标题

江苏农业学报 (Jiangsu J. of Agr. Sci. ),014,30(1):135 ~ 139 h ttp: / / www. jsn y x b. com 135 刘龙腾, 贾春旸, 努尔力 阿不力孜, 等. 利用微卫星标记对绵羊进行亲子鉴定 [J]. 江苏农业学报,014,30(1):135 鄄 139. doi:10. 3969 / j. issn. 1000 鄄 4440. 014. 01. 03 利用微卫星标记对绵羊进行亲子鉴定 刘龙腾, 摇贾春旸, 摇努尔力 阿不力孜, 摇张文祥, 摇赵宗胜 ( 石河子大学动物科技学院, 新疆石河子 83003) 摇摇摘要 : 摇采用微卫星 DNA 分子标记方法, 通过对 13 只父系半同胞中国美利奴羊在 BM461 BM143 Oar 鄄 HH55 OarJMP8 BM6438 BM6506 BM184 OarDB6 ILSTS004 9 个微卫星位点的分析, 计算出了中国美利奴羊在这 9 个位点的等位基因频率及其分布规律, 并对其中 7 组亲子进行了亲子鉴定 结果表明, 这 9 个微卫星位点均表现为高度或中度多态性 ;9 个微卫星位点在选择的 7 组亲子中, 获得了 0. 999 8 ~ 的父权概率, 说明这 9 个微卫星位点即使在亲缘关系较近的群体中进行亲子鉴定也是可行的 关键词 : 摇 STR 基因座 ; 分子标记 ; 绵羊 ; 亲子鉴定中图分类号 : 摇 S86. 8 + 6 摇摇摇文献标识码 : 摇 A 摇摇摇文章编号 : 摇 1000 鄄 4440(014)01 鄄 0135 鄄 05 Microsatellite DNA markers for paternity test of sheep LIU Long 鄄 teng, 摇 JIA Chun 鄄 yang, 摇 NUERLI Abulizi, 摇 ZHANG Wen 鄄 xiang, 摇 ZHAO Zong 鄄 sheng ( College of Animal Science and Technology,Shihezi University, Shihezi 83003,China) 摇摇 Abstract: 摇 In the study, 9 STR loci ( BM461, BM143, OarHH55, OARJMP8, BM6438, BM6506, BM184 OarDB6, ILSTS004) of 13 paternal half 鄄 sib Chinese merino sheep were analyzed by microsatellite markers, and the distri 鄄 bution law and allele frequencies on those loci were calculated. Then paternity was identified for 7 parent 鄄 child groups of the 13 Chinese merino sheep. The results showed that the 9 microsatellite loci were characterized by high or moderate pol 鄄 ymorphism, and 9 microsatellite loci in the seven groups selected in paternity test revealed the patriarchal probabilities of 99. 98% -99 郾 99%, suggesting that it is feasible to apply microsatellite marker in paternity identification of the groups which have close genetic relationships. Key words: 摇 STR loci; molecular marker; sheep; paternity identification 摇摇在现代动物育种中, 由于要利用各种亲属的表型信息, 准确的系谱记录十分重要, 然而在有些情况下, 不能准确地确认某些个体的父本, 不能准确地判断个体的亲缘关系, 从而影响绵羊育种工作的顺利 收稿日期 :013 鄄 08 鄄 09 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (31160444) 