌 DNA 模板, 参照 GenBank 中登录的耐药基因序列及相关文献 [12 13], 设计氯霉素类耐药基因引物 ( 表 1), 扩增氯霉素类耐药基因 PCR 反应体系总体积为 20 μl, 包括模板 DNA l μl, 10 nmol/l 的上下游引物各 1 μl, 双蒸水 7 μl 和 2 PCR Mix 10 μl PCR 产物使用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测, 电泳后回收纯化耐药基因的 PCR 产物, 测序后与 GenBank 中的相应耐药基因序列进行同源性分析 2 结果与分析 2.1 菌株分离鉴定从山东省部分地区鸡孵化场 养殖场 屠宰场 3 个来源 376 个样品中分离出 80 株印第安纳沙门氏菌, 分离率为 21.28% 印第安纳沙门氏菌在屠宰场中分离率最高为 22.06% (30 株 ); 养殖场中分离率为 21.67% (26 株 ); 孵化场中分离率为 20.00% (24 株 ), 见表 2 2.2 药敏试验从表 3 可以看出, 分离株对氟苯尼考的耐药率高达 95%, 对氯霉素和甲砜霉素的耐药率分别为 76.25% 和 71.25% 并且, 不同场所分离的印第安纳沙门氏菌的耐药率存在较大差异, 其中孵化场 养殖场 屠宰场中印第安纳沙门氏菌对氯霉素耐药率分别为 50.00% 83.33% 和 93.30%, 对氟苯尼考耐药率为 83.33% 100% 和 100%; 对甲砜霉素耐药率为 63% 65% 和 77%, 见图 1 抗生素种类 Antibiotic type Chloramphenicols 表 1 耐药基因 PCR 扩增引物 Table 1 Primer sequences of resistance gene of Salmonella 耐药基因 引物序列 Resistance genes Primer sequence (5 3 ) cata1 CATTCACCCGACGCACTTT TATCACTTATTCAGGCGTAGCAC cata2 GAACACTTTGCCCTTTATCGTC TCCTGCTGAAACTTTGCCATCGT cata3 TGZTGAGTTGAGAATGGCGATA GAGAGCGGCAATAACAGTCTA cmla GCGGGCTATCTTTGCGTTTC AAGTAGACTGCCGTGACCGTTCC flor TCCTGAACACGACGCCCGCTAT TCACCGCCAATGTCCCGACGAT 序列 Accession No. 大小 Size (bp) VOO622 952 X53796 482 XO7848 358 M64556 665 AJ251806 962 表 2 不同来源沙门氏菌分离率 Table 2 Percentage of Salmonella isolated from different sources 菌株来源 Source of strains (No.) 血清型 Serotype 菌株数 Isolates 分离率 Separation rate (%) Hatchery (120) Salmonella Indiana 24 20.00 Farms (120) Salmonella Indiana 26 21.67 Slaughterhouse (136) Salmonella Indiana 30 22.06
1228 微生物学通报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.7 药物 Drugs R Resistance (%) 表 3 80 株沙门氏菌对氯霉素类药物的最小抑菌浓度 Table 3 MIC of 80 Salmonella isolates to the chloramphenicols 评定标准 Assessment standards I Intermediary (%) S Sensitive (%) R Resistance (%) 实验结果 Results I Intermediary (%) S Sensitive (%) Chloromycetin 32 8 32 8 76.25 (60/80) 1.25 (1/80) 1.25 (1/80) Florfenicol 16 4 16 4 95.00 (76/80) 0 5.00 (4/80) Thiamphenicol 32 8 32 8 71.25 (57/80) 23.75 (19/80) 5.00 (4/80) Fig. 1 图 1 不同来源印第安纳沙门氏菌对氯霉素类药物的耐药率 The resistance rates of Salmonella Indiana to chloramphenicols from different places 2.3 