植物遗传资源学报 ２０１３ꎬ１４(６) :１１６７ １１７２ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ 黄淮海大豆异黄酮含量分析与特异种质遴选 崔艳伟ꎬ李喜焕ꎬ李文龙ꎬ常文锁ꎬ张彩英 ( 河北农业大学 / 教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室ꎬ保定 ０７１００１) 摘要:以黄淮海生态区 １８１ 份栽培大豆与 ３２ 份野生大豆为材料ꎬ采用高效液相色谱法测定其子粒异黄酮及组分含量ꎬ分 析该地区大豆子粒异黄酮含量遗传变异ꎬ遴选高异黄酮特异种质ꎬ为相关基因克隆表达 ＲＩＬ 群体构建和专用型品种选育提供 资源ꎮ 结果表明ꎬ供试栽培大豆异黄酮含量在 １４６２ ６ ~ ６１１５ ５ μｇ / ｇꎬ平均为 ３５５８ ２ μｇ / ｇꎬ最大差异可达 ４ ２ 倍ꎻ供试野生大 豆异黄酮含量在 ３８９６ １ ~ ７４４０ ４ μｇ / ｇꎬ平均为 ５１８２ ４ μｇ / ｇꎬ最大差异可达 １ ９ 倍ꎮ 可见ꎬ黄淮海生态区大豆资源异黄酮及组 分含量存在较大遗传变异ꎬ且野生大豆异黄酮平均含量显著高于栽培大豆ꎮ 从供试资源中遴选出异黄酮含量超过 ６０００ μｇ / ｇ 特异种质 ４ 份( 超过 ７０００ μｇ / ｇ 种质 １ 份) ꎮ 关键词:异黄酮ꎻ种质资源ꎻ栽培大豆ꎻ野生大豆ꎻ遗传变异 Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｅｌｉｔｅ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ Ｓｏｙｂｅａｎ ｆｒｏｍ ＨｕａｎｇＨｕａｉＨａｉ Ｅｃｏｔｙｐｅ Ｒｅｇｉｏｎ ＣＵＩ Ｙａｎ ｗｅｉꎬｌｉ Ｘｉ ｈｕａｎꎬｌｉ Ｗｅｎ ｌｏｎｇꎬｃｈａｎｇ Ｗｅｎ ｓｕｏꎬｚｈａｎｇ Ｃａｉ ｙｉｎｇ ( Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ＲｅｓｏｕｒｃｅｓꎬＥｄｕｃａｔｉｏｎ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃｈｉｎａ / Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＨｅｂｅｉꎬＢａｏｄｉｎｇ ０７１００１) Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔ ｅｌｉｔｅ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｓｅｅｄꎬ２１３ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓꎬ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ １８１ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ａｎｄ ３２ ｗｉｌｄ ｓｏｙｂｅａｎ ｏｒｉｇｉｎａｔｉｎｇ ｆｒｏｍ ＨｕａｎｇＨｕａｉＨａｉ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｇｉｏｎꎬｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ( ＨＰＬＣ) ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａ ｌａｒｇｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｏｔａｌ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｅｘｉｓｔｅｄ ｉｎ ｂｏｔｈ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ａｎｄ ｗｉｌｄ ｓｏｙｂｅａｎｓꎬａｎｄ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ｉｎ ｗｉｌｄ ｓｏｙｂｅａｎ ｓｅｅｄ ｗａｓ ｍｕｃｈ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｓｅｅｄ. Ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ｉｎ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｓｏｙｂｅａｎ ｗａｓ １４６２ ６ ６１１５ ５ μｇ / ｇ (４ ２ ｆｏｌｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎ) ꎬｗｉｔｈ ａｎ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ３５５８ ２ μｇ / ｇꎬｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ｉｎ ｗｉｌｄ ｓｏｙｂｅａｎ ｗａｓ ３８９６ １ ７４４０ ４ μｇ / ｇ (１ ９ ｆｏｌｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎ) ꎬｗｉｔｈ ａｎ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ５１８２ ４ μｇ / ｇ. Ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓꎬｆｏｕｒ ｅｌｉｔｅ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ( > ６０００ μｇ / ｇ) ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｏｕｔꎬｏｆ ｗｈｉｃｈ ｏｎｅ ｅｌｉｔｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ ａｂｏｖｅ ７０００ μｇ / ｇꎬａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏ ｎｉｎｇ ｏｆ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓꎬｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＩＬ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎꎬａｎｄ ｎｅｗ ｖａｒｉｅｔｙ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｆｕｒ ｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ. Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅꎻｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅꎻｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｓｏｙｂｅａｎꎻｗｉｌｄ ｓｏｙｂｅａｎꎻｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ 大豆不仅是我国人民主要食物蛋白质和脂肪来 自由基氧化损伤导致疾病的重要功能ꎮ 异黄酮的分 源ꎬ还富含多种生理活性成分( 异黄酮 多肽 磷脂 子结构还与雌激素非常相似ꎬ可与人体内的雌激素 低聚糖 皂甙等) ꎬ在保健食品和医学领域具有极高 的潜在应用价值 [１ ２] ꎮ 异黄酮因富含酚羟基ꎬ易脱 氢发挥还原效应ꎬ被认为是天然抗氧化剂ꎬ具有阻止 收稿日期:２０１３ ０１ ３１ 修回日期:２０１３ ０２ ２８ 受体结合ꎬ因而在抑制激素依赖性癌症及预防骨质 疏松症等方面具有重要作用 [１ꎬ３] ꎮ 研究发现ꎬ大豆 异黄酮主要存在于种子中ꎬ含量仅 ０ ４ ~ ５ ꎬ且 网络出版日期:２０１３ １０ ２２ ＵＲＬ:ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｃｎｋｉ. ｎｅｔ / ｋｃｍｓ / ｄｅｔａｉｌ / １１. ４９９６. Ｓ. ２０１３１０２２. １５４８. ０３１. ｈｔｍｌ 基金项目:科技部农业科技成果转化资金项目(２０１２ＧＢ２Ａ２０００３２) ꎻ河北省自然科学基金项目( Ｃ２０１３２０４０２０) 第一作者主要从事大豆分子生物学与转基因研究ꎮ Ｅ ｍａｉｌ:ｃｕｉｙａｎｗｅｉ０７ １２６. ｃｏｍ 通信作者:李喜焕ꎬ从事大豆遗传育种与转基因研究ꎮ Ｅ ｍａｉｌ:ｌｉｘｉｈｕａｎ ｈｅｂａｕ. ｅｄｕ. ｃｎ 张彩英ꎬ从事大豆遗传育种与转基因研究ꎮ Ｅ ｍａｉｌ:ｚｈａｎｇｃａｉｙｉｎｇ ｈｅｂａｕ. ｅｄｕ. ｃｎ
