C:\Users\brendanx\Documents\GroupedStudies1 在 这 个 新 文 件 夹 中, 您 会 发 现 里 面 有 个 子 文 件 夹 : Heart Failure files from a heart failure study in a salt sensit

Skyline 处 理 分 组 研 究 数 据 第 1 部 分 : 用 于 方 法 调 整 的 免 标 记 区 分 法 靶 向 蛋 白 质 组 学 作 为 一 个 检 测 方 法 已 受 到 越 来 越 广 泛 的 关 注, 其 主 要 优 势 表 现 在 跨 生 物 组 间 蛋 白 质 和 多 肽 表 达 的 差 异 性 分 析 Skyline 最 初 由 美 国 国 家 癌 症 研 究 所 (NCI) 癌 症 临 床 蛋 白 质 组 学 技 术 评 估 (CPTAC) 项 目 资 助 建 立, 因 为 它 致 力 于 显 示 靶 向 蛋 白 质 组 学 可 以 有 效 地 应 用 于 疾 病 生 物 信 号 的 检 测 和 可 靠 性 验 证 在 本 教 程 中, 您 将 使 用 Skyline 用 于 分 析 一 组 SRM 数 据 这 组 数 据 来 源 于 一 个 条 件 控 制 的 盐 敏 感 型 老 鼠 心 力 衰 竭 实 验 这 个 实 验 通 过 检 测 一 系 列 文 献 中 报 道 的 与 心 力 衰 竭 有 关 的 潜 在 蛋 白, 来 分 析 疾 病 组 和 健 康 组 中 血 浆 蛋 白 表 达 的 差 异 这 个 实 验 监 控 了 49 个 蛋 白 质 中 的 137 个 肽 段 在 42 次 LC-MS/MS 测 试 过 程 中 的 表 达 状 况 当 您 熟 悉 了 本 教 程 讲 述 的 数 据 处 理 和 视 图 技 术 后, 您 将 能 够 更 轻 松 地 管 理 和 处 理 更 大 型 数 据 ( 更 多 的 实 验 组, 更 多 的 目 标 蛋 白 ) 而 如 若 没 有 本 教 程, 您 很 可 能 会 在 处 理 更 小 数 据 集 时 仍 感 到 茫 然 失 措 本 教 程 由 以 下 部 分 组 成 : 开 始 方 法 优 化 后 的 差 异 分 析 无 参 考 标 准 下 多 平 行 实 验 组 数 据 处 理 的 设 置 预 定 的 SRM 和 峰 截 短 开 始 多 平 行 实 验 组 数 据 处 理 全 球 标 准 化 标 准 平 行 实 验 组 数 据 处 理 ( 续 ) 基 于 重 复 注 释 的 统 计 分 析 问 题 峰 的 肽 段 注 释 Skyline 初 始 多 平 行 数 据 检 查 结 论 开 始 开 始 本 教 程 前, 请 先 下 载 下 列 ZIP 文 件 : https://skyline.gs.washington.edu/tutorials/groupedstudies1.zip 将 其 中 的 文 件 解 压 到 任 意 文 件 夹, 如 : C:\Users\brendanx\Documents 这 将 创 建 一 个 新 文 件 夹 : 1

C:\Users\brendanx\Documents\GroupedStudies1 在 这 个 新 文 件 夹 中, 您 会 发 现 里 面 有 个 子 文 件 夹 : Heart Failure files from a heart failure study in a salt sensitive rat mode l, provided by the labs of Michael J. Toth and Michael J. MacCoss. 按 接 下 来 的 内 容, 我 们 将 学 习 如 何 处 理 这 类 研 究 的 数 据, 以 及 更 好 地 理 解 蛋 白 质 / 肽 段 研 究 的 目 标 以 及 整 体 的 数 据 质 量 分 析 方 法 调 整 后 的 差 异 分 析 在 您 刚 刚 创 建 的 GroupedStudies1 文 件 夹 中, Heart Failure 子 文 件 夹 中 的 数 据 收 集 于 M accoss 实 验 室 在 研 究 靶 向 方 法 优 化 教 程 中 方 法 的 应 用 潜 力 和 限 制 因 素 的 过 程 中 这 些 数 据 出 于 某 些 原 因 从 来 没 有 被 正 式 发 表 当 您 使 用 Skyline 来 处 理 收 集 的 实 验 数 据 时, 您 会 对 其 中 的 一 些 原 因 有 更 直 观 的 理 解 然 而, 从 这 个 试 验 和 其 他 类 似 的 实 验 中 衍 生 出 的 许 多 理 念, 已 经 被 独 立 发 表 了 1 在 最 开 始 的 研 究 中, 我 们 依 据 文 献 中 的 报 道, 选 取 了 109 个 潜 在 的 与 心 力 衰 竭 有 关 的 蛋 白 质 这 些 蛋 白 质 的 信 息 被 添 加 进 了 Skyline 文 档 其 中 一 些 蛋 白 质 的 添 加 方 法 是 导 入 蛋 白 质 序 列 的 FAS TA 格 式 文 本, 并 允 许 Skyline 执 行 电 脑 模 拟 的 胰 蛋 白 酶 解 在 Skyline 中 的 参 数 中, 设 置 包 括 在 全 位 点 裂 解 后 所 有 长 度 在 6 至 30 个 氨 基 酸 之 间 的 肽 段 而 其 它 蛋 白 质, 电 脑 模 拟 的 酶 消 化 在 S kyline 软 件 外 执 行, 然 后 把 酶 消 化 后 的 肽 段 直 接 复 制 到 Skyline 文 档 中 ( 详 见 靶 向 方 法 编 辑 教 程 ) 通 过 这 两 种 方 法, 我 们 创 建 了 一 份 带 有 2,165 个 目 标 肽 段 的 文 档 对 于 每 一 个 双 电 荷 前 体, 其 对 应 的 单 电 荷 离 子 体 均 包 含 在 考 虑 范 围 这 个 初 始 的 穷 尽 法 包 括 了 12,194 个 离 子 对, 并 通 过 非 常 规 SRM 方 法 用 于 在 大 鼠 血 浆 样 本 的 测 试 这 种 初 始 分 析 仅 进 行 过 一 次, 包 含 151 次 单 独 的 质 谱 测 试 生 成 的 原 始 数 据 文 件 被 导 入 了 Skyline, 用 于 确 定 血 浆 中 那 些 不 需 要 进 行 后 续 样 品 处 理 而 能 够 直 接 被 检 测 的 目 标 肽 段 在 充 分 全 梯 度 洗 脱 后, 原 始 的 2,165 个 目 标 肽 段 中 仅 有 135 个 ( 来 自 49 个 蛋 白 质 ) 有 目 标 y 离 子 峰 (2 个 为 3 离 子 5 个 4 离 子 27 个 5 离 子 以 及 103 个 6 离 子 ) 其 衍 生 的 782 离 子 对 则 用 于 定 量 测 试 每 次 实 验 的 总 长 为 90 分 钟, 并 且 设 定 目 标 峰 的 停 留 时 间 窗 口 为 5 分 钟 我 们 使 用 这 种 方 法 测 试 了 14 只 盐 敏 感 性 大 鼠 (7 只 是 健 康 的,7 只 通 过 高 盐 诱 导 产 生 心 力 衰 竭 ) 的 血 浆 消 化 产 物 每 个 样 品 均 进 行 了 三 次 平 行 实 验, 总 共 42 次 测 试 这 些 测 试 结 果 将 会 在 本 教 程 中 被 依 次 分 析 其 目 的 是 确 定 这 135 个 可 检 测 到 的 肽 段 中 哪 些 在 两 组 实 验 中 表 现 出 了 表 达 差 异, 从 而 可 能 能 够 被 用 作 未 来 实 验 中 的 生 物 标 记 体 此 教 程 的 总 体 目 标 是 确 认 通 过 使 用 SRM 的 靶 向 分 析 能 够 获 得 有 意 义 的 科 学 结 论 这 个 分 析 并 不 需 要 事 先 具 有 丰 富 的 关 于 目 标 蛋 白 质 或 肽 段 背 景 知 识, 也 不 要 求 具 有 稳 定 同 位 素 标 记 的 肽 段 作 为 参 考 2

