发光免疫分析技术临床应用手册 Handbook of Luminescent Immunoassay in Clinic Application 第十二章. 常见传染性疾病的免疫检测 第一节. 病毒性肝炎 一. 甲型病毒性肝炎 1. 概述甲型病毒性肝炎是由甲型肝炎病毒 (HAV) 通过粪 - 口途径传播引起的急性传染性肝炎, 目前尚未发现有慢性化病例 儿童和青少年人群多发 起病急骤, 前驱期 1-5 天, 表现为发热, 全身不适, 类似感冒症状 ; 继而出现明显乏力, 厌油食, 恶心, 呕吐等, 因此常被误诊为胃肠炎 随后出现黄疸, 小便发黄等 2. 用于诊断甲型肝炎的免疫学指标 (1) 抗 -HAVIgM 其出现与临床症状及生化指标异常的时间顺序一致, 即发病后 1 周左右即可在血清中测出, 第 2 周达高峰 一般持续 8 周, 少数患者可达 6 个月以上 但个别病人起初阴性,2-3 周后方检出阳性 所以临床怀疑甲型肝炎而抗 -HAVIgM 阴性者, 应重复 1-2 次, 以免漏诊 抗 -HAVIgM 是早期诊断甲型肝炎特异性较高的指标, 且有简便, 快速的优点 抗 -IAVIgG 是既往感染的指标, 因其是保护性抗体, 可保护人体再次感染, 故可作为流行病学调查, 了解易感人群 (2) 抗 HAV-IgA IgA 型抗体又称分泌型抗体, 主要存在于泪眼, 唾液, 尿液, 胃液, 乳汁, 鼻腔分泌物中 胃液中的 IgA 可排入粪便, 因此在甲型肝炎患者粪便提取液中测得抗 HAV-IgA 可作为甲型肝炎的辅助诊断 此外, 粪便中 HAV 的检测和血清甲肝核糖核酸亦有诊断价值, 但需要一定的设备和技术, 故不作为常规检查项目 二. 乙型病毒性肝炎 1. 概述乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒 (HBV) 引起的肝脏炎性损害, 是我国当前流行最广泛 危害最严重的一种传染病 经济发展的水平较低, 卫生条件比较差是本病流行的基础 本病遍及全球, 其乙肝表面抗原携带率热带地区高于温带, 男性高于女性, 在未经免疫预防的国家里, 儿童携带率高于成人, 城市常高于农村 从人种上讲, 东方人, 即黄种人为高发人群 传染源主要是患者及乙肝病毒无症状携带者, 一般经血液 性接触和生活密切接触传播 易感者感染乙肝病毒后约经 6 周至 6 个月, 平均 3 个月发病 临床表现为乏力 食欲减退 恶心 呕吐 厌油 腹泻及腹胀, 部分病例有发热 黄疸 约有半数患者起病隐匿, 在查体中发现 实验室检查可发现肝功能异常, 血清乙肝表面抗原 乙肝病毒脱氧核糖核酸 乙肝病毒免疫球蛋白 M, 脱氧核糖
核酸聚合酶均为阳性 大部分乙型肝炎在急性期经治后能痊愈 ; 但尚有很多病例病程迁延或转为慢性, 其中一部分可发展为肝硬变甚至肝癌 极少数病例病程发展迅猛, 肝细胞出现大片坏死, 成为重型肝炎 ; 另有一些感染者则成为无症状的病毒携带者 一般来讲, 肝细胞受乙肝病毒入侵后, 乙肝病毒本身并不直接引起肝细胞病变 乙肝病毒只是利用肝细胞摄取的养料赖以生存并在肝细胞内复制 病毒复制的乙肝表面抗原 e 抗原和乙肝核心抗原都存在于肝细胞膜上, 从而激发人体的免疫系统, 造成自身免疫或免疫抑制 人体免疫系统在肝细胞膜上发生的免疫反应可造成肝细胞的损伤和破坏, 从而产生一系列临床症状, 其中部分人由此转化为慢性乙型肝炎 慢性肝炎以及肝硬化和肝癌是乙型肝炎对人类最常见 最主要 最严重的危害 慢性乙型肝炎被认为是持续 HBV 感染引起肝脏慢性坏死的一种炎症性疾病 其体检结果具备以下四点 : 一是乙肝表面抗原阳性大于 6 个月 ; 二是血清 HBV DNA 大于 10 5 copy/ml; 三是持续或间隙性 ALT/AST 水平升高 ; 四是肝活检提示慢性肝炎 2. 乙肝病毒感染常用的血清学标志乙肝病毒最常用的血清学标志是 : 乙肝表面抗原 (HBsAg) 乙肝表面抗体( 抗 -HBs) 乙肝 e 抗原 (HBeAg) 乙肝 e 抗体 ( 抗 -HBe) 乙肝核心抗体( 抗 -HBc) 以往将这些指标统称为两对半, 或乙肝病毒 5 项 (1) 乙肝表面抗原 (HBsAg) 表面抗原是乙肝病毒的外壳蛋白, 本身不具有传染性, 但它的出现常伴随乙肝病毒的存在, 所以它是已感染乙肝病毒的标志 它可存在于患者的血液 唾液 汗液 泪水 鼻咽分泌物 精液及阴道分泌物中 在感染乙肝病毒后 2~6 月, 即转移酶升高前 2~8 周时, 可在血清中测到乙肝表面抗原阳性 急性乙型肝炎患者大部分可在病程早期转阴, 而慢性乙型肝炎患者该指标可持续阳性 我国大约有 10% 的人群呈乙肝表面抗原阳性, 其中单纯乙肝表面抗原阳性并不伴有临床症状, 而且肝功能正常, 以及其它乙肝血清学指标正常者, 不能认为是肝炎患者, 也不具有传染性 ; 一般认为其处于乙肝病毒感染后的免疫耐受状态, 通常称之为健康携带者 HBsAg 具有不同的血清学亚型, 其共同的抗原决定簇为 a, 其中又可分为 a1 a2 a2; 同时还存在两组相互排斥的决定簇, 分别为 d 和 y,w 和 r; 而 w 又可分为 w1(a1) w2(a21) w3(23) w3(a3) 因此, 上述抗原决定簇的不同排列组合可形成 10 种血清亚型, 常见的有 adr adw ayr ayw 等 不同亚型的分布存在明显的地区和人群差异, 其中我国汉族地区以 adr 多见 ; 而少数民族地区以 ayw 多见 (2) 乙肝表面抗体 ( 抗 -HBs) 乙肝表面抗体是对乙肝病毒的保护性抗体, 常在乙型肝炎恢复后期出现阳性 此时乙肝表面抗原已转阴数月 血清中乙肝表面抗体滴度越高, 保护力越强, 持续时间也越长 再次感染乙肝病毒后, 乙肝表面抗体可在 2 周内滴度明显升高 但也有乙肝表面抗体阳性而又发生乙型肝炎者, 这种情况可能为不同亚型感染 90% 接受乙肝疫苗注射者的乙肝表面抗体可转阳 极少数情况下表面抗原和抗体均为阳性, 常见于不同亚型的乙肝病毒感染, 或者免疫功能低下的患者, 或是感染了 S 基因发生了变异的乙肝病毒 (3) 乙肝 e 抗原 (HBeAg) 在乙肝病毒感染后, 表面抗原阳性的同时, 或者其后数日可测得乙肝 e 抗原 ; 同时, 乙肝表面抗原在血液内的高峰期往往也是乙肝 e 抗原的高峰期 e 抗原在肝炎症状出现后 10 周内逐渐下降, 在乙肝表面
