蝴蝶蘭花香研究及香氛產品開發 楊雅萍 1 蕭郁芸 1 2 陳虹樺 1 國立成功大學蘭花研究中心 2 國立成功大學生命科學系 摘要 蝴蝶蘭是台灣最重要的觀賞花卉出口, 並且是政府著重發展成為一個指標性農業產業, 目前為全世界蝴蝶蘭種苗與植株外銷最多之國家 許多栽培者希望能孕育具有香味的蝴蝶蘭新品種進而提升蝴蝶蘭的經濟價值 然而有些蘭花品種具有雜交不親和性 (incompatibility ) 及基因劑量效應 (dosage effect) 影響, 使得雜交育種的性狀改良受到侷限 因此我們選擇香花大葉蝴蝶蘭, 此花經常作為香味育種之親本, 分析其香味成份及合成代謝路徑之相關酵素, 我們分離與鑑別一個香味合成之關鍵酵素基因 -Geranyl diphosphate synthase (GDPS) 此外, 我們開發了活體精萃大葉蝴蝶蘭花香精油之技術, 建立蝴蝶蘭芳香精油萃取技術平台及蘭花芳香物之副產品, 並於 2009 年底成立 蘭花研究中心, 將研發成果產業化與進行推廣活動 2013 年在國科會支持下成立了 蘭花生技產學聯盟, 結合跨校跨領域五個平台, 以服務蘭花一級 二級和三級產業 另外, 結合政府產學合作政策及振興經濟方案, 輔導成立 蘭卉生物科技股份有限公司 以推廣蘭花香氛產品 關鍵字 : 大葉蝴蝶蘭 香葉草醇 芳香醇 香氛系列產品 蘭花研究中心 83
一 前言 台灣已於近年加入世界貿易組織, 雖然加速了整體的貿易交流速度, 但卻對部分傳統產業卻造成了莫大的衝擊, 尤其在傳統農業方面, 在人力成本和耕種面積皆無法和大量輸出國家競爭的情況下, 朝向精緻農業之轉型便成為傳統農業突破障礙的一個絕佳契機 台灣自 80 年代起, 花卉產業成長極速, 蘭花種植面積約 739 公頃, 其中蝴蝶蘭約 220 公頃,2012 年蘭花產業外銷值 16,564 萬美元, 占花卉外銷總值 85%, 較 2011 年成長 16.4%, 足證蘭花已是非常重要的精緻農業 ; 其中尤以蝴蝶蘭 (Phalaenopsis) 成果顯著, 占 68.9%, 蝴蝶蘭由於其獨特且豐富之形態與色彩, 美觀大方, 且台灣具有豐富之種植栽培經驗, 在市場與品質掌握上, 具有世界級的優勢, 十幾年來, 隨著生產技術的不斷提昇, 不僅使蝴蝶蘭產業在國內市場紮根, 同時也成功進軍國際市場, 目前為全世界蝴蝶蘭種苗與植株外銷最多之國家 許多植物花朵散發各種氣味主要作為吸引授粉者及防禦草食性生物 蘭科是單子葉植物中數量最大科之一並且經常以不同花香吸引各種物種專一性之授粉者協助傳粉孕育下一代 (van der Pijl and Dodson, 1969) 由於蝴蝶蘭花型優美 花序排列整齊且花期長, 是極具觀賞價值的花卉, 而在切花及盆栽市場中深受歡迎, 因此許多栽培者希望能孕育具有香味的蝴蝶蘭新品種進而提升蝴蝶蘭的經濟價值 台灣進行蝴蝶蘭的品種改良時間已久, 期間由世界各地引進大量親本交配育種, 累積了無數不少的種原 ; 加上組織培養與無菌播種技術進步, 使台灣蝴蝶蘭的發展前景樂觀 (Chen and Wang, 1996) 台灣做為蝴蝶蘭之主要出口國, 致力於培育新品種, 然而一般蘭花生育期甚長, 以蝴蝶蘭為例, 由交配至開花至少須兩年以上時間, 且育種方式繁瑣, 若要利用傳統雜交育種的方式將重要經濟性狀導入品種, 往往需要數代雜交育種, 耗費相當長的時間與金錢, 加上有些品種的蘭花具有雜交不親和性 (incompatibility ) 及基因劑量效應 (dosage effect) 影響, 使得雜交育種的性狀改良受到侷限 雖然藉著傳統的雜交方式培育出許多優良品種, 然而, 如抗病 花色 香味育種等工作, 一直無法經由雜交育種獲得能滿足蘭花產業的品種 近年來植物基因轉殖技術的快速發展, 藉由直接或間接的方式可將單一, 甚至多個有用基因導入不同植物體, 並嵌入植物基因組中遺傳至後代 此舉不但突破雜交育種的限制, 更可減少傳統育種繁重的選種工作, 為作物育種提供了一條新的有效途徑 過去本實驗室針對大葉蝴蝶蘭香味分子代謝路徑之學術研究結果並將其應用到蝴蝶蘭產業在下游應用至產業方面, 已初步開發蝴蝶蘭芳香精油萃取技術及蘭花芳香物之副產品 根據上述之研究成果, 選擇特定香味之蝴蝶蘭進行大量芳香精油萃取技術開發, 並協助開發各式蘭花香水 保養品等 最後為能有效將此產出推廣到業界, 希望能藉由成功大學創意產業設計研究所建立蝴蝶蘭香味技術品牌之印象與形象, 希望能夠將這些研發成果加以商品化, 並透過系統性規劃, 有效的進行香味定型 產品定位 形象塑造及行銷策略規劃等工作 84