Verification: Skyline refinement and method development Refinement Detection Proteins: 109 Peptides: 2,165 Transitions: 12,194 151 unscheduled methods Refinement Differentiation Proteins: 49 Peptides: 135 Transitions: 780 1 scheduled method (x 42 injection) Validation Investigation 1 scheduled method 图 1: 盐 敏 感 性 大 鼠 心 力 衰 竭 研 究 中 靶 向 方 法 调 整 的 原 理 示 意 图, 包 含 检 测 (Detction) 和 差 异 分 析 (Differentiation) 两 个 阶 段 要 开 始 处 理 从 差 异 分 析 阶 段 收 集 的 数 据, 请 先 打 开 以 下 文 件 : GroupedStudies1\Heart Failure\raw 子 文 件 夹 中 的 Rat_plasma.sky 文 档 通 过 观 查 Skyline 窗 口 右 下 角 的 显 示 栏, 您 会 看 到 您 打 开 的 文 件 包 括 49 个 蛋 白 质 137 个 肽 段 和 789 个 离 子 对 这 并 不 是 通 过 图 1 应 得 出 的 最 理 想 情 况 ( 来 自 一 份 未 发 表 的 手 稿 中 的 分 析 结 论 ) 虽 然 如 此, 介 理 该 文 档 同 时 包 括 了 一 份 额 外 的 肽 段 列 表 ( 在 文 档 底 部, 命 名 为 S ), 其 中 包 括 了 3 个 全 球 标 准 化 肽 段 它 们 旨 在 减 小 测 量 中 系 统 方 差 对 肽 段 样 品 的 影 响 对 于 这 一 点, 您 会 在 稍 后 的 过 程 了 解 更 清 楚 并 且, 从 某 种 角 度 讲, 通 过 上 述 的 方 法, 这 个 文 件 一 定 丢 失 了 单 肽 段 的 蛋 白 质 您 将 会 发 现, 一 些 目 标 肽 段 能 够 在 图 库 中 找 到 相 匹 配 的 谱 图 您 可 以 在 目 标 视 图 中 查 看 相 关 结 果 在 右 下 角 肽 段 图 标 中, 有 谱 图 线 标 记 的 ( ) 表 示 有 相 应 匹 配 的 谱 图, 没 有 的 ( ) 则 表 示 没 有 匹 配 谱 图 这 些 谱 图 来 自 两 个 不 同 的 图 库 : 一 个 是 NIST, 而 另 一 个 来 自 全 球 蛋 白 质 组 机 构 (GPM) 您 可 以 按 以 下 步 骤 探 索 其 覆 盖 范 围 : 3

在 视 图 菜 单 单 击 文 档 网 格 在 文 档 网 格 窗 口 左 上 角 的 视 图 选 项 卡 中, 单 击 母 离 子 在 文 档 网 格 窗 口 中 将 滑 条 向 右 侧 滑 动, 找 到 库 名 称 栏, 双 击 以 降 序 排 序 现 在, 您 可 以 向 下 滚 动 就 可 以 看 到 有 相 应 匹 配 谱 图 的 肽 段 数 量 ( 总 共 80, 其 中 49 来 自 于 NIST,31 来 源 于 GPM) 请 注 意, 所 选 单 元 的 行 编 号 显 示 在 网 格 上 方 的 工 具 栏 中 在 当 前 的 例 子 中, 您 将 会 了 解 一 些 与 这 个 实 验 相 关 的 的 基 础 知 识 无 参 考 标 准 下 多 平 行 实 验 组 数 据 处 理 的 设 置 开 始 处 理 14 个 受 试 对 象 在 三 平 行 实 验 中 采 集 的 SRM 数 据, 请 执 行 以 下 操 作 : 关 闭 文 档 网 格 分 类 在 文 件 菜 单 上 选 择 导 入, 然 后 单 击 结 果 单 击 导 入 结 果 分 类 上 的 确 定 按 钮, 导 入 单 一 测 试 的 平 行 数 据 在 导 入 结 果 文 件 选 项 中, 单 击 第 一 个 原 始 数 据 文 件 ( D_102_REP1.raw ), 按 住 Shift 键 并 单 击 最 后 一 行 数 据 文 件 ( H_162_REP3.raw ), 以 全 选 GroupedStudies1\Heart Failure\raw 文 件 夹 中 的 所 有 原 始 数 据 文 件 单 击 打 开 按 钮 文 件 将 开 始 加 载,Skyline 会 显 示 一 个 如 下 的 进 度 窗 口 : 4