耐药基因的检测在 80 株氯霉素类药物耐药的菌株中, 有 54 株扩增出约 950 bp 的片段, 经过测序分析与 cata1 基因同源性为 100%, 阳性率为 67.5%; 有 74 株扩增出约 960 bp 的片段, 经测序和同源性分析后为 flor 基因, 阳性率为 92.5%; 5 株扩增出约 660 bp 的片段, 经测序和同源性分析后为 cmla 基因, 阳性率为 6.25%; 没有检测到 cata2 cata3 基因, 见表 4 3 讨论 本实验从山东省不同地区鸡孵化场 养殖场 和屠宰场分离出 80 株印第安纳沙门氏菌, 菌株 来源于不同日龄的肉鸡, 具有多样性和代表性 每份样品分离一株沙门氏菌, 避免了相同克隆菌 株的干扰, 能够更全面的代表不同来源沙门氏菌 流行情况 本次分离出 150 株沙门氏菌, 总分离 [14] 率为 39.89%, 比薛俊龙等在山西省鸡沙门氏 药物 Drugs Table 4 耐药菌株数 Number of resistant strains 表 4 耐药菌株中耐药基因的阳性率 Positive rate of resistance genes in resistant strains 耐药基因 Resistance genes 阳性菌株数 No. of positive strains 阳性率 Positive rate (%) cata1 54 67.50 Chloramphenicols 80 flor 74 92.50 cmla 5 6.25
陆彦等 : 印第安纳沙门氏菌对氯霉素类药物耐药性分析 1229 菌病流行病学调查中分离率 53.33% 略低 印第安 纳沙门氏菌分离出 80 株, 分离率为 21.28%, 比吴 [15] 云凤等报道的分离率要高, 说明印第安纳沙门 氏菌在山东省不同地区养鸡业中流行 实验结果显示, 从孵化场 养殖场和屠宰场 分离出的印第安纳沙门氏菌对氟苯尼考 甲砜霉素的耐药率依次升高, 说明随着鸡日龄和接触药物的增加, 耐药率依次上升 但对氯霉素的耐药率养殖场最高达到 93.33%, 原因是在饲养期间为了预防家禽疾病而大量使用了氯霉素 印第安纳沙门氏菌对氯霉素 氟苯尼考 甲砜霉素的耐药 [16] 率分别为 76.25% 95% 71.25%, 比马孟根等检测 30 株沙门氏菌对氨基糖苷类 氯霉素类 四环素类进行耐药性试验中, 氯霉素类中沙门氏菌对氯霉素 氟苯尼考 甲砜霉素的耐药率为 56% 20% 33.3% 的结果要高, 其原因可能与不同地区的用药情况有密切关系, 提示抗菌药物的合理使用至关重要 一般细菌对抗生素的耐药机制主要是由耐药基因直接编码蛋白或基因作用位点发生突变 [17], 而沙门氏菌对氯霉素类药物产生耐药性的机制有两种 : 一是通过 cat 基因调控合成乙酰化转移酶使氯霉素和甲砜霉素转化为无抗菌活性的代谢产物 ; 另一种机制与细菌的主动外排作用有关, 包括 cmla 和 flor 基因 我国对致病性沙门氏菌中氨基糖苷类 四环素类 磺胺类和氯霉素类耐药基因的 PCR 检测研究已有报道 [18 19], 本研究中, 耐药基因 flor 的检出率较高为 92.5%, cata1 基因检出率为 67.5%, 基因 cmla 检出率较低为 6.25%, 而 cata2 cata3 基因没有检出, 廖 [3] 成水等检测了 98 株沙门氏菌对氯霉素的耐药基因, 其中 7 株检测到 cata1, 检出率为 7.14%, 明显与本实验的结果不同, 这表明场所不同, 分离出的菌株可能不同, 使得耐药基因的流行和分布情况也不尽相同 在耐药基因的检测中发现有少数 没有检测到耐药基因 cata2 cata3 的菌株也有耐药性, 虽然部分菌株表现出耐药, 但未能检测到相应的耐药基因, 这可能是因为该菌株含有其他耐药基因或存在其他耐药机制 [20], 需进一步研究 4 结论 细菌耐药问题已经成为一个世界性的难题, 研究山东省印第安纳沙门氏菌的耐药特征及导致耐药产生的相关基因, 有助于从食物链的源头采取合理的干预措施, 对养殖业的合理用药提供参考, 有利于减少和防止沙门氏菌对氯霉素类药物耐药性的产生, 保障食品安全 同时, 也对进一步了解印第安纳沙门氏菌的耐药机理和有效控制日趋严重的沙门氏菌耐药提供理论依据 参考文献 [1] 张程程, 赵玉林, 周琼, 等. 鸡源致病性沙门氏菌的分离鉴定及耐药性分析 [J]. 中国兽医杂志, 2012, 46(5): 11 13. [2] 黄嫱, 刘卫国, 马飞, 等. 沙门氏菌病的防控 [J]. 畜牧与饲料学, 2010, 31(11): 163 165. [3] 廖成水, 程相朝, 张春杰, 等. 鸡源致病性沙门氏菌新近分离株的耐药性与耐药基因 [J]. 