1168 植物遗传资源学报 14 卷 提取工艺需要经过溶剂浸提 杂质过滤 浓缩回收 吸附分离 真空干燥等过程 ꎬ 其生产量远不能满足需 求 [4 5] ꎮ 据统计 ꎬ 国际市场大豆异黄酮年需求量约 1500 tꎬ 且逐年递增 ꎬ 而全球异黄酮实际生产能力仅 500 t / 年 [6] ꎮ 因此 ꎬ 广泛评价现有大豆资源 ꎬ 遴选高 异黄酮特异种质 ꎬ 培育专用品种便成为解决这一问 题的关键 ꎮ 针对不同大豆品种异黄酮含量测定 ꎬ 国内外 均有报道 ꎬ 并获得一些高异黄酮专用型材料 ꎮ V. Tepavcevic ' [7] 等分析 4 个国家 20 份大豆品种发 现 ꎬ 异黄酮变异范围在 1450 ~ 4590 μg / gꎬ 平均为 [8] 3250 μg / gꎻg. Sakthivelu 等测定印度与保加利亚 11 份品种异黄酮发现 ꎬ 印度品种在 558 ~ 1049 μg / gꎬ [9] 保加利亚品种在 628 ~ 1717 μg / gꎮ 王春娥等测定 选自中国各生态区的 895 份 国外 88 份大豆资源异 黄酮含量 ꎬ 优选出高异黄酮 ( > 7000 μg / g) 特异种质 7 份 ꎬ 其中 6 份是来自黄淮海二熟春夏豆生态区 ( 河 南 河北和山西 ) 的地方品种或野生大豆 ꎬ 这是迄今 为止筛选范围最广 入选种质异黄酮含量最高的报 [10] 道 ꎮ 袁凤杰等利用来自 17 个不同省份 ( 黄淮海 区域和南方省份 ) 的 300 份大豆品种为试材 ꎬ 从中 筛选出 5 份异黄酮含量高于 5000 μg / g 的优异种 质 ꎬ 并认为黄淮海区域省份内的大豆异黄酮含量显 [11] 著高于南方省份 ꎮ 葛一楠等按照不同生态区和 类型比例 ꎬ 从大豆微核心种质和主栽品种中选取了 100 份代表性资源 ꎬ 通过测定其子粒异黄酮含量 ꎬ 筛 选出高异黄酮特异种质 2 份 ꎬ 其中含量最高的平顶 黑豆 (4459 μg / g) 来自黄淮海夏大豆区 ꎮ 大豆品种鉴定表明 ꎬ 黄淮海地区大豆资源中蕴 藏着丰富的高异黄酮特异种质 ꎮ 然而针对该地区大 豆品种资源进行大范围的异黄酮含量测定研究却鲜 有报道 ꎬ 许多潜在高异黄酮含量大豆特异种质尚未 被发现 ꎮ 鉴于此 ꎬ 本研究以 213 份来自黄淮海生态 区 ( 河北 北京 河南 山东 山西和江苏 ) 大豆品种 资源为试材 ꎬ 采用高效液相色谱法测定其子粒异黄 酮及其组分含量 ꎬ 分析该地区大豆资源子粒异黄酮 及其组分含量遗传变异 ꎬ 并遴选高异黄酮特异种质 ꎬ 为异黄酮功能基因发掘 标记开发及新品种培育奠 定物质基础 ꎮ 1 材料与方法 1 1 供试品种 选取黄淮海大豆生态区 ( 河北 北京 河南 山 东 山西等 ) 种质资源 199 份 ꎬ 其他地区 13 份 ꎬ 国外 品种 1 份 ꎬ 共计 213 份 ꎬ 作为供试材料 ꎬ 由中国农业 科学院国家作物种质库 河北省作物种质资源库 河 北省农林科学院粮油作物研究所和河北农业大学提 供 ( 表 1)ꎮ 表 1 供试大豆种质分布 Table 1 Soybean germplasm and its origin 生态区生态区地区数量 ( 份 ) 地区数量 ( 份 ) Ecotype Ecotype Region Number Region Number region region 河北 99 黄淮海 黑龙江 5 北方 北京 49 黄淮海 辽宁 3 北方 山东 17 黄淮海 吉林 2 北方 河南 16 黄淮海 湖北 2 南方 山西 13 黄淮海 江苏 2 黄淮海 安徽 3 黄淮海 内蒙古 1 北方 1 2 试验方法 1 2 1 材料种植供试材料于 2011 年 6 月种植在河北农业大学作物育种中心试验场 ( 保定 )ꎬ 随机区组设计 ꎬ3 次重复 ꎬ 双行区 ꎬ 行长 5 mꎬ 行距 0 5 mꎬ 密度 1 2 万株 / 667 m 2 ꎬ 田间管理同一般大田 ꎮ 1 2 2 异黄酮含量标准曲线的制作方法准确称取各异黄酮组分标准品 10 mg 置于 10 ml 容量瓶中 ꎬ 甲醇溶液进行定容 ꎬ - 20 保存备用 ꎮ 准确量取上述异黄酮组分保存液 5 μl 10 μl 20 μl 40 μl 80 μl 和 160 μlꎬ 分别置于 2 ml 离心管中 ꎬ 甲醇溶液定容 ꎬ 即为不同浓度的标准溶液 ꎬ 用于标准曲线制作 ꎮ 采用岛津 Prominence LC 20A 型高效液相色谱系统 ( SHIMADZUꎬJapan) 进行样品异黄酮含量测定 ꎮ 色谱条件为 :SHIMADZU VP ODS 柱 (4 6 mm 150 mm)ꎬ 柱温 36 ꎬ 检测波长 254 nmꎬ 进样量 10 μlꎻ 流动相采用 7 3 的乙腈 超纯水 ꎬ 流速 0 3 ml/ minꎬ 分析时间为 30 minꎮ 1 2 3 异黄酮含量测定方法的可靠性分析为准确测定供试样品的异黄酮含量 ꎬ 在建立标准曲线回归方程的基础上 ꎬ 进行了测定方法的精密度 重现性 稳定性和回收率试验 ꎬ 以确保测定结果的精确性和准确性 ꎮ 具体方法如下 : (1) 精密度试验 : 利用已配制的标准样品溶液 ꎬ 独立重复测定 6 次 ꎬ 分析测定结果的变异范围 ꎮ (2) 重现性试验 : 以供试品种收获后的种子为材料 ꎬ 从样品称取开始 ꎬ 独立重复测定异黄酮含量 5 次 ꎬ 分析测定结果的变异程度 ꎮ (3) 稳定性试验 : 提取供试品种子粒中的异黄