发光免疫分析技术临床应用手册 Handbook of Luminescent Immunoassay in Clinic Application 抗原转阴前可先转阴 如果乙肝 e 抗原持续阳性, 则可发展为慢性感染 乙肝 e 抗原阳性说明乙肝病毒在体内复制活跃, 传染性强 在慢性乙型肝炎患者中,e 抗原指标转阴而 e 抗体转阳过程中临床上可出现明显的肝功能恶化, 极个别情况下可见乙肝表面抗原阴性而乙肝 e 抗原为阳性 (4) 乙肝 e 抗体 ( 抗 -HBe) 在乙肝 e 抗原转阴后数月可出现乙肝 e 抗体阳性 e 抗体阳性预示患者体内病毒复制程度已降低或明显缓解, 因此其传染性已显著或相对降低 近年发现个别乙肝 e 抗体阳性, 但乙肝病毒核糖核酸亦为阳性者的病情迁延不愈, 这可能是感染了变异的乙肝病毒所致, 临床上不可忽视 (5) 乙肝核心抗体 ( 抗 -HBc) 通常在乙肝表面抗原出现后 3~5 周, 在典型肝炎症状出现前即可在血清中检出乙肝核心抗体 高滴度的乙肝核心抗体常标志乙肝病毒正在复制, 患者有传染性 ; 而低滴度的乙肝核心抗体表示乙肝病毒既往感染 乙肝核心抗体可持续存在数年至数十年 而抗 -HBcIgM 是 HBV 抗体系统中出现较早的抗体, 常继 HBsAg HBeAg 之后就可在血清中检测到, 一般在血中维持 6-18 个月 抗 -HBcIgM 在肝炎急性期呈高滴度, 是近期感染 HBV 的重要指标 慢性肝炎活动期患者血中, 其阳性率和效价亦高, 表明 HBV 在体内复制, 是传染性强的指标之一 (6) 乙肝常见免疫学指标的综合分析上述五项乙肝病毒标志物以前俗称两对半, 但现在乙肝病毒标志物已远远超过原来的范畴 ; 因此, 两对半概念已不适用于临床 目前, 乙型肝炎标志物包括了很多项指标, 各项指标的意义又错综复杂, 这些指标可组合成许多的阳性模式, 常使病人乃至某些医务人员感到困惑 以下简单介绍一下常见的数种模式及其临床意义 : A. 潜伏期 HBsAg 阳性, 或伴乙肝病毒脱氧核糖核酸聚合酶 (HBVDNAP) 和 HBeAg 阳性 B. 急性期 HBsAg HBeAg HBcAg HBVDNAP HBVDNA 前 S 蛋白均可阳性, 抗 -HBcIgM 高滴度, 而抗 -HBcIgG 滴度逐渐升高 C. 恢复期 HBsAg HBeAg HBcAg HBV DNA 前 S 蛋白等均转阴, 抗 -HBcIgM 滴度下降并消失, 抗 -HBcIgG 持续高滴度, 抗 -HBs 滴度逐渐升高, 抗 -HBe 可阳性 如上可知, 动态观察乙肝标志物有助于急性乙型肝炎的诊断 而临床上一般应用以下两项标准或其中一项诊断急性乙型肝炎 : A. HBsAg 滴度由阴性到高滴度阳性, 再由高滴度到低滴度, 消失后抗 -HBs 阳转 B. 急性期抗 -HBcIgM 滴度高水平, 而抗 -HBcIgG 阴性或低水平, 恢复期则相反
以下是多种乙肝血清学指标的出现模式及其可能的解释或诊断 : HBsAg 抗 -HBs HBeAg 抗 -HBe 抗 -HBc 可能的诊断或解释 常见模式 + - + - + 急性期 + - - + + 急性期 + - - - + 急性期 - - - + + 恢复期 - - - - + 恢复期 - + - + + 康复期 - + - - + 康复期 - + - - - 免疫接种 少见模式 + - - - - 急性期,HBsAg 阳性不伴随抗 - + - + - - HBc 阳性 + - - + - + + - - - + + + - - + + - + - HBsAg 与抗 -HBs 同时阳性, 在理论 + + - - + 上存在, 而实际中极少见 + + - + + + + + - + + + + + + - - + + - - - + + + - + + + - HBeAg 与抗 -HBe 同时阳性, 在理论 + - + + - 上存在, 而实际中极少见 - + + + + + - + + + - - + - - - + +++ - - 感染早期,HBeAg 阳性不伴随 - - + - + HBsAg 阳性 - + + - + - - - + - + - - + - 抗 -HBe 阳性不伴随抗 -HBc 阳性 - + - + - 以前, 俗称大三阳是指 HBsAg HBeAg 和抗 -HBc 三项指标阳性 ; 小三阳是指 HBsAg 抗-HBe 和抗 - HBc 三项指标阳性 以前认为大三阳表示乙肝病毒感染, 复制活跃, 有传染性 ; 而小三阳则表示肝炎病 情好转, 乙肝病毒复制停止, 没有传染性 最近, 大量研究表明慢性乙型肝炎病人出现由大三阳转向小 三阳并不意味着乙肝病毒复制完全停止, 大多数情况下只表示乙肝病毒复制减少 少数小三阳病人其血 清 HBVDNA 持续阳性, 病毒复制活跃, 病情较严重, 病情进展迅速, 多见于病毒变异 而急性乙型肝炎患 者若出现由大三阳转向小三阳, 则是预后良好的标志 在慢性乙型肝炎抗病毒疗法结束后, 患者血清由 大三阳变为小三阳, 也说明治疗取得了一定效果