二 蝴蝶蘭花香研究 蘭科植物的分布範圍廣大, 是顯花殖物中最大的一科 香味大葉蝴蝶蘭產地來自馬來西亞 原為 Phal. violacea 的 borneo Type ( 婆羅洲型 ), 現已視為一獨立品種, 而 bellina 是拉丁文 bellus (beautiful) 美麗的意思 開花時期花朵會釋放甜美香味 因此, 經常作為香味育種之親本來源 先前的研究, 我們利用氣相色譜 - 質譜法 (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) 鑑定大葉蝴蝶蘭 (Phal. bellina) ( 圖一 ) 之主要花香成份為單萜類的香葉草醇 (geraniol) 芳香醇 (linalool) 和它們的衍生物 ( 表一 ), 其花香釋放量最高為開花第五天 ( 圖二 ) 我們並且結合化學分析 基因體學和生物資訊學, 建構香味合成路徑及相關的基因 (Hsiao et al., 2006) 萜類為一大群的植物二次代謝物且對於植物生長和發育扮演重要的角色 所有萜烯類化合物 (Terpenoids) 是以五個碳之異戊二烯 (Isoprene) 為構成單元, 萜烯類化合物是經由一群短鏈之異戊二烯轉移酶 (trans-prenyltransferase) 家族催化形成, 包含 geranyl diphosphate synthase (GDPS) 法呢基焦磷酸合成酶 (farnesyl diphosphate synthase, FDPS) 和四異戊二烯焦磷酸合成酶 (geranylgeranyl diphosphate synthase, GGDPS) 分別地合成 geranyl diphosphate (GDP, C 10 ) farnesyl diphosphate(fdp, C 15 ) 和 geranylgeranyl diphosphate (GGDP, C 20 ) 並作為單萜類 (Monoteprnes) 倍半萜類 (Sesquiterpenes) 和二萜類 (Diterpenes) 之前驅物 在空間和時間上的基因表現分析顯示 PbGDPS 專一性表現在花部組織, 並且於大葉蝴蝶蘭開花第五天有最大表現量 ( 圖三 ) 我們認為 PbGDPS 在蘭花香味成份生合成及香味釋放扮演重要的角色 因此, 我們進一步分析具有大葉蝴蝶蘭血統之後代的香味成份及 PbGDPS 轉錄子表現 結果顯示具香味的 Dtps. Kenneth Schubert five (Doritaenopsis pulcherrima Phal. bellina) 偵測到香葉草醇和芳香醇並且有 PbGDPS 轉錄子表現, 然而在不具香味大葉蝴蝶蘭血統之後代 Dtps. Kenneth Schubert (Doritaenopsis pulcherrima Phal. bellina) 並無散發香葉草醇和芳香醇且亦無 PbGDPS 轉錄子之表現 另外, 我們也分析兩種 Phal. equestris 品種, 具有香味的 Phal. equestris W-72 品種之成份分析無單萜類化合物, 結果顯示這兩個品種並無 PbGDPS 轉錄子表現 這些結果表示 PbGDPS 表現量與單萜類中的香葉草醇和芳香醇多寡有相似的表現趨勢 ( 圖四 ) 因此, 我們認為 PbGDPS 在大葉蝴蝶蘭的香味產生扮演一個關鍵角色 (Hsiao et al., 2008) 85
釋放量 (ng/ 花 / 時 ) 花發育時期 ( 天 ) 圖二 來自大葉蝴蝶蘭開花當天 (Dd) 至開花第 14 天 (D+14) 芳香醇 (Linalool) 和香葉草醇 (trans-geraniol) 之釋放量 Fig. 2. Quantification of linalool and geraniol emitted from flowering day (Dd) to day 14 post-anthesis (D + 14) of Phal. bellina. PbGDPS 基因表現量 花發育時期 ( 天 ) 圖三 大葉蝴蝶蘭花發育時期之 PbGDPS 基因表現 Fig. 3. PbGDPS expression of Phal. bellina floral developmental stages. 86
表一 大葉蝴蝶蘭花部揮發性化合物之主要分類 Table 1. Major classes of volatile compounds by Phal. bellina 大葉蝴蝶蘭 (Phal. bellina) 化合物名稱 釋放量 (ng/ 花 / 小時 ) 單萜類 (monoterpenes) 382.8 芳香醇 (Linalool) 105.4±15.3 芳香醇衍生物 (Linalool derivatives) 39.6±20.0 香葉草醇 (Geraniol) 163.4±1.6 香葉草醇衍生物 (Geraniol derivatives) 34.5±5.4 苯基丙烷 (phenylpranoids) 38.6±17.1 苯類 (benzenoids) 40.2±20.8 脂肪酸衍生物 (fatty acid derivatives) 3.3±1.8 三 香氛產品開發 ( 一 ) 緣起 南台灣向來是蝴蝶蘭生產的重鎮, 擁有多數深具規模的蘭園, 再加上位 於台南市後壁區 台灣蘭花生物科技園區 之建立, 無疑的, 政府 學術單 位及民間企業若能彼此配合將能使蝴蝶蘭產業如同資訊產業般的成功發展, 創造更高的經濟利潤 雖說蘭花產業之產值比不上生物製藥 光電發展... 