6 期 崔艳伟等 : 黄淮海大豆异黄酮含量分析与特异种质遴选 1169 酮 ꎬ 密封 4 保存 ꎬ 每隔 4 h 重复测定 1 次 ꎬ 直至 72 h ( 共 18 次 )ꎬ 分析测定结果在日内 (24 h 内 ) 和日间 (72 h 内 ) 的变异范围 ꎮ (4) 加标回收率试验 : 吸取不同体积的标准样品溶液 ꎬ 采用已知浓度的大豆样品进行定容 ꎬ 并进行异黄酮含量测定 ꎬ 每个试验独立重复 3 次 ꎬ 计算加标回收率及变异系数 ꎮ 1 2 4 供试大豆种质资源异黄酮含量测定收获后的大豆种子经高速粉碎机研磨 ꎬ 过筛 ꎻ 准确称取 0 100 g 置于 10 ml 离心管中 ꎬ 每个样品独立重复 3 次 ꎮ 利用 80% 甲醇溶液将样品定容至 8 mlꎬ50 超声 ( 频率 40 khzꎬ 功率 300 W) 辅助提取 1 hꎮ 10000 r / min 离心 10 minꎬ 吸取上清液约 2 mlꎬ 采用 0 22 μm 滤膜过滤 ꎬ 注入 HPLC 自动进样专用小瓶 (1 5 ml)ꎬ 进行异黄酮含量测定 ꎮ 1 3 统计方法试验数据采用 Microsoft Excel 2003 进行描述统计和回归分析 ꎬ 其中描述统计次数分布表制作方法如下 : 计算数据极差 ꎬ 确定最小值为第 1 组组中值 ꎬ 计算上下限 ꎬ 进而确定其他组别上下限 ꎬ 并对数据进行分组 ꎮ 采用 DPS 3 01 进行数据方差分析 ꎮ 2 结果与分析 2 1 异黄酮含量测定回归方程的建立通过测定 6 个不同浓度异黄酮组分标准样品 ꎬ 以标准样品浓度为自变量 ( X) ꎬ 吸收峰面积为因变量 ( Y) ꎬ 得到线性回归方程 ( 表 2) ꎮ 分析回归方程发现 ꎬ 方程的决定系数 ( R 2 ) 分别为 0 9999 0 9974 和 0 9986 ( 一般要求大于 0 99)ꎬ 说明在自变量取值 2 5 ~ 80 0 μg / ml 范围内 ꎬ 具有线性关系 ꎬ 且达到极显著水平 ꎬ 可用于大豆异黄酮组分含量测定 ꎮ 表 2 Table 2 标准样品 Compo nent 大豆苷 Daidzin 黄豆黄苷 Glycitin 染料木苷 Genistin 异黄酮标准样品制作的回归方程及其决定系数 Linear regression equation and determination co efficient of isoflavone component 线性范围 (μg / ml) Linear range 表示极显著差异 2 2 回归方程 Regression equation 决定系数 Determination coefficient 2 5 ~ 80 0 Y = 90834 7X + 122252 2 0 9999 2 5 ~ 80 0 Y = 92098 4X + 81557 5 0 9974 2 5 ~ 80 0 Y = 10419 7X 8237 4 0 9986 means significance at 0 01 level 异黄酮含量测定方法的可靠性检验 通过分析标准样品 6 次重复的异黄酮组分发 现 ꎬ 各组分 ( 大豆苷 黄豆黄苷和染料木苷 ) 的相对 标准偏差 ( RSD) 分别为 0 96% 1 53% 和 1 31% ( 要求 < 2% )ꎬ 说明所用测定方法精密度高 ꎮ 分析 同一供试品种 5 次重复异黄酮组分结果发现 ꎬ 各组 分 ( 大豆苷 黄豆黄苷和染料木苷 ) 的 RSD 分别为 1 89% 1 85% 和 1 65% ( 要求 < 2% )ꎬ 说明所用测 定方法重现性好 ꎮ 进一步分析供试品种每隔 4 h 重复测定 ( 直至 72 h) 的异黄酮组分发现 ꎬ 各组分 ( 大豆苷 黄豆黄 苷和染料木苷 ) 的日内稳定性 RSD 分别为 1 76% 0 89% 和 1 27% ( 要求 < 2% )ꎬ 日间稳定性 RSD 分别 为 0 98% 1 28% 和 1 02% ( 要求 < 2% )ꎬ 说明所用 测定方法在日内和日间的稳定性均高 ꎮ 通过分析所 用测定方法的回收率发现 ꎬ 各组分 ( 大豆苷 黄豆黄苷 和染料木苷 ) 的加标回收率分别为 98 91% 99 93% 和 101 46% ( 要求 95% ~ 105% )ꎬ 相对应的 RSD 值分 别为 1 42% 1 89% 和 1 73% ( 要求 < 3% )ꎬ 说明测 定方法的回收率高 ꎬ 变异程度小 ( 表 3)ꎮ 表 3 异黄酮组分测定的加标回收率分析 Table 3 Recover test of the determination procedure of isoflavone component 标准样品 Component 大豆苷 Daidzin 黄豆黄苷 Glycitin 染料木苷 Genistin 重复 Repeat 样品含量 (μg / ml) Original amount 加入量 (μg / ml) Added amount 测定值 (μg / ml) Measured value 回收率 (% ) Recovery 1 33 82 10 00 43 67 98 46 2 33 82 20 00 53 92 100 48 3 33 82 40 00 72 93 97 77 1 23 57 10 00 33 71 101 44 2 23 57 20 00 43 67 100 53 3 23 57 40 00 62 69 97 81 1 27 83 2 50 30 34 100 46 2 27 83 5 00 32 85 100 43 3 27 83 10 00 38 18 103 49 平均回收率 (% ) Mean recovery RSD (% ) 98 91 1 42 99 93 1 89 101 46 1 73