按 以 下 操 作 可 在 Skyline 导 入 SRM 色 谱 图 时, 继 续 准 备 其 它 数 据 处 理 操 作 : 单 击 隐 藏 按 钮 关 闭 库 匹 配 视 图 单 击 并 拖 拽 目 标 视 图 的 标 题, 直 到 看 到 追 踪 鼠 标 光 标 的 悬 浮 蓝 色 矩 形 松 开 鼠 标 左 键, 让 目 标 视 图 悬 浮 在 Skyline 窗 口 上 方 在 视 图 菜 单, 选 择 停 留 时 间 并 单 击 重 复 测 定 比 较 (F8) 单 击 并 拖 拽 停 留 时 间 的 标 题 视 图 直 至 看 到 对 接 指 示 器 拖 拽 光 标 至 底 部 对 接 指 示 器, 看 到 一 个 蓝 色 的 矩 形 填 满 了 Skyline 窗 口 的 底 部, 如 下 所 示 : 5

松 开 鼠 标 左 键 来 对 接 停 留 时 间 视 图 在 视 图 菜 单 选 择 峰 面 积 并 单 击 重 复 测 定 比 较 (F7) 拖 拽 峰 面 积 视 图 直 到 鼠 标 光 标 位 于 一 个 对 接 指 示 器 内, 蓝 色 矩 形 说 明 它 将 与 峰 面 积 视 图 共 享 底 边 6

松 开 鼠 标 左 键 来 对 接 峰 面 积 视 图 拖 拽 目 标 视 图 直 到 鼠 标 光 标 位 于 一 个 对 接 指 示 器 内, 蓝 色 矩 形 说 明 它 将 对 接 Skyline 窗 口 左 边 缘 7

关 闭 悬 浮 在 主 Skyline 窗 口 外 左 边 的 其 他 任 何 窗 口 在 视 图 菜 单 选 择 排 列 图 并 单 击 分 组 式 在 排 列 分 组 图 分 类 中 的 分 组 窗 格 字 段 输 入 3 单 击 图 形 的 分 组 展 示 选 项 在 排 序 顺 序 下 拉 列 表 中 选 择 文 档 此 分 组 窗 口 应 如 下 图 所 示 : 8

单 击 确 定 按 钮 最 大 化 Skyline 主 窗 口 选 择 文 档 中 的 第 一 个 肽 段 您 的 Skyline 窗 口 现 在 应 看 起 来 像 这 样 : 注 意 : 此 图 片 取 自 分 辨 率 1920x1080 的 24 英 寸 显 示 屏 如 果 您 正 使 用 本 教 程 的 电 子 版, 您 可 以 将 其 放 大 到 200% 或 更 多 来 查 看 此 图 片 本 教 程 之 后 的 内 容, 会 返 回 至 使 用 更 适 合 8½ x 11 英 寸 9

页 面 排 版 的 图 片 许 多 Skyline 培 训 使 用 的 是 1024x768 的 屏 幕 分 辨 率, 而 如 果 您 使 用 更 大 的 显 示 屏 会 有 更 好 Skyline 的 使 用 体 验 查 看 第 一 个 肽 段 K.GILAADESVGSMAK.R [28, 41] 的 停 留 时 间 视 图, 您 会 看 到 整 合 分 布 不 是 非 常 一 致 大 部 分 考 查 的 峰 洗 脱 时 间 约 为 19 分 钟 但 将 近 三 分 之 一 的 (12) 洗 脱 时 间 接 近 22 分 钟 您 可 以 也 会 注 意 到 在 这 幅 绘 图 中 有 许 多 缺 失 的 色 条 带 : 这 些 是 因 为 Skyline 仍 在 调 整 模 式 在 这 个 模 式 时,Skyline 会 尝 试 决 定 哪 些 峰 的 形 状 和 峰 点 时 间 足 够 相 似, 可 以 考 虑 进 行 共 洗 脱 而 条 带 缺 失 则 说 明, 在 积 分 的 范 围 内 所 有 受 监 控 的 离 子 对 的 峰 彼 此 的 匹 配 底 很 低 在 本 实 验 的 这 个 阶 段, 您 应 从 调 整 模 式 ( 即 您 可 以 选 择 测 量 哪 些 离 子 对 ) 转 变 到 定 量 模 式 ( 即 Skyline 对 所 有 峰 执 行 整 合 以 减 少 测 量 的 方 差 ) 您 按 以 下 步 骤 更 改 这 些 模 式 : 在 设 置 菜 单 上 单 击 整 合 所 有 之 后, 视 图 将 会 被 更 改 为 如 下 所 示 : 10

但 此 肽 段 的 整 合 度 仍 然 很 差 尽 管 在 19 分 钟 左 右 的 峰 显 示 更 优, 但 仍 很 难 说 它 们 是 由 来 源 于 同 一 单 独 肽 段 再 者, 任 何 整 合 调 整 也 不 太 可 能 生 成 一 个 可 以 在 所 有 运 行 测 试 中 保 持 一 致 的 独 立 肽 段 所 以, 您 不 应 浪 费 时 间 尝 试 做 更 多 的 调 整, 而 应 : 删 除 第 一 个 肽 段 预 定 的 SRM 和 峰 截 短 仅 通 过 查 看 第 二 个 肽 段 的 停 留 时 间 图, 您 便 能 看 出, 它 的 整 合 一 致 性 更 高 但 您 仍 能 看 出, 所 有 离 子 对 的 峰 顶 点 ( 条 带 中 的 水 平 线 ) 并 没 有 很 一 致 如 果 您 查 看 其 中 一 些 色 谱 图, 您 会 看 出 这 些 峰 的 强 度 也 是 从 中 到 低, 参 差 不 齐 的 11

如 果 您 没 有 看 到 上 方 显 示 的 顺 序, 即 所 有 患 病 组 的 平 行 测 定 (D_) 在 左, 所 有 健 康 组 的 平 行 测 定 (H_) 在 右, 则 执 行 以 下 步 骤 : 右 键 单 击 停 留 时 间 视 图, 选 择 顺 序 并 单 击 文 档 在 进 行 接 下 来 的 分 析 前, 对 您 正 查 看 的 绘 图 做 最 后 一 次 调 整 右 键 单 击 峰 面 积 视 图, 选 择 归 一 化 并 单 击 总 数 这 样, 峰 面 积 绘 图 会 从 如 下 : 改 变 成 这 样 : 这 样 您 便 可 能 一 眼 看 在 出 多 个 运 行 中 相 对 离 子 丰 度 值 的 差 异, 并 将 这 些 结 合 到 您 从 停 留 时 间 视 图 获 取 的 信 息 中 从 这 些 信 息 中, 您 可 能 注 意 到 了 D_103_REP3 和 D_108_REP2 有 很 显 著 的 差 异, 12