中国兽医科学, 2011, 41(07): 751 755. [4] Elamadiena MM, EI Hussein AA, Muckle CA, et al. Antimicrobial susceptibility and mutli-drug resistance of Salmonella enterica subspecies enterica serovars in Sudan[J]. Tropical Animal Health and Production, 2013, 45(5): 1113 1118. [5] 朱力军. 动物大肠杆菌的耐药变化趋势 [J]. 中国兽药杂志, 2001, 35(2): 16 18. [6] 周贵民, 张军民. 我国细菌耐药性监测应注意的几个问题 [J]. 中华检验医学杂志, 2004, 27(10): 5 6. [7] 杨保伟, 盛敏, 孟江洪, 等. 食源性沙门氏菌耐
1230 微生物学通报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.7 药性检测及相关质粒 [J]. 微生物学报, 2008, 48(8): 1006 1012. [8] Cui S, Zheng J, Meng J. An improved method for rapid isolation of Salmonella from chicken carcasses[j]. Journal of Food Safety, 2006, 26(1): 49 61. [9] Wang MY, Xu MH, Pan HW, et al. Establishment and preliminary application of LAMP inva gene assay for rapid detection of Salmonella[J]. Chinese Journal of Health Laboratory Technology, 2008, 18: 23 26. [10] CLSI M100-S17, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing: Seventeenth Informational Supplement[S]. USA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2007. [11] CLSI M31-A3, Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals; Approved Standard-Third Edition[S]. USA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2008. [12] Chen S, Zhao S, White DG, et al. Characterization of multiple-antimicrobial resistant Salmonella serovars isolated from retail meats[j]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(1): 1 7. [13] Yan L, Cong MW, Guo JW, et al. Prevalence of antimicrobial resistance among Salmonella isolates from chicken in China[J]. Food Borne Pathogens and Disease, 2011, 8(1): 45 53. [14] 薛俊龙, 田林君, 张国权, 等. 山西省鸡沙门氏菌病流行病学调查分析 [J]. 山西农业科学, 2010, 38(9): 58 62. [15] 吴云凤, 袁宝君, 乔昕, 等. 肉鸡胴体中沙门氏菌的分离鉴定及多重耐药谱研究 [J]. 南京医科大学学报, 2012, 32(1): 125 128. [16] 马孟根, 王红宁, 余勇, 等. 猪源致病性沙门氏菌耐药基因的分析 [J]. 畜牧兽医学报, 2006, 37(1): 65 70. [17] 魏秀丽, 陈杖榴. 沙门氏菌耐药株 gyra 基因和 parc 基因突变特征分析 [J]. 中国兽医杂志, 2006, 42(9): 6 8. [18] 王新, 郝宏删, 孟江红, 等. 鸡肉源沙门氏菌对喹诺酮和氟喹诺酮类抗生素耐药状及相关基因 [J]. 微生物学报, 2011, 51(10): 1413 1420. [19] 潘志明, 焦新安, 刘文博, 等. 鸡白痢沙门氏的耐药性检测研究 [J]. 畜牧兽医学报, 2002, 33(4): 377 383. [20] 邓树轩, 程安春. 沙门氏菌耐药机制研究进展 [J]. 安徽农业科学, 2007, 35(23): 7205 7207.