1170 植物遗传资源学报 14 卷 由此可见 ꎬ 本试验所用异黄酮及其组分测定方法在精密度 重现性 稳定性和回收率方面均符合要求 ꎬ 所测结果的精确性和准确性高 ꎬ 可以用于供试样品异黄酮及其组分含量测定 ꎮ 2 3 供试大豆种质资源异黄酮及其组分含量综合评价分析供试 213 份大豆种质异黄酮含量发现 ꎬ3 次重复间的相关系数分别为 0 91 0 88 和 0 87ꎬ 均达到极显著水平 ꎬ 说明测定结果的重复性好 ꎬ 可信度高 ꎻ 同时发现 ꎬ 种质间差异达极显著水平 ( F = 20 18 )ꎬ 变异系数为 28 0% ꎬ 表明黄淮海生态区大豆资源异黄酮含量存在着丰富遗传差异 ꎬ 可以从中筛选出极端类型种质 ꎮ 对供试栽培大豆按照异黄酮及其组分含量进行 分组发现 ( 表 4)ꎬ 总异黄酮含量分布范围在 1462 6 ~ 6115 5 μg / gꎬ 极差为 4652 9 μg / gꎬ 最大差异可达 4 2 倍 ꎻ 总异黄酮平均含量为 3558 2 μg / gꎬ 有 85 6% 的品种分布在 2250 0 ~ 4875 0 μg / g 之间 ꎮ 大豆苷含量分布在 627 4 ~3500 6 μg / gꎬ 极差为 2873 2 μg / gꎬ 最大差异达 5 6 倍 ꎬ 平均含量为 1945 0 μg / gꎬ77 9% 的品种分布在 1107 4 ~ 2707 4 μg / gꎮ 黄豆黄苷含量分布在 105 4 ~ 2277 1 μg / gꎬ 极差为 2171 7 μg / gꎬ 最大差异达 21 6 倍 ꎬ 平均含量为 859 1 μg / gꎬ81 8% 的品种分布在 465 4 ~ 1185 4 μg / gꎮ 染料木苷含量分布在 351 8 ~ 1990 5 μg / gꎬ 极差为 1638 7 μg / gꎬ 最大差异达 5 7 倍 ꎬ 平均含量 902 8 μg / gꎬ79 6% 的品种分布在 442 8 ~ 1170 8 μg / gꎮ 表 4 供试栽培大豆品种子粒异黄酮及其组分含量分布情况 Table 4 The distribution situation of seed isoflavone and component contents of cultivated soybean 总异黄酮 Isoflavone content 大豆苷 Daidzin content 黄豆黄苷 Glycitin content 染料木苷 Genistin content 1200 ~ 1725 0 017 467 ~ 787 0 011 0 ~ 225 0 006 261 ~ 443 0 028 1725 ~ 2250 0 039 787 ~ 1107 0 088 225 ~ 465 0 055 443 ~ 625 0 160 2250 ~ 2775 0 133 1107 ~ 1427 0 133 465 ~ 705 0 271 625 ~ 807 0 221 2775 ~ 3300 0 243 1427 ~ 1747 0 127 705 ~ 945 0 309 807 ~ 989 0 260 3300 ~ 3825 0 221 1747 ~ 2067 0 260 945 ~ 1185 0 238 989 ~ 1171 0 155 3825 ~ 4350 0 127 2067 ~ 2387 0 133 1185 ~ 1425 0 066 1171 ~ 1353 0 077 4350 ~ 4875 0 133 2387 ~ 2707 0 127 1425 ~ 1665 0 028 1353 ~ 1535 0 055 4875 ~ 5400 0 061 2707 ~ 3027 0 072 1665 ~ 1905 0 022 1535 ~ 1717 0 028 5400 ~ 5925 0 022 3027 ~ 3347 0 028 1905 ~ 2145 0 000 1717 ~ 1899 0 006 5925 ~ 6450 0 006 3347 ~ 3667 0 022 2145 ~ 2385 0 006 1899 ~ 2081 0 011 同时 ꎬ 分析供试野生大豆异黄酮及其组分含量发现 ( 表 5)ꎬ 总异黄酮变异幅度在 3896 1 ~ 7440 4 μg / g 之间 ꎬ 平均含量为 