发光免疫分析技术临床应用手册 Handbook of Luminescent Immunoassay in Clinic Application 值得一提的是, 上述指标的检测长期以来一直沿用酶联免疫吸法 近年来, 国外某些厂家已经使用了化学发光免疫分析技术, 极大地提高了检测灵敏度, 使一些弱阳性样品可以得到更准确的检验, 同时, 也使得上述指标的定量检测成为可能 因此, 在很大程度上弥补了以往酶联免疫吸附试剂的不足, 也为疗效评价和预后分析提供了更可靠的依据 三. 丙型病毒性肝炎 1. 概述丙型肝炎由丙型肝炎即 HCV 感染所致 1989 年由美国学者从受感染的黑猩猩体内分离出了 HCV 的基因片段 但目前尚未找到 HCV 的体外培养方法和小动物模型, 对其形态学和复制过程的研究也还很不完善 丙型肝炎传播途径与乙肝类似, 主要包括血液传播 性接触传播 母婴传播 日常生活接触等 其中以血液传播最为常见, 占输血后肝炎的 70% HCV 携带者在我国较 HBV 携带者为少, 在健康人群中抗 HCV 阳性率为 0.7%-3.1% 丙型肝炎具有一定的潜伏期, 短则几个月, 长则达十余年之久 其症状可较乙肝为轻, 多为亚临床无黄疸型, 转氨酶峰值较低, 因此大多数患者不易被发现 其转氨酶 (ALT) 升高往往长期持续不降或反复波动 其中短潜伏期丙肝病情较重, 症状突出, 常有黄疸, 但较少发展为慢性化 长潜伏期以及轻型或无黄疸型丙型肝炎易发展成慢性 丙肝病毒血症的类型包括以下几类 : (1) 急性感染的短暂病毒血症主要见于急性自限性丙型肝炎 应用 PCR 法可在 ALT 升高之前检出 HCV-RNA, 但病毒血症持续时间较短, 可仅数天或数月 而抗 -HCV 往往要在 ALT 升高后数天或数月才能检出 (2) 慢性感染的持续病毒血症 HCV-RNA 可在急性期 ALT 升高之前检出, 并且持续存在 按目前观察至少可存在 3 年以上 (3) 慢性感染的间歇病毒血症表现在感染早期出现病毒血症, 其后病毒血症消失数月 ; 几年以后又重新出现病毒血症 重新出现的病毒血症与急性阶段出现病毒血症相似, 一般在 ALT 升高之前出现 提示肝内病毒活动性复制 虽然丙肝临床症状一般相对较轻, 但易向慢性化转变, 且血清转氨酶常呈波浪起伏性升高 其中, 持续达 6 个月者占 57%, 而乙肝仅占 28%, 因此更为多见 而且长潜伏期 轻型或无黄疸型者更易发展为慢性 ; 女性较男性更易发展为慢性 ; 老年和高剂量丙肝病毒急性感染者易发展为慢性 ; 输血后丙肝较其它途径传播者更易发展为慢性 有报道称约 40%-50% 经血液途径感染丙肝的患者可发展成为慢性肝炎 其中慢性丙肝有 10%-20% 发生肝硬变, 其肝硬变产生平均约需要 20 年 ; 有时可在急性起病后几个月至三年之内, 在无症状的情况下, 隐匿性地演变为肝硬变 另有少数患者病情发展迅速, 预后不良 少数患者可逐渐恶变成为原发性肝细胞癌, 其平均需要 30 年 2. 常用丙型肝炎病毒感染的实验室检测方法 (1) 血清丙肝抗体 ( 抗 HCV)
目前常用的是所谓第二代试剂, 其使用了 HCV 的核心区 ( 即 C 区 ) 以及非结构区的 1-5 区 (NS1-NS5) 的基因重组表达或人工合成多肽抗原 ; 相对于使用 C100-3 重组表达抗原的第一代试剂盒, 灵敏度和特异性大大提高 其检测结果阳性的临床意义为丙肝病毒 HCV 感染 ; 抗 HCV 阳性持续六个月以上预示转为慢性丙肝的可能性较大 有一部分人感染 HCV 后, 临床症状表现不明显, 肝功能化验也正常, 但抗 HCV 阳性 对这一部分人必须进一步检查及观察, 因为单纯抗 HCV 阳性有可能是假阳性或丙肝已经痊愈者 有文献报道, 丙肝痊愈后, 个别病人其抗 HCV 阳性时间可达 9 年之久 因此最好是用逆转录聚合酶链反应 (RT/PCR) 检测病人血中 HCVRNA 如阴性, 即可继续观察其肝功能 ; 如肝功能持续正常, 则不必治疗 如肝功能异常并伴 HCVRNA 阳性则可考虑抗病毒治疗 上述抗体的检测长期以来一直沿用酶联免疫吸法 近年来, 国外某些厂家已经使用了化学发光免疫分析技术, 极大地提高了检测灵敏度, 使一些弱阳性样品可以得到更准确的检验, 同时, 也使得抗体的定量检测成为可能 因此, 在很大程度上弥补了以往酶联免疫吸附试剂的不足 (2) 逆转录聚合酶链反应 (RT/PCR) 由于 HCV 感染者体内病毒抗原的含量极低, 因此长期以来无法开展 HCV 抗原的临床检测 但早期感染时体内无法产生抗体, 因此就造成了所谓窗口期的存在, 即此时无法检测出病人是否感染 HCV 因此临床上选用 RT/PCR 法检测 HCV 特异的基因片段, 以此缩短窗口期 该法具有灵敏度高 出现阳性时间早 持续时间长的特点, 因此能提高诊断率和确定 HCV 复制情况, 并判断传染性强弱 但是这种方法不仅技术要求和检验成本高 时间长, 而且只能在专门的实验室里进行, 结果有时也不太稳定 特别是极易造成实验室污染, 从而出现大量假阳性, 因此需要极其严格的实验室管理和苛刻的实验室条件 同时, 由于标本及其前处理试剂对于聚合反应的干扰, 也常常出现假阴性 因此 目前尚未建立国际公认的标准化试剂盒 (3) 病毒抗原检测近年来, 随着免疫检测技术水平的提高, 国外已经建立了测定血清 HCV 核心抗原的方法 这对于早期发现 HCV 感染及评价预后都具有较大意义 但其技术难点在于 HCV 抗原在血清中以免疫复合物的形式存在, 因此检测前必须将其解离, 同时又不能影响后续的免疫检测过程 近年来, 国外某些厂家已经使用了化学发光免疫分析技术, 极大地提高了检测灵敏度, 并使得抗原的定量检测成为可能