作者简介 : 刘龙腾 (1988 鄄 ), 男, 河南省辉县人, 硕士研究生, 主要从事动物遗传育种与繁殖研究 (E 鄄 mail) llt073590@ 163. com 通讯作者 : 赵宗胜, ( Tel) 13565735767; ( E 鄄 mail) zhaozongsh @ shzu. edu. cn 开展 因此对家畜特别是种公畜的系谱确证就显得 更为重要 用微卫星 DNA 进行亲子鉴定是一新兴的生物 技术, 在国内外多种家畜和动物上做过试验并取得 [1] 较好的结果 Glowatek 鄄 Mullis 等用分属不同染色 体的多态微卫星位点成功解决了以前用血型无法解 [] 决的 35 头牛的血缘控制问题 Fredholm 等用 6 ~ 9 个分属不同染色体的多态微卫星位点鉴定了来源 于 1 个品种狗的血缘, 此外还利用微卫星位点对一 个有争议的母本进行了确认 ( 概率 99 郾 99% ) Hy 鄄

136 江苏农业学报摇 014 年第 30 卷第 1 期 [3] gen 等对用微卫星位点进行血缘鉴定进行了评 估, 使用分属 7 条染色体的 条微卫星在牛群中分 种情况计算排除概率, 在被怀疑个体基因型未知 时排除概率大于 0. 998 6, 被怀疑者基因型已知时 [4] 排除概率大于 Luikart 等用分属 16 条 染色体上 个微卫星位点对山羊进行亲子鉴定, 结 果表明在开士米山羊 安哥拉山羊和萨能山羊中排 除概率分别为 : 大于 99 大于 9 大于, 同时证明两个个体完全相同的概率为 1 伊 10-15 本试验采用微卫星 DNA 分子标记的方法, 利用 BM461 BM143 OarHH55 OarJMP8 BM6438 BM6506 BM184 OarDB6 ILSTS004 9 个微卫星位 点, 对 13 只中国美利奴羊中的 7 组亲子进行亲子 鉴定 1 摇材料与方法 [5] 1. 1 摇试验血样制备及基因组 DNA 的提取血液样本取自新疆紫泥泉种羊场的 13 只中国 美利奴羊 ( 新疆军垦型 ), 其中包括 7 个不同的亲子 关系清楚的个体及其父母本 祖代及后代羊都饲养 于该场, 饲养管理稳定, 无疾病史 绵羊颈静脉采血 [6] 约 6 ml, 参照刘云芳等的方法提取绵羊基因组 DNA 1. 摇微卫星位点引物合成及 PCR 扩增 选取的 9 个微卫星引物均由上海生物工程公司 合成, 其碱基序列及退火温度见表 1 PCR 扩增反 应体系 :10 伊 Buffer 郾 5 滋 l,5 mmol / L MgCl 1 郾 5 滋 l, 郾 5 mmol / L dntps 郾 5 滋 l, 上下游引物各 3 郾 0 滋 l (5 pmol / 滋 l),taqe(0 郾 5 U / 滋 l) 4 郾 0 滋 l, 模板 DNA (50 ng) 郾 0 滋 l, 总体积 5 郾 0 滋 l PCR 扩增条件为 :95 益预变性 min;94 益变性 30 s, 在适宜的温度退火 30 s,7 益延伸 45 s, 共 35 个循环, 最后 7 益延伸 10 min 1. 3 摇扩增产物的电泳检测 5 滋 l PCR 产物中加 3 ~ 5 滋 l 溴酚蓝指示剂, 混 匀后加 10 滋 l 在聚丙烯酰胺凝胶 ( 浓度为 10% ) 中 电泳, 稳压 150 ~ 180 V, 电泳 6 ~ 8 h 电泳结束后进 行固定 染色 显影过程, 凝胶成像系统拍照 采用银染的方法, 染色及显影的过程如下 : 将凝 胶放入固定液中预处理 10 min, 然后将凝胶放入染 色液中染色 5 min, 取出后用蒸馏水漂洗 15 ~ 0 s, 置于显影液中, 约 8 ~ 10 min 出现条带后, 取出凝胶 用自来水快速漂洗 次, 放入固定液终止 10 min, 观 察结果并拍照 [7] 表 1 摇 9 个微卫星标记的引物序列及退火温度 Table 1 摇 Primer sequences of nine microsatellite markers and refer 鄄 ence annealing temperatures 引物摇摇摇摇摇摇摇序列 退火温度 ( 益 ) BM461 5 忆鄄 CAAATTGACTTATCCTTGGCTG 鄄 3 忆 51. 0 5 忆鄄 TGTAACATATGGGCTGCATC 鄄 3 忆 BM143 5 忆鄄 ACCTGGGAAGCCTCCATATC 鄄 3 忆 68. 