且 H_162_REP3 与 其 它 所 有 平 行 测 定 结 果 均 有 差 别 但 请 注 意, 当 只 使 用 停 留 时 间 视 图 时, 只 有 D_108_REP2 样 本 看 起 来 比 较 可 疑 按 以 下 步 骤 可 检 查 和 更 正 这 些 峰 : 单 击 峰 面 积 视 图 中 的 D_103_REP3 条 带 这 将 会 激 活 这 个 峰 的 色 谱 图, 显 示 如 下 : 而 正 确 整 合 的 峰 的 图 形 更 应 该 像 这 样 : 13

由 于 预 先 设 定 的 采 集 窗 口 不 能 捕 获 到 完 整 的 峰 洗 脱 图, 所 以 Skyline 拣 选 了 错 误 的 峰 但 您 仍 能 查 看 到 正 确 的 峰 型, 直 到 约 30.2 分 钟 峰 洗 脱 结 束 这 被 称 为 截 短 的 峰 但 是, 您 仍 可 以 通 过 校 正 这 个 肽 段 的 积 分 整 合 来 使 用 这 个 不 完 整 的 峰, 具 体 步 骤 如 下 所 述 : 在 大 约 30.4 分 钟 处, 即 紧 跟 在 截 短 的 峰 起 始 点, 单 击 x 轴 下 方 并 拖 拽 向 左 拖 拽 直 到 积 分 边 界 停 止 移 动, 然 后 松 开 鼠 标 左 键 单 击 停 留 时 间 视 图 上 的 D_108_REP2 条 带, 激 活 其 色 谱 图 图 形 在 约 30.5 分 钟 处 单 击 图 形 x 轴 下 方, 并 拖 拽 最 左 处 单 击 停 留 时 间 视 图 上 的 D_162_REP3 条 带, 激 活 其 色 谱 图 图 形 D_162_REP3 的 峰 也 被 截 短 但 正 如 在 几 个 其 他 情 况 中 一 样,Skyline 已 正 确 地 选 择 了 它 通 过 仔 细 查 看 停 留 时 间 绘 图, 您 也 许 能 够 推 断 出 峰 截 短 的 情 况 仔 细 注 意 条 带 的 宽 度 以 及 水 平 线 与 条 带 边 的 距 离 像 这 样 非 标 记 数 据 的 处 理, 峰 截 短 是 一 个 需 考 虑 的 重 要 问 题 在 同 位 素 标 记 的 参 考 肽 段 中, 峰 的 每 一 个 点 都 提 供 了 有 效 的 轻 重 肽 段 母 离 子 间 比 例 截 短 峰 本 身 的 精 确 性 将 无 法 保 证, 但 轻 重 肽 段 之 间 的 比 例 数 据 仍 然 是 有 效 的 而 相 对 地, 若 使 用 非 标 记 数 据, 您 不 能 将 截 短 的 峰 算 作 肽 段 的 一 个 有 效 测 量 您 只 能 用 缺 失 的 数 据 计 算 差 分 统 计 分 析, 或 者 完 全 在 分 析 中 完 全 忽 略 此 肽 段 Skyli ne 记 录 截 短 的 峰 的 目 的 在 于 使 其 仍 可 能 用 于 其 它 下 游 分 析 工 具 Skyline 对 截 短 的 峰 定 义 为, 该 峰 的 其 中 一 个 积 分 边 界 处 在 色 谱 图 的 端 点, 且 此 端 点 的 峰 强 度 比 另 一 积 分 边 界 的 强 度 高 出 超 过 1% 的 峰 高 值 按 以 下 步 骤 可 查 看 其 它 被 Skyline 确 认 为 截 短 的 峰 的 积 分 整 合 峰 : 14

在 编 辑 菜 单 上 单 击 查 找 (ctrl-f) 清 空 查 找 内 容 字 段 在 方 位 中 选 择 向 下 单 击 显 示 高 级 按 钮, 如 果 高 级 选 项 未 事 先 显 示 出 来 单 击 勾 选 截 短 的 峰, 同 时 取 消 勾 选 任 何 其 它 任 何 已 被 选 择 的 选 项 15

此 查 找 分 类 应 看 起 来 如 下 图 所 示 : 单 击 查 找 所 有 按 钮 单 击 关 闭 按 钮 Skyline 会 显 示 一 份 被 截 短 过 的 母 离 子 和 子 离 子 列 表, 前 三 个 是 您 刚 刚 查 看 过 的 您 可 以 双 击 任 何 行 来 查 看 相 应 的 色 谱 图 图 形 您 也 可 以 使 用 文 档 网 格 创 建 一 份 包 含 所 有 截 短 的 峰 的 所 有 母 离 子 的 列 表, 具 体 步 骤 如 下 : 16

在 视 图 菜 单 单 击 文 档 网 格 在 文 档 网 格 视 图 的 视 图 菜 单 单 击 母 离 子 在 文 档 网 格 视 图 的 视 图 菜 单 单 击 自 定 义 视 图 在 视 图 名 称 字 段, 输 入 截 短 的 母 子 离 在 右 侧 列 表, 选 择 除 了 前 两 个 ( 母 离 子 和 肽 段 ) 的 所 有 栏 名 称 ( 使 用 单 击 和 按 shift 单 击 ) 单 击 右 侧 附 近 的 按 钮 来 删 除 除 了 前 两 栏 的 所 有 栏 勾 选 左 边 目 录 树 中 的 重 复 测 定 展 开 树 目 录 来 勾 选 蛋 白 质 > 肽 段 > 母 离 子 > 母 离 子 结 果 > 截 尾 计 数 自 定 义 视 图 窗 口 应 看 起 来 像 : 在 右 边 列 表 中 双 击 截 尾 计 数 单 击 过 滤 器 选 项 卡 单 击 添 加 按 钮 从 操 作 下 拉 列 表 选 择 大 于 在 值 字 段 输 入 0 17