发光免疫分析技术临床应用手册 Handbook of Luminescent Immunoassay in Clinic Application 第二节.HIV 感染及艾滋病 (AIDS) 一. 概述艾滋病, 既获得性免疫缺陷综合症 (AIDS), 是由人类免疫缺陷病毒 (HIV) 引起的一种免疫缺陷性疾病 到 2002 年 6 月底全球已有 6000 万人感染了 HIV, 其中 2000 万人已被艾滋病夺去生命 艾滋病正以每天 1.4 万人受感染的速度扩大流行 目前该病尚无法治愈, 也无有效疫苗 截止到 2003 年底我国 HIV 感染者已近 84 万, 并进入了快速增长期 据有关专家估计, 如不采取积极有效的控制措施, 到 2010 年我国 HIV 感染者将达 1000 万, 因此形势十分严峻 HIV 为人类免疫缺陷病毒的英文缩写, 为逆转录病毒, 其遗传信息存在于两个相同的 RNA 单链模板中 该病毒进入人体后能选择性地侵犯有 CD4+ 受体的淋巴细胞, 以 CD4+T 淋巴细胞为主 当 HIV 的包膜蛋白 gp120 与 CD4+T 淋巴细胞表面的 CD4 受体结合后, 在 gp41 透膜蛋白的协助下,HIV 的膜与细胞膜相融合, 病毒进入细胞内 当病毒进入细胞内后迅速脱去外壳, 为进一步复制作好准备 最近研究表明,HIV 进入细胞内除 CD4 受体外, 还需要细胞表面的蛋白酶同 gp120 的 V3 环发生相互作用才能完成 HIV 病毒在宿主细胞开始复制时, 首先二条 RNA 在病毒逆转录酶的作用下逆转为 DNA 再以 DNA 为模板, 在 DNA 多聚酶的作用下复制 DNA, 这些 DNA 部分存留在细胞浆内, 进行低水平复制 另一部分与宿主细胞核染色质的 DNA 整合在一起, 成为前病毒, 使感染进入潜伏期 经过 2-10 年的潜伏性感染阶段, 当受染细胞被激活时, 前病毒 DNA 在转录酶作用下转录成 RNA,RNA 再翻译成蛋白质 经过装配后形成大量的新病毒颗粒释放出来后, 继续攻击其他 CD4+T 淋巴细胞 大量的 CD4+T 淋巴细胞被 HIV 攻击后, 造成的细胞功能被损害和大量破坏是 AIDS 患者免疫功能缺陷的原因 HIV 感染 CD4+T 淋巴细胞后, 首先引起细胞功能的障碍 表现为对可溶性抗原, 如破伤风毒素的识别和反应存在缺陷, 但对有丝分裂原植物血凝素 (PHA) 的反应仍然正常 ; 并伴随细胞因子产生减少,IL- 2R 表达减少和对 B 淋巴细胞提供辅助能力降低等 当 HIV 病毒在宿主细胞内大量繁殖时, 可导致细胞的溶解和破裂 尤其是 HIV 在细胞内复制后, 以芽生方式释出时可引起细胞膜的损伤 HIV 还可抑制细胞膜磷脂的合成从而影响细胞膜的功能, 导致细胞病变 HIV 还可以感染骨髓干细胞导致 CD4+T 淋巴细胞减少 当受 HIV 感染的 CD4+T 淋巴细胞表面存在 gp120 表达后, 它可以与未感染的 CD4+T 淋巴细胞 CD4 分子结合形成融合细胞, 从而改变细胞膜的通透性, 引起细胞的溶解和破坏 游离的 gp120 也可以与未感染的 CD4+T 淋巴细胞结合, 作为抗体介导依赖性细胞毒作用的抗原, 使 CD4+T 淋巴细胞成为靶细胞, 从而被杀伤细胞攻击而损伤 gp41 透膜蛋白能抑制有丝分裂原和抗原刺激淋巴细胞的增殖反应, 从而使 CD4+T 淋巴细胞减少 因此,HIV 感染后一般首先出现 CD4+T 淋巴细胞轻度至中度降低 但该细胞总数可持续数年不变, 说明病毒为免疫应答所抑制 历经一段时间后,CD4+T 细胞逐渐进行性下降, 表明病毒逐渐逃脱了免疫应答的控制 当 CD4+T 淋巴细胞一旦下降至 0.2 10 9 /L, 即 200/μL 或更低时, 就可出现机会性感染 然而,HIV 感染所致免疫功能的损害, 不仅是 CD4+T 淋巴细胞被破坏, 其他免疫细胞也不同程的受到影响 其中, 单核巨噬细胞因其表面也具有 CD4 受体, 所以也易被 HIV 侵犯, 但其感染率远远低于 CD4+T 淋巴细胞 研究发现被 HIV 感染的单核巨噬细胞有播散 HIV 感染的作用, 即它可以携带 HIV 进入中枢神经系统 在脑细胞中受 HIV 感染的主要是单核巨噬细胞类, 如小胶质细胞等 ; 而 HIV 感染的单核巨噬细胞可释放毒性因子损害神经系统 当一定数量的单核巨噬细胞功能受损时, 就会导致机体抗 HIV 感染和
其它感染的能力降低 并且 CD4+T 淋巴细胞功能受损, 也和单核巨噬细胞功能损害有关 另外,HIV 还可损伤 CD8+T 淋巴细胞 一般来讲,CD8+T 淋巴细胞有对 HIV 特异的细胞溶解能力 因此在 HIV 感染初期, 具有抑制病毒复制和传播作用 ; 而当 CD8+T 淋巴细胞功能受损时 HIV 感染者病情发展 在 HIV 感染的进展期,HIV-1 特异的细胞毒 T 淋巴细胞 (CTL) 的数目进行性减少, 说明 CD8+T 淋巴细胞对 HIV 特异的细胞溶解活力的丧失, 可能与 CTL 减少有部分关系 HIV 选择性变异和 CD4+T 淋巴细胞的破坏也是促使 HIV 特异性细胞溶解活力丧失的部分原因 HIV 感染后可通过多克隆抗体激活 B 淋巴细胞, 使外周血液中 B 淋巴细胞数量增加, 分泌免疫球蛋白, 使 IgG 和 IgM 的水平增高 ; 同时 B 淋巴细胞对新抗原刺激的反应性降低 因此, 在 HIV 感染进展时, 化脓性感染增加 ; 而对流感 A 病毒疫苗和乙肝疫苗的抗体反应降低 HIV 感染导致 B 淋巴细胞多源活化的机制不明, 可能是由于缺乏正常 T 细胞的调节, 或 HIV 直接激活 B 淋巴细胞 人体的免疫系统是抗外部感染的最后防线, 许多病源体感染人体后通过人体的细胞免疫和体液免疫而消灭 同样, 机体产生的抗体可以中和游离 HIV 病毒以及已和细胞结合而尚未进入细胞内的 HIV 颗粒 自然杀伤细胞 (NK) 和杀伤细胞 (K 细胞 ) 通过抗体依赖性细胞毒性作用能杀伤和溶解 HIV 感染的细胞 因此, 机体的细胞免疫和体液免疫作用可在一段时间内控制 HIV 的复制及扩散 但是, 由于病毒的变异和重组, 可以逃脱免疫监视, 而不能被机体的免疫系统彻底清除 当机体的免疫系统被进一步破坏时, 在某些触发因素的作用下, 使 HIV 大量复制和播散 随着免疫系统的损害及 HIV 的变异, 机体的免疫系统最终对 HIV 的感染无能为力, 从而导致 AIDS 的发生 HIV 感染后相当长时间内 HIV 在体内保持极低水平的复制, 这就导致 AIDS 无症状期持续时间很长 原因之一是由于细胞免疫和体液免疫可以降低病毒复制, 原因之二是 HIV 进入 CD4+T 淋巴细胞后, 部分成为潜伏型 许多研究表明, 一些细胞因子和其他病毒感染能激活 HIV 的复制和表达 有报道认为糖皮质激素和白介素 IL-4,IL-6 和 IL-10 等细胞因子能协同增强 HIV 的复制 肿瘤坏死因子 (TNF)α β 和 IL- 1 亦能导致 HIV 的表达, 其中特别是 TNF-α 其他病毒的各种基因产物也能促进 HIV 高水平复制, 而且有些病毒还能和 HIV-1 协同破坏 CD4+T 淋巴细胞 所以在临床上 AIDS 患者常常合并感染巨细胞病毒, 疱疹病毒,EB 病毒, 人类 T 淋巴细胞白血病病毒等, 而这些感染又促使病情变化 在 HIV 感染者中卡波济氏肉瘤,B 细胞淋巴瘤, 何杰金病以及某些肿瘤发生率升高, 这和机体免疫功能破坏直接相关, 但可能不是唯一的原因 例如 HIV 感染者出现 B 细胞淋巴瘤可能与 EBV 病毒感染有关 ; 而且 HIV 并不能直接引起肿瘤, 原因是在肿瘤细胞 DNA 内并不能证明有病毒序列存在 总之,HIV 感染后的发病机理可归纳如下 : 1. HIV 侵入人体后首先与细胞表面含有 CD4 受体的 CD4+T 淋巴细胞结合, 进入细胞进行复制, 部分整合于细胞染色体 DNA 中成为潜伏型 2. 机体细胞免疫和体液免疫对 HIV 的抵抗作用使感染初期的 HIV 低水平复制 3. 在其它因素的作用下, 潜伏的 HIV 被激活而大量复制, 广泛侵入 CD4+T 淋巴细胞 使 CD4+T 淋巴细胞 单核巨噬细胞 B 淋巴细胞 CD8+T 淋巴细胞和 NK 细胞等功能受损, 最后导致整个免疫功能缺陷, 从而导致一系列顽固性机会感染和肿瘤的发生 二. 常见 HIV 感染的检测指标及临床意义 HIV 一进入人体, 这个人就成为 HIV 感染者 首先是处于潜伏期, 以后逐渐发展成为艾滋病病人 从
发光免疫分析技术临床应用手册 Handbook of Luminescent Immunoassay in Clinic Application 感染 HIV 到成为艾滋病病人, 大约要经过 5-10 年的时间 这期间感染者没有任何症状, 只有通过化验检查才能作出诊断 而且由于艾滋病是一种免疫系统疾病, 所以当感染者发展成艾滋病病人时, 会表现出多种多样的症状, 因此, 仅凭临床表现不能判断是否感染 HIV, 必需经过实验室检验才能确定 而且,HIV 感染的诊断是艾滋病预防控制工作的重要组成部分, 只有发现传染源才能更有效地控制艾滋病传播 通过检测 HIV 的特异性抗体 抗原 核酸或病毒分离培养可确立 HIV 感染 WHO 和我国卫生部推荐使用的 HIV 感染诊断方法是血清学抗体检测 1. HIV 感染检测的特殊性 HIV 感染的检测不同于其他病原微生物检测, 要求十分严格, 任何错误的诊断, 包括假阳性或假阴性, 都会对被检者产生十分重要的影响 因此, 必须严格按照国家制定的 艾滋病检测工作管理办法 和 艾滋病检测技术规范 检测的实验室须经当地卫生行政部门审批合格 ; 从事艾滋病检测工作的技术人员须接受专门的技术培训, 并获合格证书 ; 诊断试剂应选择高敏感和高特异的, 筛查呈阳性反应的需用特异性更强的方法 同时, 整个实验过程应有严格的质量保证体系 2.HIV 抗体筛查目前国外用于 HIV 抗体筛查的方法很多, 根据检测原理不同分为酶联免疫吸附法 凝集法和层析法, 并可对血液 唾液和尿液标本进行常规或快速检测 在实际工作中常用的有酶联免疫吸附试验 ( ELISA) 明胶凝集试验和各种快速诊断试剂 1985 年问世的第一代检测试剂以全病毒裂解物为包被抗原, 并采用灵敏度和特异性较差的间接法 ; 而目前广泛使用的第三代检测试剂已采用基因重组表达或人工合成多肽抗原为包被和标记物, 同时采用了有着良好敏感性和特异性的双抗原夹心技术, 使得窗口期由 10 周缩短至 3-4 周 其检测亚型包括 HIV-1 HIV-2 和 HIV-1 型的 O 亚型 为避免窗口期传染, 荷兰 法国等国已研制出第四代以重组的多肽抗原和抗 P24 抗体包被的双抗原 / 抗体夹心法复合试剂盒, 可同时检测抗原和抗体, 使窗口期缩短了 2-3 周, 但其临床应用价值有待评估 目前我国已经建立了采供血机构和各医疗卫生机构的常规筛查检测 ; 在尚未建立艾滋病筛查实验室的偏远地区或大医院急诊手术前, 也要由经过培训的技术人员在规定的场所用快速试剂进行血液筛查 筛查实验如呈阴性反应即报告 HIV 抗体阴性 ; 对呈阳性反应的标本, 应当用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的试剂进行重复检测 如两种试剂复测均呈阴性反应, 则报告 HIV 抗体阴性 ; 如均呈阳性反应, 或一阴一阳, 需送艾滋病确认实验室进行确认 目前作为 HIV 感染初筛实验的抗体检测主要使用酶联免疫 (ELISA) 法, 其检测信号是酶标记物导致的颜色变化 由于该方法的灵敏度较低, 加上 HIV 本身的变异和感染病人窗口期的存在, 其检出率一直不能令人满意 ; 事实上, 这已经成为全球范围内困扰 HIV 感染早期诊断的主要技术问题之一 近年来, 国外某些厂家使用了化学发光免疫分析技术, 极大地提高了检测灵敏度, 使一些弱阳性样品可以得到更准确的检验, 因此在很大程度上弥补了上述不足 3.HIV 抗体确认试验筛查呈阳性反应的标本由于存在假阳性的可能, 必须做确认试验 国际上有 3 种确认试验方法, 包括免疫印迹试验 条带免疫试验及免疫荧光试验, 目前以免疫印迹试验最为常用 虽然确认试验的敏感性和特异性均很高, 但由于确认试验的费用较高, 所以在检测 HIV 抗体时首先用价格较低的试验方法进行初筛, 从而缩小确认试验的使用范围节省社会资源 确认实验所用的免疫印迹试剂有 HIV-1/2 混合型和单一型 一般先用 HIV-1/2 混合型试剂进行检测, 无 HIV 抗体特异带出现的报告 HIV 抗体阴性 ; 出现 HIV 抗体特异带, 符合 HIV-1 抗体阳性判定标准,
则报告 HIV-1 抗体阳性 如出现 HIV-2 型的特异性条带, 需用 HIV-2 型免疫印迹试剂再做单一的 HIV-2 型抗体确认试验 呈阴性反应报告 HIV-2 抗体阴性 ; 呈阳性反应的则报告 HIV-2 抗体血清学阳性 如需鉴别应进行核酸序列分析 如果出现 HIV 抗体特异带, 但带型不足以判定为阳性, 则判为 HIV 抗体不确定 对 HIV 抗体不确定者应按要求进行随访, 必要时可做 HIV-1P24 抗原或核酸测定, 但检测结果只能作为辅助诊断依据, 确认报告要依据血清学随访结果 比较遗憾的是, 目前国产和进口的确认试剂均沿用灵敏度较低的显色法, 而并没有采用灵敏度更高的化学发光法 而且迄今为止均采用肉眼目测的方法判断实验结果 其缺点不仅在于无法完全排除结果判定中的主观因素影响 ; 同时需要对实验人员的素质和培训有特别的要求, 从而大大限制了这一技术的推广 ; 而且无法对其实验数据进行非常准确的量化分析 因此在很大程度上丢失了许多极其有用的疾病相关信息, 使该确认实验的临床价值无法得到更充分的发挥 4.HIV 抗体检测的质量控制由于目前唾液检测试剂的敏感性和尿液检测试剂的特异性明显低于血液检测试剂, 故我国规定抗体筛查和确认试剂只能用于血液标本检测 在所有实验中必须包含有内部对照质控血清和外部对照质控血清 内部对照质控血清指试剂盒内提供的阳性和阴性对照血清 内部对照是质量控制的基础, 每次检测必须使用内部对照, 而且只能在同批号的试剂盒中使用 外部对照质控血清是由实验室设置的弱阳性对照, 一般以该试剂盒临界值 (Cut off) 的 2-3 倍为宜 该血清可到专门单位购买, 也可由实验室自己制备 制备方法是 : 收集 HIV 抗体阳性和阴性血清 56 30 分钟灭活,3000rpm 离心 15 分钟取上清 弱阳性对照可以用 HIV 抗体阴性的健康人血清梯度稀释 HIV 抗体强阳性血清, 或用试剂盒内提供的阳性和阴性对照血清混合并标定后得到 一般按年使用量配制, 用 0.2μ 滤膜过滤除菌后按一周实验用量分装 分类 标记并封口,-20 冻存 该血清不可反复冻融, 融化后应存放 2-8, 一周内使用 原则上每次实验必须使用外部对照质控血清, 以便监控本次实验的重复性和稳定性, 同时了解各批试剂盒的批间差异, 绘制质量控制图 需要指出的是, 检测 HIV 抗体虽然在一般情况下能够反映感染是否发生 ; 然而由于感染 HIV 后存在窗口期, 在这一阶段虽然存在 HIV 感染但无法检出抗体 此外, 感染 HIV 后体内抗体的产生是一个渐进的过程, 即最初抗体水平很低, 并且只有某些抗体能够检出, 不足以确定最终的结果 因此在这些情况下, HIV 抗体检测的阴性结果并不能排除存在 HIV 感染的可能, 应过一段 2-3 个月后再次采血进行检测 5.HIV-1P24 抗原检测 HIV 感染人体后有一段窗口期, 在这段时期病毒抗体不能被检出, 但可以检测到病毒相关抗原或分离到病毒 故在窗口期检测抗原是早期辅助诊断和缩短窗口期的一种方法, 尤其在感染早期和发病期抗原检出率相对较高 HIV-1P24 抗原检测还适用于 HIV-1 阳性母亲所生婴儿的早期辅助鉴别诊断 ; 以及第四代 HIV-1 抗原 / 抗体 ELISA 试剂检测呈阳性反应 但 HIV-1 抗体确认阴性者的辅助诊断, 以及监测病程进展和抗病毒治疗效果 HIV-1P24 抗原检测一般用 ELISA 双抗体夹心法 其阳性结果也必须经过中和试验确认, 而且该结果仅作为 HIV 感染的辅助诊断依据, 不能据此确诊 HIV-1P24 抗原检测阴性只表示在本试验中无反应, 不能排除 HIV 感染 近年来, 国外某些厂家已经使用了化学发光免疫分析技术, 极大地提高了检测灵敏度, 并使得抗原的定量检测成为可能
发光免疫分析技术临床应用手册 Handbook of Luminescent Immunoassay in Clinic Application 6.HIV 核酸检测 HIV 核酸检测, 通常是检测 HIVRNA 以前只能定性检测血液中是否存在病毒核酸, 而目前的技术可定量检测血液中病毒复制水平 HIV 核酸定性检测可用于 HIV 感染的辅助诊断, 如窗口期辅助诊断 病程监控 指导治疗方案及疗效测定 预测疾病进程等 通常使用 PCR 或 RT-PCR 技术, 并使用分子生物学实验室通用的扩增试剂, 其引物可来自文献或自行设计, 但应尽量覆盖所有或常见的毒株, 也可使用复合引物 HIV 核酸定量检测多用于监测 HIV 感染者的病程进展和抗病毒治疗效果 目前常用的测定方法有逆转录 PCR 实验 (RT-PCR) 非温度循环核酸序列扩增实验(NASBA) 分支 DNA 探针杂交实验 (Comb- DNA) 等 由于目前可用于不同定量方法的统一标准品尚未问世, 