0 5 忆鄄 CTGCAGGCAGATTCTTTATCG 鄄 3 忆 OarHH55 5 忆鄄 GTTATTCCATATTCTTTCCTCCATCATAAGC 鄄 3 忆 66. 5 5 忆鄄 CCACACAGAGCAACTAAAACCCAGC 鄄 3 忆 OarJMP8 5 忆鄄 CGGGATGATCTTCTGTCCAAATATGC 鄄 3 忆 67. 0 5 忆鄄 CATTTGCTTTGGCTTCAGAACCAGAG 鄄 3 忆 BM6438 5 忆鄄 TTGAGCACAGACACAGACTGG 鄄 3 忆 58. 0 5 忆鄄 ACTGAAT GCCTCCTTTGTGC 鄄 3 忆 BM6506 5 忆鄄 GCACGTGGTAAAGAGATGGCA 鄄 3 忆 50. 0 5 忆鄄 GCAACTT GAGCATGGCAC 鄄 3 忆 BM184 5 忆鄄 GAGCAAGGTGTTTTTCCAATC 鄄 3 忆 47. 0 5 忆鄄 CATTCTCCAACTGCTTCCTTG 鄄 3 忆 ILSTS004 5 忆鄄 CTTAAAATCTGTCTTTCTTCC 鄄 3 忆 54. 0 5 忆鄄 TAGTGTGTATTAGGTTTCTCC 鄄 3 忆 OarDB6 5 忆鄄 GACATGACTAAAGCAATTTAGCATGC 鄄 3 忆 57. 5 5 忆鄄 TGGACTACAGTCCATAGCGTCTC 鄄 3 忆 1. 4 摇数据处理及统计方法 1. 4. 1 摇基因频率及基因型频率摇基因频率是指群 体内某一基因座上特定等位基因占该基因座等位基 因总数的比率 ( P i ), 即为等位基因频率, 是群体遗 传特征的基本要素 P i = [( ii) +( ij 1 ) +( ij ) + + (ij n )] / N, 其中,P i 为某一位点上第 i 个等位基因 的频率,i 为该位点上的第 i 个等位基因,j 1 j j n 为与 i 共显性的第 1 到第 n 个等位基因 ;N 为该位 点上的等位基因数 基因型频率是指一个群体内某 特定基因型所占的比例, 它是描述群体遗传结构的 重要参数 由于微卫星扩增结果为共显性等位基 因, 因此, 表型频率即为基因型频率, 基因型频率 = 基因型个体数 / 测定群体总数 1. 4. 摇 Handy 鄄 Weinberg 平衡的字适合性试验摇 Handy 鄄 Weinberg 平衡状态的检验采用字适合性检

刘龙腾等 : 利用微卫星标记对绵羊进行亲子鉴定 137 验进行 首先根据基因频率计算各种基因型频率的 理论值, 然后计算字值 字 = 移 ( E-O) / E,E 为理 论值,O 为实际观察值 [8 鄄 9] 1. 4. 3 摇父权概率计算摇 根据所检测的表型, 分 别列出母本 子一代及假设父本的各种可能的基因 型 根据母子组合, 确定来自母本的基因 ( 母本基 因 ) 和必定来自子一代父本的基因 ( 父本基因 ) 计 算嫌疑父本成为子一代父本的概率 :X = f 伊 c, 式中 f 为母本提供母本基因的概率 ( 当只有一种母本基因 时, 该基因 100% 遗传给子代, 故此时母本基因概率 为 1),c 为嫌疑父本提供父本基因的概率 计算种 群中随机个体成为子一代父本的概率 :Y = f 伊 g, 式中 f 为母本提供母本基因的概率,g 为种群中该父本的基因频率 计算父权指数 ( PI),PI = X / Y 再计算父权的相对机会 RCP(Relative Chance of Paternity) 值和累积 RCP, RCP = PI / ( PI + 1), 累积 RCP = 1 - (1-RCP 1 )(1-RCP ) (1-RCP n ) 摇结果与分析. 1 摇等位基因频率分布由表 可知,9 个微卫星位点共检测到 56 个等位基因, 平均每个位点 6. 个 OarHH55 位点等位基因最多, 共检测到 8 个 ;BM6506 BM6438 BM184 3 个位点都只检测到 5 个等位基因 表 摇 绵羊 9 个微卫星位点基因频率分布 Table 摇 Allele frequencies of 9 STR loci in sheep 基因位点 等位基因 (bp) 频率 基因位点 等位基因 (bp) 频率 基因位点 等位基因 (bp) 频率 BM461 161 0. 081 8 BM143 147 0. 015 6 OarJMP8 144 0. 08 8 158 0. 09 1 145 0. 117 14 0. 103 6 15 0. 19 5 143 0. 1 4 140 0. 144 0 149 0. 106 8 139 0. 