自 定 义 视 图 窗 口 应 看 起 来 像 : 单 击 确 定 按 钮 单 击 两 次 截 尾 计 数 栏 标 题 进 行 降 序 排 序 文 档 网 格 将 显 示 222 个 被 Skyline 自 动 选 择 的 截 短 的 峰 的 数 据 : 18

若 要 查 看 这 些 峰 : 在 肽 段 列 中 单 击 DFATVYVDAVK 单 击 肽 段 的 所 有 重 复 测 定 链 接 Skyline 会 激 活 类 似 如 下 的 色 谱 图 图 形 : 关 闭 文 档 网 格 关 闭 查 找 结 果 视 图 19

选 择 第 二 个 肽 段 R.LGGEEVSVACK.L [237, 247] 开 始 多 平 行 实 验 组 数 据 处 理 肽 段 LGGEEVSVACK 看 起 来 比 我 们 目 前 已 看 到 的 其 他 两 个 肽 段 好 很 多 在 所 有 平 行 实 验 组 中, 其 停 留 时 间 相 当 稳 定, 所 有 离 子 对 的 水 平 峰 顶 点 线 也 几 乎 彼 此 匹 配 在 峰 面 积 视 图 中 显 示 的 相 对 离 子 丰 度 值 也 看 起 来 相 对 稳 定 您 可 能 会 注 意 到, 这 个 肽 段 在 标 准 图 库 有 一 个 对 应 的 谱 图, 且 这 个 标 准 谱 图 的 相 对 离 子 丰 度 值 ( 显 示 在 绘 图 中 最 左 边 的 条 带 ) 与 测 量 峰 的 丰 度 值 基 本 相 似 按 以 下 步 骤 可 更 好 地 理 解 肽 段 与 其 相 应 的 图 库 谱 图 的 匹 配 程 度 : 右 键 单 击 峰 面 积 视 图, 选 择 归 一 化 并 单 击 无 移 动 分 割 条, 让 峰 面 积 视 图 占 据 屏 幕 的 大 部 分 宽 度 如 果 您 的 屏 幕 空 间 有 限, 则 单 击 并 拖 拽 患 病 组 (D_) 平 行 数 据 窗 口 的 缩 放 矩 形 框 Skyline 将 向 您 显 示 标 准 谱 图 峰 与 实 验 测 量 峰 的 面 积 的 相 似 度, 范 围 从 1( 最 好 ) 至 0( 最 差 ) 20

如 要 返 回 峰 面 积 视 图 之 前 的 状 态, 请 按 以 下 步 骤 执 行 : 如 果 您 使 用 了 缩 放, 则 单 击 右 键 并 选 择 取 消 所 有 缩 放 / 全 景 单 击 右 键, 选 择 归 一 化 并 单 击 总 数 现 在, 按 以 下 步 骤 来 更 直 观 地 查 看 这 些 峰 的 色 谱 图 : 在 视 图 菜 单 选 择 自 动 缩 放 并 单 击 最 佳 峰 值 (F11) 单 击 目 标 视 图 的 重 复 测 定 下 拉 列 表 使 用 向 下 箭 头 键 来 浏 览 多 个 色 谱 图 图 形 您 可 能 注 意 到, 一 些 离 子 对 在 这 个 主 峰 的 边 缘 显 示 出 了 信 号, 但 与 其 它 峰 并 没 有 很 好 地 匹 配 度 21

在 大 约 13.1 分 钟 左 右,y5 和 y6 频 繁 地 出 现 信 号, 但 很 明 显 这 些 不 是 来 自 同 一 个 肽 段 当 在 积 分 边 界 内 出 现 像 这 样 干 扰 信 号 时, 定 量 测 量 出 错 的 机 率 会 更 大 在 真 实 的 定 量 数 据 处 理 中, 您 可 能 需 要 考 虑 这 个 肽 段 是 否 需 要 所 有 5 个 离 子 对 22

但 仅 就 当 前 的 教 程, 我 们 可 继 续 进 行 下 一 个 肽 段 的 处 理 您 会 在 那 里 看 到 高 强 度 无 干 扰 的 所 有 7 个 离 子 对 的 共 洗 脱 峰 相 对 离 子 丰 度 值 亦 高 度 一 致 y3 中 的 峰 面 积 比 在 标 准 库 谱 图 中 看 到 的 更 强 这 可 能 是 因 为 离 子 在 三 重 四 极 杆 仪 器 中 会 产 生 二 次 碎 片, 而 在 使 用 共 振 激 发 的 离 子 阱 仪 器 中, 这 是 不 会 发 生 的 我 们 的 标 准 谱 图 来 自 于 一 个 NIST 公 共 库, 而 我 们 无 法 查 询 至 生 成 它 的 仪 器 类 型 的 信 息 23

我 们 一 眼 即 可 看 出 这 个 肽 段 积 分 整 合 结 果 非 常 好, 因 此, 您 可 以 不 再 进 一 步 查 看 而 直 接 进 入 到 下 一 个 肽 段 R.GSYNLQDLLAQAK.L [378, 390] 的 分 析 在 这 个 肽 段 中, 停 留 时 间 和 峰 面 积 视 图 均 显 示 出 了 问 题 按 以 下 步 骤 可 了 解 这 些 测 量 的 问 题 在 哪 : 在 视 图 菜 单, 选 择 自 动 缩 放 并 单 击 无 (Shift-F11) 使 用 目 标 视 图 中 的 重 复 测 定 下 拉 列 表, 来 查 看 最 开 始 的 几 个 平 行 数 据, 一 直 到 第 一 个 问 题 处 D_103_REP3 在 前 5 次 平 行 测 定 中, 目 标 峰 在 32.5 至 33.5 分 钟 左 右, 在 所 有 5 个 离 子 对 上 均 有 信 号 但 在 35 分 钟 左 右, 您 还 能 看 到 另 一 个 峰, 它 的 信 号 几 乎 集 中 在 y4 和 y5 离 子 对 这 个 峰 肯 定 是 由 另 一 个 肽 段 造 成 的 在 这 样 的 情 况 下, 与 目 标 肽 段 不 匹 配 的 干 扰 信 息 会 导 致 您 看 到 的 色 谱 图 风 景 含 有 额 外 的 内 容 在 D_103_REP3 中, 您 会 看 到 整 合 峰 出 现 在 33.9 分 钟, 信 号 几 乎 全 部 集 中 在 y4 和 y5, 但 它 左 边 却 没 有 其 它 候 选 峰 24