因此不同定量方法结果之间还无法直接进行比较 建议同一病人治疗前后用同一方法进行 HIV 定量检测 值得注意的是,HIV 核酸定性检测阴性, 只可报告本次实验结果阴性 ; 但不能排除 HIV 感染 ; 而 HIV 核酸检测阳性仅可作为诊断 HIV 感染的辅助指标, 不能单独用于 HIV 感染的诊断 而且, 报告检测结果时还应注明反应条件和所使用的引物序列 ; 报告 HIV 核酸定量检测结果时还应按照仪器读数报告结果, 并注明使用的试验方法 样品种类和样品量 当测定结果小于最低检测限时, 应注明最低检测限水平 而低于最低检测限的结果不能排除 HIV 感染 7.CD4+T 淋巴细胞计数 CD4+T 淋巴细胞计数是艾滋病诊断 疾病分期 制定抗病毒治疗和预防机会性感染方案的实验室标准指标 美国疾病控制中心 (CDC)1993 年修订的青年 / 成人艾滋病监测病例分类及扩大的诊断标准是 : 无症状 HIV 感染期 (A1 A2): CD4 绝对数 500/mm 3 或 CD4 百分率 29% 有症状感染期 (B1 B2): CD4 绝对数 200-499/mm 3 或 CD4 百分率 14-28% AIDS 期 (A3 B3 C1-3): CD4 绝对数 <200/mm 3 或 CD4 百分率 <14% 另外,CD4+T 淋巴细胞计数也是与病毒载量相配合预测疾病进程的可靠指标 这两个实验可以相互独立预测艾滋病临床过程和生存期 检测 CD4+ 细胞数的标准方法是流式细胞仪 影响 CD4+ 细胞数的因素有季节 昼夜差 某些并发症和皮质醇类药物等 ; 而性别 成人年龄 紧张 生理性应激和妊娠对 CD4+ 细胞数影响不大 由于 CD4+ 百分数受变异影响较绝对数小, 故 CD4+ 细胞百分率有时比绝对数对临床更有意义 8. 病毒变异和耐药性的测定随着艾滋病治疗的广泛开展, 病毒变异和耐药株正在不断出现, 甚至对一个药物的耐药可引起多种药物的交叉耐药 因此近年来各国相继建立起病毒变异和耐药的测试方法 目前常用的方法包括基因型 HIV 耐药测试和表型 HIV 耐药测试 表型 HIV 耐药性测试方法能直接测出 HIV-1 对药物的敏感度, 并能揭示事先存在或交叉的耐药情况 ; 因此有利于指导 HIV-1 感染者有效地用药 其原理是比较已知重组病毒和病人标本中病毒的蛋白酶与逆转录酶活性, 并分析其不同药物作用下 IC 50 值的相差倍数, 一般达 5 10 倍以上为阳性 这种方法的最大优点是可以获得各种药物耐药度的数据 ; 但不足的是试验耗时长 昂贵 技术要求高 基因型 HIV 耐药性测试方法是通过核酸序列分析或杂交技术确定病毒变异的位点, 并参考已有数据库与不同亚型进行比较 在确认变异后, 与既往耐药或交叉耐药研究比较, 间接地估计药物耐药情况 其特点是简单快速, 费用低 缺点是仅能确认所分离到的基因变异, 但无法指出药物耐药的程度
第三节. 严重急性呼吸综合征 一. 概述自从 2002 年 11 月以来, 在我国广东省一部分地区发生了传染性非典型肺炎, 而后部分省市也相继出现大量病例, 世界其他国家也有报告 该疾病不同于已往由肺炎支原体 肺炎衣原体 军团菌及某些呼吸道病毒所致的非典型肺炎 临床该病表现为发热伴干咳, 血中白细胞不高或降低, 胸部 x 线检查肺部有不同程度的片状 斑片状浸润性阴影或呈网状样改变 部分患者病情较重 进展快, 危害大 世界卫生组织 (WHO) 将此类病例称为严重急性呼吸综合征 (SARS) 根据 2003 年 7 月 11 日的资料, 全世界已有 31 个国家报告有 SARS 病例 全球已发生 8437 例临床诊断病例, 其中 813 例死亡,7452 例康复 中国报告的数字分别为发病 5327 例 死亡 348 例 康复 4941 例 SARS 的传染源是患者, 平均潜伏期约 6.4 天, 一般认为潜伏期不具有传染性 该病的传播途径主要是呼吸道飞沫传播, 或者是通过直接或间接的接触传播, 也有通过胃肠道传播的可能, 人群普通易感 最初 SARS 的死亡率被认为接近 5%, 但是,WHO 告戒说死亡率很可能达到 10% 而且本病目前无特效治疗药物 2003 年 3 月 22 日中国香港病毒实验室电镜检查发现冠状病毒样颗粒, 大小约 70 nm 美国从泰国患者标本得到的细胞病变产物中也发现冠状病毒样颗粒 此后经过全球科学家团结协作和高效率的工作, 最终确定其病原体为一种新型冠状病毒, 并迅速完成了病毒的全基因组核苷酸序列测定 WHO 于 2003 年 4 月 16 日在日内瓦召开了关于传染性非典型肺炎病原学研讨会, 并最终将该病毒命名为严重急性呼吸综合征相关冠状病毒 (SARS-Associated Coronavirus), 即 SARS 冠状病毒 (SARS-CoV) 二.SARS 冠状病毒感染的相关实验室检验由于 SARS 是一种新型疾病, 人们对它还缺乏认识, 因此诊断 SARS 患者最初使用的是临床排除法 也就是说, 先用其它已知的肺炎解释该患者的可疑症状并进行相应的治疗, 如果发现该解释无法自圆其说, 或者治疗无效 ; 特别是该病人在两周内曾经与其它 SARS 病人接触, 或者出现传染给别人的现象, 那么这个患者就可以被确诊 最初把 SARS 称为传染性非典型性肺炎正是基于这种诊断方法而言的 而 SARS 作为一种急性呼吸道传染病, 目前又没有疫苗和特效治疗药物, 因此尽早准确地筛查出病人并及时隔离治疗, 是预防和控制疾病流行的关键 所以, 快速 灵敏的实验室检查是非常重要的技术手段 目前国际 国内研制出多种针对 SARS-CoV 检测试剂, 甚至基因芯片的诊断方法也已问世 但是由于对病毒本身的了解尚不够深入, 病毒的许多生物学和分子生物学特性尚不十分清楚, 目前的诊断方法在特异性或敏感性等方面均存在不同程度的缺陷, 因此证实或排除 SARS 诊断的实验室试验结果判断标准尚待确定 因此,SARS 诊断仍依赖于临床和流行病学的发现, 即无其他原因的急性发热性疾病伴呼吸道症状, 以及与 SARS 疑似病例或临床诊断病例及其呼吸道分泌物和其他体液的接触史 由于 SARS 是急性呼吸系统传播疾病, 所以为该病的预防和控制带来一定难度 因此虽然目前世界范围的疫情己经得到控制, 但是不能放松警惕以防止以后冬春季节发生新的 SARS 流行 所以建立简便易行的检测方法, 从而实现病毒感染的早期诊断仍然刻不容缓 目前已建立的检测方法如下 :