47 4 136 0. 0 7 146 0. 15 0 137 0. 067 7 134 0. 51 4 140 0. 077 3 135 0. 330 7 130 0. 51 4 137 0. 70 5 OarDB6 0 0. 088 4 ILSTS004 19 0. 089 7 OarHH55 01 0. 09 198 0. 33 6 188 0. 4 199 0. 058 4 195 0. 14 9 184 0. 148 0 197 0. 331 19 0. 106 6 180 0. 103 1 193 0. 363 6 189 0. 077 1 178 0. 069 5 189 0. 006 5 183 0. 093 0 174 0. 094 187 0. 019 5 180 0. 58 5 17 0. 53 4 185 0. 17 1 BM6438 139 0. 01 1 BM184 147 0. 019 4 181 0. 019 5 135 0. 15 0 145 0. 135 7 BM6506 17 0. 01 0 17 0. 383 1 141 0. 376 0 15 0. 17 5 13 0. 36 9 139 0. 364 3 13 0. 446 119 0. 169 0 135 0. 104 7 119 0. 36 5 115 0. 051 8. 摇 9 个 STR 基因位点的基因分型从表 3 可以看出 : 在对 7 组父母本与子代的亲子鉴定中, 第 1 组的累积 RCP 值为 0. 999 8, 第 组的累积 RCP 值为, 第 3 组的累积 RCP 值为, 第 4 组的累积 RCP 值为 0. 999 8, 第 5 组的 累积 RCP 值为, 第 6 组的累积 RCP 值为, 第 7 组的累积 RCP 值为 这 7 组累积父权概率都已达到很高的鉴别水平, 说明本试验所用的 9 个微卫星位点都可用做鉴定绵羊亲子关系的微卫星标记位点

138 江苏农业学报摇 014 年第 30 卷第 1 期 表 3 摇 9 个微卫星位点 PI 值及 RCP 值 Table 3 摇 PI and RCP values of 9 STR loci 组别摇摇摇摇摇摇父权指数 (PI) 摇摇摇摇摇父权的相对机会 (RCP) 累计 RCP 1 3. 861 0,1. 371 4,1. 866 7,4. 86 3,0. 618 3,1. 377 8, 1. 350 8,1. 81 4,1. 469 7 0. 794 3,0. 578 3,0. 651,0. 88 4,0. 38 1,0. 579 4, 0. 574 6,0. 561 7,0. 595 1 0. 999 8 3. 861 0,1. 066 6,1. 375 1,3. 47,0. 871 5,4. 000 0, 1. 000 0,. 064 4,3. 499 0 0. 794 3,0. 516 1,0. 579 0,0. 776 4,0. 465 7,0. 800 0, 0. 500 0,0. 673 7,0. 777 7 3 3. 861 0,. 58 4,0. 933 4,1. 371 0,0. 871 5,1. 340 5, 1. 37 5,3. 378 4,3. 499 0 0. 794 3,0. 693 1,0. 48 8,0. 578,0. 465 7,0. 57 7, 0. 578 5,0. 771 6,0. 777 7 4 3. 861 0,. 133 1,0. 933 4,1. 371 0,0. 871 5,1. 04 8, 1. 000 0,. 56 8,. 656 0 0. 794 3,0. 680 8,0. 48 8,0. 578,0. 465 7,0. 506 1, 0. 500 0,0. 719 3,0. 76 5 0. 999 8 5. 391,. 133 1,1. 439 3,3. 47,0. 618 3,1. 340 5, 1. 37 5,7. 194,. 656 0 0. 705 1,0. 680 8,0. 590 0,0. 776 4,0. 38 1,0. 57 7, 0. 578 5,0. 878 0,0. 76 5 6 1. 496 6,. 58 4,0. 08 5,4. 86 3,1. 004 0,1. 305 1, 1. 39 9,1. 448 0,5. 376 3 0. 599 5,0. 693 1,0. 418 5,0. 88 4,0. 501 0,0. 566, 0. 570 8,0. 591 5,0. 