在 此 情 况 中, 调 度 窗 口 将 无 法 捕 获 到 候 选 肽 段 的 任 何 信 号 要 移 除 谱 图 中 错 误 的 峰, 可 按 以 下 步 骤 : 在 色 谱 图 中 单 击 右 键, 单 击 删 除 峰 值 并 选 择 所 有 这 样 在 峰 面 积 图 形 中 会 留 出 一 个 空 白 处 继 续 查 看 余 下 的 色 谱 图, 您 会 看 到 这 个 情 况 会 重 复 出 现 几 次 您 需 删 除 所 有 问 题 峰 同 时, 您 将 甚 至 会 看 到 出 现 峰 截 短 的 现 象 当 您 查 看 到 H_148_REP2 时, 您 会 看 到 这 样 的 情 况, 即 Skyline 选 中 了 33.9 分 钟 的 错 误 峰, 但 目 标 峰 的 部 分 在 谱 图 中 仍 是 可 见 的 25

您 可 以 按 它 作 为 截 短 的 峰 的 情 况, 并 按 照 之 前 所 述 的 方 法 进 行 相 应 处 理 ( 单 击 并 拖 拽 x 轴 下 方 ) 然 后, 您 会 得 到 如 下 所 示 的 一 幅 峰 面 积 示 图 : 26

以 及 一 幅 如 下 所 示 的 停 留 时 间 示 图 : 继 续 到 肽 段 R.DIPVNPMCIYR.S [46, 56], 您 会 发 现, 在 整 个 5 分 钟 的 调 度 窗 口 中, 所 有 整 合 峰 中 没 有 匹 配 一 致 的 信 号 这 样, 您 便 可 直 接 删 除 此 肽 段 蛋 白 质 NP_001012027 中 接 下 来 的 三 个 肽 段 都 没 什 么 大 问 题, 停 留 时 间 和 相 对 离 子 丰 度 值 均 相 对 稳 定 您 可 能 会 觉 得, 在 停 留 时 间 中 观 察 到 的 方 差 没 有 预 期 中 的 稳 定 尤 其 是 当 按 逻 辑 顺 序 来 运 行 测 试 时, 这 种 情 况 会 经 常 发 生 当 前 的 顺 序 是 我 们 将 所 有 平 行 测 定 数 据 导 入 分 析 文 档 所 造 成 的 结 果 对 于 这 种 性 质 的 研 究, 一 个 实 用 的 作 法 是 先 列 出 所 有 患 病 组 的 受 试 对 象, 然 后 是 所 有 健 康 组 的 受 试 对 象 每 一 个 受 试 对 象 的 平 行 数 据 需 要 被 合 并 在 一 起 通 过 这 样, 肽 段 TSDQIHFFFAK 的 停 留 时 间 会 如 下 图 所 示 : 27

但 您 也 可 以 按 照 在 仪 器 中 采 集 的 顺 序 查 看 运 行, 这 有 时 也 会 非 常 有 帮 助 操 作 步 骤 如 下 所 述 : 右 键 单 击 停 留 时 间 图 形, 单 击 排 序 依 据 并 选 择 采 集 时 间 图 形 会 变 为 如 下 所 示 : 现 在 这 个 停 留 时 间 看 起 来 会 稍 微 稳 定 一 些 如 果 您 现 在 选 择 下 两 个 肽 段 (LQPLDFK SQLPGIIAEG R), 则 您 会 看 到 个 模 式 的 一 致 性 如 何 下 一 个 肽 段 DFATVYVDAVK 有 一 些 峰 被 截 短 现 在 您 应 该 能 很 快 地 对 其 改 正, 通 过 单 击 峰 面 积 视 图 中 匹 配 差 的 条 带, 然 后 在 相 应 色 谱 图 图 形 上 单 击 并 拖 拽 x 轴 下 方 有 一 些 峰 的 色 谱 图 看 起 来 噪 声 很 多, 下 方 图 示 中 右 边 的 图 形 便 是 这 样 一 个 例 子 这 是 因 为 只 有 肽 段 峰 的 右 边 缘 被 测 量, 而 更 高 强 度 的 部 分 缺 失 了 28

在 这 样 的 情 况 下, 您 一 定 得 确 保 避 免 对 Skyline 未 能 识 别 为 截 短 的 峰 的 噪 声 信 号 进 行 积 分 整 合 直 接 删 除 这 些 平 行 数 据 中 相 应 的 问 题 峰 可 能 会 更 加 简 单 本 章 节 最 后 来 看 肽 段 FGLYSDQMR, 在 停 留 时 间 视 图 中, 您 可 以 看 到 Skyline 主 要 挑 选 了 在 19 分 钟 附 近 的 一 个 峰 但 是 在 峰 面 积 视 图 里, 这 些 峰 的 相 对 离 子 丰 度 值 非 常 不 一 致 如 果 您 查 看 几 个 色 谱 图 图 形, 您 会 发 现 很 难 有 效 地 积 分 整 合 在 18.8 分 钟 的 峰, 以 确 认 这 些 信 号 来 自 于 同 一 肽 段 这 种 情 况 下, 您 应 该 直 接 删 除 此 肽 段 并 继 续 下 一 步 全 球 标 准 化 标 准 本 教 程 中 的 这 组 数 据 集 缺 少 稳 定 同 位 素 稀 释 (SID) 标 记 的 肽 段, 但 它 的 样 本 中 含 有 全 球 标 准 肽 段 ( 来 自 秀 丽 隐 杆 线 虫 ) 它 的 目 的 是 使 用 这 些 标 准 肽 段 用 于 所 有 其 它 实 验 测 试 肽 段 的 峰 面 积 的 标 准 化, 并 减 少 LC-MS/MS 实 验 阶 段 中 的 系 统 方 差 的 影 响 2 要 查 看 这 些 肽 段, 您 可 按 以 下 步 骤 : 单 击 目 标 视 图 按 回 车 键, 然 后 按 向 上 箭 头 键 这 会 选 中 文 档 中 最 后 一 个 肽 段,AFGLSSPR 最 后 三 个 被 合 并 到 名 称 为 S 列 表 的 肽 段, HLNGFSV PR VVLSGSDATLAYSAFK 和 AFGLSSPR, 就 是 本 实 验 中 来 自 于 秀 丽 隐 杆 线 虫 用 作 标 准 化 的 肽 段 从 我 们 已 经 查 看 的 两 个 汇 总 图 中, 您 可 以 完 全 信 任 最 后 两 个 肽 段 的 自 动 积 分 整 合 结 果 它 们 的 停 留 时 间 和 峰 面 积 相 对 来 说 会 很 一 致 29