发光免疫分析技术临床应用手册 Handbook of Luminescent Immunoassay in Clinic Application 1. 基因片段 (PCR) 聚合酶链反应, 即 PCR 可在各种标本, 如血液 粪便 呼吸道分泌物或身体组织中检测 SARS- CoV 的遗传物质 引物是 PCR 试验的关键片段, 由 WHO 网络实验室在 WHO 网址上公布 现有的 PCR 试验特异性很高, 但缺乏敏感性 这意味着阴性试验结果不能排除患者体内 SARS 病毒的存在 此外, 在缺乏实验室质量控制的情况下, 实验室中样品污染可导致假阳性结果 PCR 的阳性结果有很高的特异性, 意味着样品中有 SARS-CoV 的遗传物质 (RNA) 但这并不意味着有活病毒存在, 也不意味着存在大量活病毒足以感染其他人 而 SARS-CoV PCR 结果阴性可有下列原因 : (1) 患者没有 SARS-CoV 感染, 疾病由另一种感染因子或非感染性原因引起 (2) 试验结果不正确, 即假阴性, 现有的试验需要进一步提高敏感性 (3) 样品不存在病毒或其遗传物质 ; 由于病毒和其遗传物质在样品中存在的时间较短, 因此, 可能没有在恰当的时间采集样品 ; 而这取决于待检样品的类型 2. 抗体与 PCR 检测相比, 血清学检测的方法属于一种晚期诊断 这主要是由于机体感染病毒后抗体的产生需要一定的时间 目前的研究表明, 发病 5 天开始出现冠状病毒 IgM 抗体,l0 天达最高点然后逐渐下降 IgG 抗体从发病 l0 天开始出现并逐渐升高, 约 30 天达到最高并维持较高水平 目前已建立的的抗体检测方法有 : (1) 酶联免疫吸附 (ELISA): 此试验检测 SARS 患者血清中 IgM 和 IgG 抗体混合物, 发病后 21 天能可靠地检出阳性结果 因此不能用于检出早期病例 (2) 免疫荧光测定 (IFA): 此试验检测 SARS 患者血清中 IgM 抗体, 亦可用于检测 IgG, 一般发病后 10 天能检出阳性结果 虽然这是一种较可靠的试验, 但需要免疫荧光显微镜及固定在玻片上的 SARS 病毒裂解物 总之, 抗体检测的阳性结果表明以往存在 SARS-CoV 感染 ; 而从急性期血清到恢复期血清血清抗体阳转, 或抗体滴度 4 倍升高表明近期感染 发病后 21 天仍未检出抗体表明未发生 SARS-CoV 感染 3. 病毒培养来自 SARS 病例样品中的病毒可通过接种细胞培养和病毒增殖检测到 一旦分离到了病毒, 应做进一步鉴别以证实是否是 SARS 病毒 但细胞培养的条件要求非常苛刻, 一般临床单位的实验室无法承担 细胞培养的阳性结果表明在所测试的样品中有活的 SARS 冠状病毒的存在 而阴性的细胞培养结果并不能排除 SARS 冠状病毒的存在, 其原因类似于 PCR( 见上 ) 4. 病毒抗原传染性疾病一般可以通过检测抗原或抗体的办法进行血清学诊断 由于抗原在人体内出现较早, 因此可以实现早期诊断, 这对于象 SARS 这样的急性传染病意义重大 而抗体的出现需要近一个月的时间, 因此无法用于早期诊断 虽然 SARS 等病原体的感染也可以通过检测其基因片段来实现早期诊断, 但是这种方法不仅技术要求和检验成本高 时间长, 而且只能在专门的实验室里进行, 结果有时也不太稳定 2004 年 6 月我国研制成功了全球第一个 SARS 冠状病毒抗原检测试剂盒并获得新药证书和生产文号 这标志着我们在世界上率先建立了直接检测患者血清内 SARS 病毒蛋白的免疫分析技术, 从而为更早期发现 SARS 病例提供了一个快速 简便 廉价的技术手段
这一技术采用了免疫分析中灵敏度和稳定性最好的夹心法, 即所谓的三明治法 它是通过患者的血液与两种针对 SARS 病毒的抗体相遇, 并使其中的 SARS 病毒抗原与上述抗体发生结合反应 同时, 还采用了化学发光 - 光子计数法检测免疫结合反应 它是上世纪九十年代后期逐渐在国际上普及的新技术, 具有无放射性污染 灵敏度高 线性范围宽 检测速度快的优点 临床标本的研究实验证明, 该方法十天内的早期诊断率接近 100%, 并且其阳性结果的出现时机大大早于抗体, 综合分析其主要技术特点如下 : (1) 与基因技术 (PCR) 比较 : 操作简便 技术要求低, 试剂成本低 重复性好 (2) 与间接法的抗体检测试剂盒比较 : 既可实现早期诊断, 也无样品来源的种属限制, 故可用于查找自然疫源地及野生动物宿主 (3) 与同类酶联免疫试剂盒比较 : 灵敏度高 ( 最低检测限 3 空斑单位 / 样品 ) 样品用量少(50 微升 ), 耗时短 (2 小时 ) (4) 整个技术平台和原材料均实现国产化, 因此试剂及检测仪器成本均较低 (5) 样品可加热灭活后检测, 安全性较好, 适合基层推广 (6) 线性范围宽, 易于实现定量检测 以下附图表示血清学确诊, 即抗体阳性病例在不同发病期的系列血清抗原检测结果变化规律 显示 6-10 天阳性率可达 100% 而下方附图则表示临床诊断病例不同发病期的血清抗原及抗体检测结果变化规律 显示血清抗原检 出期大大早于抗体