843 7. 391,. 58 4,0. 719 6,3. 47,1. 36 6,1. 305 1, 1. 350 8,3. 378 4,1. 934 0. 705 1,0. 693 1,0. 418 5,0. 776 4,0. 55 9,0. 566, 0. 574 6,0. 771 6,0. 659 3 摇讨论 亲子鉴定又称亲权鉴定, SSR 分子标记技 [10 鄄 11] 术是目前国内外进行亲子鉴定的新技术之一 [1] 贾名威等在奶牛和肉牛中分别择选了 6 个微卫 星座位, 累积个体鉴别力和累积非父排除能力都很 [10] 高 Ellegren 等组合 5 个微卫星位点 ( 每个位点 至少有 6 个等位基因 ) 排除率达 98% 以上, 使用 10 [13] 个微卫星位点可使排除率达 99 郾 99% 贾斌等利 用 10 个微卫星座位对新疆 8 个绵羊品种进行遗传 多样性分析, 结果表明 8 个高度多态性的座位可用 [14] 于遗传多样性分析 Araujo 等用 11 个微卫星标 记对巴西山羊进行亲权鉴定研究, 结果表明, 当已知 一方亲本时的累计父权排除率为 0. 999 59 张志 [15] 和等在大熊猫的亲子鉴定中, 父权排除率达到了 [16] 1 李洁等择选 13 个微卫星标记对甘 肃高山细毛羊进行亲子鉴定, 累计父权排除概率为 4,11 个高度多态的座位使累计父权排除率 [17] 达到 0. 999 85 周磊等利用微卫星技术研究亲 子鉴定, 证明了微卫星座位的多态性决定了父权排 [18] 除率的大小 钱林东等使用微卫星标记分析发 现, 一般检测的遗传座位多少与鉴定概率成正比, 相 同的微卫星位点在群体中的等位基因数与正确鉴定 结果的概率也成正比 本研究采用微卫星 DNA 分 子标记技术分析计算了 13 只中国美利奴羊在 9 个 微卫星位点的等位基因频率及其分布规律,9 个微 卫星位点均表现为高度或中度多态性 ; 对其中 7 组 父系半同胞亲子进行了亲子鉴定, 获得了 0. 999 8 ~ 的父权概率, 说明这 9 个微卫星位点在亲缘关系较近的群体中做亲子鉴定是可行的, 这为绵羊亲子鉴定试剂盒的研制奠定了基础 用微卫星 DNA 或 DNA 测序进行亲子鉴定技术精确度较高, 发展较快, 但由于成本问题在家畜中较难开展和推广 随着分子生物学的发展和测序成本的降低, 基于分子生物学的亲子鉴定技术必将在家畜中得到广泛的应用 所以筛选用于亲子鉴定的可靠 合适的微卫星位点代替血型 DNA 指纹等传统方法进行血缘鉴定和血缘控制在家畜中的应用潜力很大 参考文献 : [1] 摇 GLOWATZKI 鄄 MULLIS M L, GAILLARD C, WIGGER G, et al. Microsatellite 鄄 based parentage control in cattle [ J]. Anim Genet, 1995,6(1):7 鄄 1. [] 摇 FREDHOLM M, WINTERO A K. Efficient resolution of parentage in dogs by amplification of microsatellites[ J]. Anim Genet, 1996, 7(1):19 鄄 3. [3] 摇 HEYEN D W, BEEVER J E. Exclusion probabilities of bo 鄄 vine microsatellite markers in fluorescent multiplexes for semiauto 鄄 mated parentage testing[j]. Animal Genetics,1997,8:1 鄄 7. [4] 摇 LUIKART G, BIJU D M P, ERTUGRUL O,et al. Power of mi 鄄 crosatellite markers in flurescent multiplexes for parentage testing in goats[j]. Animal Genetics,1999,30:431 鄄 438. [5] 摇萨姆布鲁克丁, 弗时奇 E F, 曼尼阿蒂斯 T. 分子克隆试验指南 [M]. 版. 金冬雁, 译. 北京 : 科学出版社,1998:456 鄄 467. [6] 摇刘云芳, 高剑峰, 潘晓亮, 等. 绵羊全血中 DNA 的微量提纯

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