进 行 到 肽 段 HLNGFSVPR 时, 您 将 观 察 到 很 一 致 的 停 留 时 间 分 布 但 它 的 峰 面 积 仍 有 一 定 的 方 差 y4 和 部 分 y3 峰 的 相 对 面 积 似 乎 在 整 个 数 据 集 中 变 化 不 定 30

如 果 您 单 击 一 些 y4 峰 度 最 强 的 的 峰 面 积 条 带, 您 将 看 到 在 y4 和 y3( 有 时 ) 有 明 显 的 干 扰 在 视 图 菜 单, 单 击 自 动 缩 放 并 选 择 最 佳 峰 值 (F11) 若 要 更 清 晰 地 了 解 这 些 作 为 潜 在 标 准 化 标 准 的 肽 段 的 表 现, 您 应 首 先 进 行 以 下 步 骤 : 右 键 单 击 峰 面 积 视 图, 单 击 归 一 化 并 选 择 无 现 在 您 能 看 到, 从 首 样 本 到 终 样 品, 肽 段 HLNGFSVPR 的 峰 面 积 急 剧 下 降 总 峰 面 积 从 大 约 6,000, 000 降 至 30,000, 差 异 足 有 200 倍 您 可 以 尝 试 使 用 结 果 网 格 ( 视 图 > 结 果 网 格 ) 并 勾 选 HLNGFS VPR 肽 段 母 离 子 513.7776++, 来 得 到 精 确 的 最 大 和 最 小 总 峰 面 积 在 查 看 其 他 两 个 标 准 肽 段 时, 您 会 看 到 它 们 也 随 着 时 间 降 低 了 (VVLSGSDATLAYSAFK 2.3 降 至 110 万,AFGLSSPR 23 降 至 100 31

万 ) 所 有 42 项 测 试 均 应 基 本 上 是 技 术 上 的 平 行 测 定 尽 管 在 这 组 数 据 集 中 所 有 肽 段 均 随 时 间 有 明 显 的 系 统 信 号 降 低, 但 许 多 肽 段 不 太 可 能 出 现 200x 或 甚 至 20x 的 降 低 幅 度 按 以 步 骤 可 查 看 这 些 相 互 关 联 的 肽 段 的 洗 脱 位 置 : 选 择 图 标 后 边 的 S 元 素 色 谱 图 图 形 将 会 变 更 如 下 所 示, 在 同 一 图 谱 中 显 示 S 列 表 里 的 所 有 三 个 肽 段 若 要 一 起 查 看 文 档 中 的 所 有 肽 段 : 在 编 辑 菜 单 中, 单 击 选 择 全 部 (Ctrl-A) 32

这 样, 可 以 明 显 看 出 两 个 有 问 题 的 肽 段 均 表 现 出 亲 水 性 并 在 早 期 被 洗 脱 事 实 上, 它 们 是 此 实 验 中 第 3 个 和 第 10 个 洗 脱 的 肽 段 您 可 以 按 以 下 步 骤 在 Skyline 中 对 此 查 看 : 在 视 图 菜 单, 单 击 停 留 时 间 并 选 择 肽 段 比 较 (Ctrl-F8) 右 键 单 击 停 留 时 间 视 图, 单 击 顺 序 并 选 择 停 留 时 间 在 停 留 时 间 图 形 中, 单 击 并 拖 拽 矩 形 框 以 选 中 前 约 15 个 肽 段 早 期 洗 脱 的 肽 段 更 倾 向 于 表 现 出 更 多 的 方 差 因 此 它 们 通 常 不 是 全 球 标 准 化 标 准 的 最 佳 候 选 者 这 些 肽 段 也 可 能 受 其 他 一 些 因 素 影 响, 如 在 自 动 取 样 器 中 排 队 时 被 降 解 另 一 种 查 看 这 些 肽 段 与 周 围 肽 段 表 现 的 相 似 性 的 方 法 如 下 : 在 视 图 菜 单, 单 击 峰 面 积 并 选 择 肽 段 比 较 (Ctrl-F7); 在 视 图 菜 单, 单 击 离 子 对 并 选 择 总 数 (Ctrl-F10); 右 键 单 击 峰 面 积 视 图, 并 单 击 CV 值 ; 峰 面 积 图 形 中, 单 击 并 拖 拽 选 中 前 15 个 左 右 的 肽 段 在 尝 试 理 解 您 看 到 的 内 容 前, 您 应 先 记 住, 所 有 的 非 标 准 肽 段 均 应 表 现 出 更 大 差 异 性, 因 为 它 们 来 自 于 14 个 受 试 对 象 测 试 另 外, 积 分 整 合 调 整 也 无 法 适 应 于 所 有 肽 段 在 当 前 数 据 集 中,Sky line 自 动 拣 选 的 峰 看 起 来 都 符 合 标 准 但 是 HLNGFSVPR 肽 段 表 现 出 第 二 高 的 CV 值, 约 为 160%; 而 AFGLSSPR 肽 段 的 CV 值 约 为 接 近 前 15 个 肽 段 的 中 位 数,50% (VVLSGSDATLAYSAFK 肽 段 更 具 疏 水 性 并 为 晚 期 洗 脱,CV 为 18.6%, 排 在 第 108 位 或 第 80 个 百 分 位 ) 33

按 以 下 步 骤, 您 会 发 现 LGP 肽 段 有 着 与 HLN 肽 段 非 常 相 似 的 问 题 单 击 峰 面 积 视 图 中 LGP 肽 段 的 条 带 在 视 图 菜 单, 单 击 峰 面 积 并 选 择 重 复 测 定 比 较 (F7) 请 记 住, 应 该 有 三 个 循 环 周 期 测 试 或 技 术 平 行 测 定 : 34