等 相關產業, 但蝴蝶蘭是台灣的象徵 其所代表之國際形象更遠弗於其經濟上 的價值 為了提高學術研究成果可進行產學應用, 在民國 98 年底成立 台灣第一個 蘭花研究中心 (http://orchid.rsh.ncku.edu.tw/bin/home.php), 網羅有 20 多年蝴蝶蘭產學經驗之陳文輝教授, 成大生命科學系 熱帶 植物科學研究所多位教授及台大和農業改良場等多位專家學者, 進行 跨校跨領域合作, 希望能夠以成功大學為技術整合平台, 將過去 10 多 年來台灣蝴蝶蘭生物技術研發團隊之研究成果導入蘭花產業, 或協助 蘭花產業解決問題 ( 二 ) 香氛產品開發歷程及推廣 1. 開發歷程 過去研究鑑別了大葉蝴蝶主要成份為單萜類, 其中以芳樟醇和香葉醇為 最大量 (Hsiao et al., 2006), 另有其衍生物橙花醇 (Nerol) 香葉酸 (Geranic Acid) 肉桂油烯 (Myrcene) 等 芳樟醇 香葉醇 肉桂油烯則具有促進消化 系統作用 刺激副交感神經及提振精神等功用 香葉醇 (Geraniol) 具有驅逐蚊 蟲之功能, 在癌症研究中發現在大鼠與小鼠實驗處理香葉醇中, 可以抑制肝 細胞癌症 (Hepatomas) 及皮膚病變的黑素瘤 (Melanomas) 之癌細胞生長 Nerol 87
具有抗菌能力 這些芳香分子作用若能研究更透徹, 更能應用於預防及治療醫學, 不僅是抹的保養品, 未來可以成為吃的保養品 這些芳香成份也常做為芳香療法 (Aromatherapy) 之精油來源, 藉由芳香植物所萃取出的精油做為媒介, 以按摩 泡澡 薰香等方式, 經由呼吸或皮膚吸收進入體內, 達到預防身心靈疾病與保健的功效, 近幾年, 台灣 芳香療法 極為盛行, 希望透過此療法擁有更健康 更美好的生活品質以及回歸自然風的養生觀念 因此已採用最天然方式, 活體精萃大葉蝴蝶蘭花香精油, 開發了蝴蝶蘭芳香精油萃取技術及蘭花芳香物之副產品, 例如各式蘭花香水 保養品等 2. 推廣與合作本中心利用此技術平台自行開發蘭花香氛系列產品, 在民國 100 年之 成大 80 週年校慶 - 蘭花產學文創藝術活 作為第一次發表, 並參加政府單位 臺南市政府經濟發展局 與 財團法人工業技術研究院 舉辦 101 年度臺南蘭花特色產業推動計畫 之生技媒合會推廣蘭花香氛產品, 並於民國 101 年與 先寧電子科技股份有限公司 進行 蘭花香氛系列產品之開發 合作研究計畫, 輔導廠商於 2012 年台灣國際蘭展 推出此系列產品吸引大批顧客, 成績斐然 2013 年台灣國際蘭展 蘭花研究中心與三創研發中心 蘭卉生物科技公司 陞等美術設計公合作, 引進文創巧思, 規劃互動故事機與蘭花產品協同展出, 把蘭花生技產品所使用的蘭花原料特色, 用 3D 動畫的風格, 結合特殊設備做演出, 提昇遊客對蘭花與產品的印象, 以互動故事, 將蘭花擬人化角, 講述蘭花的過去 現在 未來, 藉由文創與創新, 重新塑造蘭花新形象, 期望建立屬於台灣在地的蘭花品牌, 同年七月也將參與台北生技展, 並積極參與國內外之展覽活動, 也爭取各項國際活動之共同主辦權, 奠定了蘭花研究中心在民眾和產業界之地位, 去年在國科會支持下成立了 蘭花生技產學聯盟 (http://obiua.bio.ncku.edu.tw), 結合跨校跨領域五個平台, 服務蘭花一級 二級和三級產業 ( 圖五 ) 3. 輔導公司成立以此平台結合政府產學合作政策及振興經濟方案, 乃積極輔導 蘭卉生物科技股份有限公司 (http://www.lanhui-biotech.com) 的成立 ( 圖六 ), 期能將蘭花科技落實產業, 造福社會 此公司建立在於創造一個屬於台灣在地的蘭花品牌, 利用生物科技技術替蘭花加值, 並藉由文創與創新重新賦予蘭花新的生命, 用嚴謹的科學態度創新或創造不同以往的蘭花產品行銷國際 四 結語 透過蘭花研究中心將台灣蝴蝶蘭生物技術研發團隊之研發成果產業化, 由香 花蝴蝶蘭之基礎研究至蘭花香味成份分析及萃取技術服務平台, 最後到香氛產品 88