5182 4 μg / gꎬ 极差达到 3544 3 μg / gꎬ 相差 1 9 倍 ꎬ 变异系数为 14 6% ꎮ 大豆苷变异幅度在 808 4 ~1612 4 μg / g 之间 ꎬ 平均含量为 1128 4 μg / gꎬ 极差达到 804 0 μg / gꎬ 相差 2 0 倍 ꎬ 变异系数为 18 0% ꎮ 黄豆黄苷变异幅度在 1480 3 ~ 3439 1 μg / g 之间 ꎬ 平均含量为 2170 1 μg / gꎬ 极差达到 1958 8 μg / gꎬ 相差 2 3 倍 ꎬ 变异系数为 19 3%ꎮ 染料木苷变异幅度在 1247 2 ~ 2513 2 μg/ g 之间 ꎬ 平均含量为 1883 8 μg / gꎬ 极差达到 1266 0 μg / gꎬ 相差 2 0 倍 ꎬ 变异系数为 17 5% ꎮ 可见 ꎬ 供试野生大豆子粒黄豆黄苷与染料木苷含量相对较 多 ꎬ 而大豆苷含量相对较低 ꎮ 进一步比较野生大豆与栽培大豆异黄酮含量发现 ꎬ 供试野生大豆异黄酮平均含量显著高于栽培大豆 ꎬ 说明野生大豆中蕴藏着丰富的高异黄酮含量资源 ꎮ 2 4 子粒高异黄酮含量大豆特异种质遴选通过分析各供试种质异黄酮及其组分含量 ꎬ 筛选出高异黄酮及其组分特异种质 10 份 ( 表 6)ꎮ 具体包括 : 异黄酮含量超过 6000 μg / g 种质 4 份 ꎬ 其中超过 7000 μg / g 种质 1 份 ꎻ 大豆苷含量超过 3400 μg / g 种质 3 份 ꎬ 黄豆黄苷含量超过 3000 μg / g 种质 2 份 ꎬ 染料木苷含量超过 2500 μg / g 种质 1 份 ꎬ 可供异黄酮分子生物学和品种选育应用 ꎮ
6 期 崔艳伟等 : 黄淮海大豆异黄酮含量分析与特异种质遴选 1171 表 5 供试野生大豆子粒异黄酮及其组分含量分布 Table 5 The distribution situation of seed isoflavone and component contents of wild soybean 总异黄酮 Isoflavone content 大豆苷 Daidzin content 黄豆黄苷 Glycitin content 染料木苷 Genistin content 3457 ~ 4343 0 094 700 ~ 901 0 063 1235 ~ 1725 0 063 1092 ~ 1408 0 063 4343 ~ 5229 0 500 901 ~ 1102 0 500 1725 ~ 2215 0 563 1408 ~ 1725 0 250 5229 ~ 6115 0 313 1102 ~ 1303 0 250 2215 ~ 2705 0 281 1725 ~ 2041 0 344 6115 ~ 7001 0 063 1303 ~ 1504 0 094 2705 ~ 3195 0 063 2041 ~ 2358 0 250 7001 ~ 7887 0 031 1504 ~ 1705 0 094 3195 ~ 3685 0 031 2358 ~ 2674 0 094 表 6 入选高异黄酮大豆特异种质及其含量 Table 6 Selected elite accessions with high isoflavone or component contents 异黄酮 (μg / g) 大豆苷 (μg / g) 黄豆黄苷 (μg / g) 染料木苷 (μg / g) Isoflavone Daidzin Glycitin Genistin YD 157 7440 4 中豆 34 3500 6 YD 157 3439 1 YD 131 2513 2 YD 146 6691 4 吉林 35 3439 3 YD 146 3061 3 YD 132 6488 2 商豆 14 3437 4 中作 J9056 6115 5 3 讨论 异黄酮仅存在于豆科植物 ꎬ 且大豆中含量最高 ꎮ 近年来有一些学者致力于发掘和利用大豆高异黄酮特异种质研究 ꎬ 旨在为相关基因分子克隆 关键基因差异表达 RIL 群体构建和专用型品种选育提供材料 ꎮ 根据本研究统计 ꎬ 我国东北地区大豆异黄酮含量测定的报道约有 12 篇 ꎬ 涉及 1933 份资源 ꎬ 遴选特异种质约 73 份 ( 高 低异黄酮含量 ) ꎻ 南方地区大豆资源异黄酮含量的报道约有 5 篇 ꎬ 涉及 1062 份资源 ꎬ 遴选特异种质为 15 份 ꎻ 而涉及黄淮海生态区研究仅有 3 篇 ꎬ 鉴定 475 份资源 ( 品种覆盖我国所有大豆生态区 ) ꎬ 入选特异种质仅 11 份 [9 24] ꎮ 黄淮海地区蕴藏着丰富的高异黄酮含量资源 ꎬ 加强其异黄酮含量鉴定及特异种质遴选十分必要和迫切 ꎮ 针对我国黄淮海地区大豆资源异黄酮含量研究较少和种质缺乏问题 ꎬ 本研究选取黄淮海生态区 ( 河北 北京 河南 山东 山西和江苏等 ) 的 213 份大豆种质资源作为供试材料 ꎬ 通过测定其子粒异黄酮及组分含量 ꎬ 对该地区的大豆资源异黄酮及组分含量进行大范围筛选和评价 ꎬ 明确了该区大豆异黄酮及组分含量水平 ꎬ 遴选高异黄酮含量特异种质 ꎬ 进一步丰富了我国该类特异种质的数量 ꎬ 为开展异黄酮分子生物学研究和专用品种选育提供了基础材 料 ꎮ 研究表明 ꎬ 黄淮海地区栽培大豆异黄酮平均含量超过 3500 μg / gꎬ 最大差异可达 4652 9 μg / g( 约 4 2 倍 )ꎻ 野生大豆异黄酮平均含量超过 5000 μg / gꎬ 最大差异达 3544 3 μg / g( 约 1 9 倍 )ꎬ 说明该地区大豆资源异黄酮含量存在丰富变异 ꎬ 且蕴藏着一些高异黄酮含量特异种质 ꎮ 同时 ꎬ 本研究通过分析我国不同生态区大豆异黄酮含量发现 ꎬ 南方地区品种 ( 江苏 安徽 湖北 浙江 四川和广东 ꎬ249 份 ) 异黄酮含量分布范围在 367 ~ 4932 μg / g [12] ꎻ 重庆地区野生大豆 (96 份 ) 异黄酮变异范围在 610 ~5260 μg / gꎬ 地方品种 (102 份 ) 在 410 ~ 5100 μg / g [13] ꎻ 东北地区栽培大豆 ( 黑龙江 吉林 辽宁和内蒙古 ꎬ128 份 ) 异黄酮分布在 1040 ~ 4434 μg / g [16] ꎻ 吉林省大豆资源 (261 份 ) 异黄酮变异幅度在 1460 ~ 4970 μg / g [17] ꎻ 黑龙江省野生大豆 (598 份 ) 异黄酮分布在 416 ~ 6808 μg / gꎬ 栽培大豆 (465 份 ) 在 914 ~ 6249 μg / g [14 15ꎬ18 19ꎬ21ꎬ23] ꎮ 本研究测定黄淮海地区大豆 (213 份 ) 异黄酮发现 ꎬ 野生大豆分布在 3896 ~ 7440 μg / gꎬ 栽培大豆分布在 1463 ~ 6116 μg / gꎬ 与国内其他地区相比 ꎬ 高异黄酮含量种质较多 ꎬ 低异黄酮含量种质较少 ꎮ 另外 ꎬ 为提高测定大豆异黄酮含量精确性和准确性 ꎬ 本研究对测定方法精密度 ( 同一标样重复测定 ꎬ 反映测定仪器 试剂及环境一致性 ) 重现性( 同一测试样品重复测定 ꎬ 反映测试仪器和方法一致性 ) 稳定性
1172 植物遗传资源学报 14 卷 ( 同一测试样品每隔 4 h 重复测定 ꎬ 连续测定 3 dꎬ 反 映测试方法和样品稳定性 ) 和加标回收率 ( 标准样品 和测试样品混合后重复测定 ꎬ 反映测试方法准确性 ) 进行分析 ꎬ 证明所用方法在上述 4 个方面符合要求 ꎬ 测试结果具有较高准确度和精确度 ꎮ 同时 ꎬ 为确定测 试结果可靠性 ꎬ 选取了 3 个已知异黄酮含量品种 ( 中 豆 27 豫豆 25 和郑 92116) 作为参照 [25 26] ꎻ 发现测定 值与前人报道基本一致 ꎬ 相差不超过 80 μg / gꎬ 充分说 明了本研究结果的可靠性和真实性 ꎮ 参考文献 [1] 钱贻崧 ꎬ 程浩 ꎬ 喻德跃. 从农业到生物医学 : 大豆育种研究的新方向 [J]. 大豆科学 ꎬ2011ꎬ30(4):683 688 [2] 邱丽娟 ꎬ 常汝镇 ꎬ 袁翠平 ꎬ 等. 国外大豆种质资源的基因挖掘利用现状与展望 [J]. 植物遗传资源学报 ꎬ2006ꎬ7(1):1 6 [3] Cheng HꎬYu OliverꎬYu D Y. Polymorphisms of IFS1 and IFS2 gene are associated with isoflavone concentrations in soybean seeds[ J]. Plant Sciꎬ2008ꎬ175:505 512 [4] 刘蓉蓉 ꎬ 胡鸢雷 ꎬ 林忠平. 合成大豆异黄酮的植物基因工程研究进展 [J]. 农业生物技术学报 ꎬ2007ꎬ15(5):888 895 [5] 彭游 ꎬ 余盛禄. 大豆异黄酮提取研究最新进展 [ J]. 大豆科学 ꎬ 2012ꎬ31(2):320 323 [6] 李卫东 ꎬ 周鹏. 异黄酮及其在非豆科植物中生成的研究进展 [J]. 分子植物育种 ꎬ2005ꎬ3(6):888 894 [7] Tepavcevic ' VꎬAtanackovic ' MꎬMiladinovic ' Jꎬet al. Isoflavone com positionꎬtotal polyphenolic contentꎬand antioxidant activity in soy beans of different origin[j]. J Med Foodꎬ2010ꎬ13(3):657 664 [8] Sakthivelu GꎬAkitha Devi M KꎬGiridhar Pꎬet al. Isoflavone composi tionꎬphenol contentꎬand antioxidant activity of soybean seeds from India and Bulgaria[J]. J Agric Food Chemꎬ2008ꎬ56ꎬ2090 2095 [9] 王春娥 ꎬ 赵团结 ꎬ 盖钧镒. 