開發之產業應用, 此為具優勢的主題進行跨領域的整合, 結合上游 中游及下游並配合文創設計創造一個技術品牌或形象產品, 整體考量所有產品或技術之關聯性, 以期在最短的時間創造產品供市場行銷, 這是一個開創先趨的例子, 未來希望其他蘭花相關技術平台也能透過產業化模式協助蘭花產業, 做到整合產 官 學 研之力量, 協助產業解決問題以提升蝴蝶蘭產業競爭力 參考文獻 1.Hsiao, Y. Y., W. C. Tsai, C. S. Kuoh, T. H. Huang, H. C. Wang, T.S. Wu, Y. L. Leu, W. H. Chen, and H. H. Chen, 2006 Comparison of transcripts in Phalaenopsis bellina and Phalaenopsis equestris (Orchidaceae) flowers to deduce monoterpene biosynthesis pathway. BMC Plant Biol. 6, 14. 2.Hsiao, Y. Y., M. F. Jeng, W. C. Tsai, Y. C. Chung, C. Y. Li, T. S. Wu, C. S. Kuoh, W. H. Chen, and H. H. Chen, 2008 Novel homodimeric geranyl diphosphate synthase from the orchids Phalaenopsis bellina lacking a DD(X)2-4D motif. Plant Journal 55: 719-733. 3.van der Pijl, L. and C. H. Dodson, 1969 Their pollination and evolution. In Orchid Flowers (Fla, C.G., ed). University of Miami Press, Coral Cables, Florida. 89
Abstract Phalaenopsis spp. is the most important ornamental flowers for export in Taiwan, and has been emphasized by government to be developed as a dedicate agriculture industry. So far, Taiwan is one of the most exportation of Phalaenopsis seedlings and plants worldwide. Many breeders hope to create new orchid varieties with floral fragrance so as to promote the economic value of Phalaenopsis. However, due to cross-incompatibility and dosage effect of Phalaenopsis, gaining the floral fragrance trait through breeding has only gone through very limited progress. Therefore, we chose scented P. bellina that is oftenly used as parent for fragrance breeding to analyze its flavor ingredients and identify genes encoding for floral fragrance metabolic biosynthesis pathway. We isolated and characterized a gene for key enzyme of terpene biosynthesis - geranyl diphosphate synthase (GDPS). In addition, we developed a technology of living extraction for essential oil of P. bellina, established technology platform of Phalaenopsis-essential oil extraction and produced byproducts of orchid fragrance. In late 2009, Orchid Research Center was established to conduct industrialization of orchid research results and promotional activities. Furthermore, under