中国大豆资源异黄酮含量及其组分的遗传变异和演化特征 [ J]. 中国农业科学 ꎬ2010ꎬ43 (19): 3919 3929 [10] 袁凤杰 ꎬ 姜莹 ꎬ 董德坤 ꎬ 等. 中国大豆核心种质异黄酮含量的分析 [J]. 中国粮油学报 ꎬ2011ꎬ26(2):5 8 [11] 葛一楠 ꎬ 孙君明 ꎬ 韩粉霞 ꎬ 等. 代表性大豆种质异黄酮主要组分含量鉴定 [J]. 植物遗传资源学报 ꎬ2011ꎬ12(6):921 927 [12] 孙君明 ꎬ 韩粉霞 ꎬ 丁安林. 高效液相色谱 ( HPLC) 技术鉴定中国南方大豆品种异黄酮主要组分 [ J]. 植物遗传资源学报 ꎬ 2004ꎬ5(3):222 226 [13] 张应 ꎬ 李向华 ꎬ 肖鑫辉 ꎬ 等. 重庆不同类型大豆异黄酮含量与品质性状的测定与分析 [J]. 大豆科学 ꎬ2011ꎬ30(1):67 72 [14] 杨雪峰 ꎬ 李文滨 ꎬ 齐宁 ꎬ 等. 野生大豆蛋白质 脂肪含量与异黄酮含量的相关性研究 [J]. 大豆科学 ꎬ2011ꎬ30(1):161 163 [15] 张海军 ꎬ 李琳 ꎬ 苏连泰 ꎬ 等. 黑龙江省栽培大豆品种 ( 系 ) 异黄酮含量测定与主要性状相关性分析及灰色关联度分析 [ J]. 西华大学学报 ꎬ2011ꎬ30(6):73 76 [16] 张海军 ꎬ 王英 ꎬ 苏连泰 ꎬ 等. 东北地区栽培大豆品种子粒异黄酮含量分析及不同测定方法优化比较 [ J]. 大豆科学 ꎬ2011ꎬ 30(6):979 986 [17] 宋志峰 ꎬ 王丽 ꎬ 孟凡钢 ꎬ 等. 吉林省普通大豆品种 ( 系 ) 异黄酮含量分析 [J]. 大豆科学 ꎬ2009ꎬ28(6):1076 1080 [18] 李辉 ꎬ 戴常军 ꎬ 兰静 ꎬ 等. 黑龙江省栽培大豆异黄酮含量的初步分析 [J]. 中国粮油学报 ꎬ2007ꎬ22(1):38 40 [19] 刘广阳 ꎬ 齐宁 ꎬ 林红 ꎬ 等. 黑龙江省野生和栽培大豆异黄酮与其组分相关性分析 [ J]. 植物遗传资源学报 ꎬ2008ꎬ9 ( 3 ): 378 380 [20] 李炜 ꎬ 来永才 ꎬ 毕远林 ꎬ 等. 黑龙江省野生大豆高异黄酮新种质创新利用研究 Ⅱ 异黄酮含量与大豆品质相关性的分析 [J]. 大豆科学 ꎬ2007ꎬ26(3):319 321 [21] 林红 ꎬ 来永才 ꎬ 齐宁 ꎬ 等. 黑龙江省野生大豆栽培大豆高异黄酮种质资源筛选 [J]. 植物遗传资源学报 ꎬ2005ꎬ6(1):53 55 [22] 王春娥. 我国大豆资源豆腐豆乳得率和异黄酮含量的遗传变异及两类性状的 QTL 分析 [ D]. 南京 : 南京农业大学 ꎬ2008: 43 46 [23] 来永才 ꎬ 李炜 ꎬ 王庆祥 ꎬ 等. 黑龙江省野生大豆高异黄酮新种质创新利用 Ⅰ 异黄酮含量及与子粒相关性状的分析 [ J]. 大豆科学 ꎬ2006ꎬ25(4):414 416 [24] 张海军 ꎬ 苏连泰 ꎬ 李琳 ꎬ 等. 高效液相色谱法 ( HPLC) 测定大豆异黄酮含量的研究 [J]. 大豆科学 ꎬ2011ꎬ30(4):672 679 [25] 韩粉霞 ꎬ 丁安林 ꎬ 孙君明. 高异黄酮含量大豆新品种中豆 27 [J]. 大豆科学 ꎬ2002ꎬ21(3):231 233 [26] 梁慧珍 ꎬ 李卫东 ꎬ 方宣钧 ꎬ 等. 大豆异黄酮及其组分含量的配合力和杂种优势 [ J ]. 中国农业科学 ꎬ 2005ꎬ 38 ( 10 ): 2147 2152 欢迎订阅 «西北农林科技大学学报 ( 自然科学版 )» «西北农林科技大学学报 ( 自然科学版 )» 创刊于 1936 年 ꎬ 是西北地区创办最早的综合性农业科学学术期刊 ꎬ 其前身是 «西北农业大学学报»ꎮ 本刊立足国际科学发展前沿 ꎬ 兼顾理论探索与应用开发研究 ꎬ 面向社会 ꎬ 主要刊登农林科学 植物保护 资源环境科学 园艺科学 动物科学与医学 食品科学 生命科学 农田水利与建筑工程 机械与电子工程等方面的原创性学术研究成果 ꎮ 读者对象为国内外农林科技工作者 高等院校教师 研究生和农林管理干部 ꎮ 本刊现为中国自然科学核心期刊 全国综合性农业科学核心期刊 中国科学引文数据库核心期刊和中国科技核心期刊 ꎬ 论文被国内外多家权威性数据库和文摘期刊固定转载和收录 ꎮ 月刊 ꎬ 每月 10 日出版 ꎬ 国内外公开发行 ꎮ 每期定价 15 元 ꎬ 全年 180 元 ꎮ 邮发代号为 52-82ꎬ 全国各地邮局均可订阅 ꎬ 亦可直接向本刊编辑部订阅 ꎮ 国外总发行为中国国际图书贸易总公司 ( 北京 399 信箱 )ꎮ 地址 :(712100) 陕西杨凌西北农林科技大学北校区 40 号信箱电话 :029-87092511 E mail:xnxbz@ nwsuaf. edu. cn 网址 :http: / / www. xnxbz. net