the financial support of National Science Council, we established Orchid Biotechnology Industry-University Alliance in 2013, integrating five platforms of cross university and interdisciplinary to serve the primary, the secondary and the tertiary orchid related industries. With the cooperation policy of government industry-university and economic revitalization, we have assisted the startup company of Lan Hui Biotech Co., Ltd. to promote orchid fragrance products. Key word:phalaenopsis bellina, geraniol, linalool, series of fragrant products, Orchid Research Center 90
圖一 大葉蝴蝶蘭 Fig.1. Phalaenopsis bellina. 圖五 蘭花香氛系列產品與文創產品 Fig. 5. A series of products for orchid fragrance and cultural and creative industry. 圖六 蘭卉生物科技股份有限公司之網站 Fig. 6. Website of Lan Hui Biotech Co., Ltd company. 91
圖四 香味物種 Phalaenopsis bellina, Phalaenopsis equestris W9-72 和 Doritaenopsis Kenneth Schubert five 及無香味物種 Phal. equestris 和 Dtps. Kenneth Schubert (A) 香味及無香味蝴蝶蘭屬物種 (B) 利用 RT-PCR 和 PbGDPS 基因專一性引子偵測 PbGDPS 轉錄子表現,RNA 分離來自各種開花第五天的花部組織 (C) 收集九個小時 (9:00 至 18:00) 三朵開花第五天之花部揮發性化合物和利用 GC-MS 分析其成份 這些產物藉由氣相層析 (gas chromatography) 分離, 並比較標準品之質譜 (mass spectra) 和保持時間 (retention time) 而鑑定其化合物 黑點表示芳香醇 (linalool) 及白點表示香葉草醇 (geraniol) Fig. 4. Scented species of Phalaenopsis bellina, Phalaenopsis equestris W9-72 and Doritaenopsis Kenneth Schubert five, and scentless species of Phal. equestris and Dtps. Kenneth Schubert. (A) Scented and scentless Phalaenopsis species. (B) Detection of PbGDPS transcripts by RT-PCR with PbGDPS gene-specific primers and RNA isolated from various flowers on day 5 post-anthesis. (C) The flowers volatile components were collected from three flowers during each sampling period for 9 h (from 09:00 h to 18:00 h) from day 5 post-anthesis and were analyzed by GC-MS. The resulting products were separated by gas chromatography and identified by comparison of mass spectra and retention times with those of authentic standards (bottom panel). The black circle indicates linalool and the white circle indicates geraniol. 92