为 确 保 这 些 峰 的 积 分 整 合 是 正 确 的, 请 按 以 下 步 骤 : 在 视 图 菜 单, 单 击 离 子 对 并 选 择 所 有 (F10) 右 键 单 击 峰 面 积 视 图, 单 击 归 一 化 并 选 择 总 数 您 可 以 看 到, 尽 管 离 子 丰 度 绝 对 值 从 最 低 到 最 高 有 着 200 倍 差 距 的 分 布 范 围 (1.4 亿 至 70 万 ), 但 各 测 试 之 间 的 相 对 离 子 丰 度 值 是 高 度 稳 定 的 尽 管 这 个 肽 段 有 相 似 的 问 题, 您 仍 应 该 只 将 HLNGFSVPR 这 样 的 肽 段 排 除 在 作 为 全 球 标 准 化 标 准 的 考 虑 范 围 之 外 在 理 想 情 况 下, 在 您 将 标 准 肽 段 加 进 重 要 的 定 量 数 据 很 久 之 前 就 应 该 这 样 做 在 此 例 中, 您 确 实 应 该 仅 使 用 VVLSGSDATLAYSAFK 作 为 在 文 档 中 所 有 其 他 肽 段 的 全 球 标 准 化 标 准 更 进 一 步 地 证 明 此 观 点 已 超 出 了 本 教 程 的 范 围 继 续 多 重 复 测 定 数 据 处 理 现 在, 您 将 选 择 在 S 标 准 肽 段 列 表 之 上 的 肽 段 DVFSQQADLSR 来 继 续 查 看 和 更 正 本 实 验 的 峰 积 分 在 视 图 菜 单 选 择 保 留 时 间 并 单 击 重 复 测 定 比 较 在 保 留 时 间 和 峰 面 积 图 形 中 您 会 观 察 到 一 致 性 信 息, 这 会 让 您 相 信 所 有 运 行 中 的 肽 段 均 已 被 一 致 积 分 您 无 需 再 查 看 这 个 肽 段 而 可 以 继 续 进 行 目 标 列 表 操 作 此 情 况 亦 适 用 于 接 下 来 两 个 肽 段 继 续 在 列 表 中 操 作 直 至 遇 到 肽 段 IFSQQADLSR 您 会 注 意 到, 除 了 H_146_REP1 之 外 的 每 一 组 重 复 测 定 均 在 峰 面 积 图 形 中 有 一 致 的 相 对 离 子 丰 度 值 另 外, 当 您 单 击 这 项 运 行 的 条 带 时, 您 会 看 到 H 35

_146_REP1 的 峰 没 有 完 全 被 5 分 钟 时 序 安 排 的 窗 口 所 捕 获 ( 您 可 能 要 关 闭 x 轴 缩 放 才 能 看 到 按 Shift 加 F11 ) 如 您 在 前 面 所 做 一 样, 您 可 以 通 过 单 击 并 拖 拽 x 轴 下 方 来 积 分 截 短 的 峰, 或 右 键 单 击 菜 单 来 完 全 删 除 这 个 峰 然 而 这 不 并 是 此 肽 段 的 唯 一 问 题 在 观 看 保 留 时 间 图 形 时, 您 会 观 察 到 在 被 整 合 的 时 间 范 围 内 有 些 异 常 的 差 异 36

如 果 您 查 看 这 个 肽 段 的 一 些 色 谱 图, 您 会 看 到 许 多 色 谱 图 显 示 了 一 个 单 独 状 态 很 好 的 峰, 其 洗 脱 超 过 了 0.2 分 钟 但 其 他 色 谱 图 带 有 一 些 延 长 至 大 约 0.5 分 钟 的 拖 尾, 而 其 他 仍 显 示 了 洗 脱 超 过 2 分 钟 有 两 个 不 同 峰 的 肽 段 这 样 的 肽 段 是 很 难 用 来 定 量 的, 尤 其 是 没 有 匹 配 SID 的 肽 段 也 许 您 应 该 从 此 实 验 中 删 除 这 个 肽 段 至 少 您 应 该 从 显 示 双 重 洗 脱 分 布 图 的 运 行 中 删 除 这 些 峰 继 续 在 肽 段 列 表 中 操 作, 您 会 发 现 接 下 来 的 7 个 肽 段 在 汇 总 图 中 显 示 出 很 好 的 一 致 性, 您 不 需 要 更 改 Skyline 执 行 的 任 何 默 认 峰 拣 选, 或 甚 至 只 要 看 一 眼 即 可 但 当 您 进 行 到 肽 段 MLSGFIPLKPTVK 时, 您 会 在 峰 面 积 图 中 看 到 更 多 的 方 差 这 个 肽 段 的 的 总 峰 面 积 主 要 由 y7 离 子 占 据 尽 管 这 在 库 谱 图 中 也 有 显 示 ( 在 上 方 图 形 的 最 左 边 显 示 ), 但 想 要 通 过 视 觉 观 察 色 谱 图 中 是 否 有 任 何 肽 段 实 际 上 与 y7 离 子 共 洗 脱 是 很 困 难 的 ( 见 下 方 ) 37

但 很 明 显 的 是, 在 大 部 分 情 况 下 Skyline 在 每 一 次 运 行 中 均 整 合 相 同 分 子 的 相 同 的 峰 若 要 证 实 图 中 不 只 有 y7 峰, 则 您 应 该 查 看 强 度 最 高 的 一 次 测 量 您 可 以 按 以 下 步 骤 执 行 : 右 键 单 击 峰 面 积 图 形, 选 择 归 一 化 并 单 击 无 单 击 三 个 明 显 强 度 最 高 的 峰 ( 均 来 自 受 试 对 象 H_148) 这 三 张 图 中 的 色 谱 峰 可 证 实, 在 23 至 24 分 钟 之 间 y7 峰 对 应 的 肽 段 事 实 上 就 是 导 致 在 肽 段 丰 度 值 足 够 高 时 在 所 有 6 个 受 监 控 离 子 对 上 生 形 成 共 洗 脱 信 号 的 肽 段 相 较 删 除 这 个 肽 段 之 外, 您 可 能 更 想 更 正 Skyline 选 错 色 谱 峰 的 这 个 事 实 您 可 以 在 保 留 时 间 图 中 看 到, 在 22.5 分 钟 下 方 产 生 了 一 条 更 窄 的 条 带, 38

同 样 情 况 在 出 现 在 峰 面 积 图 中, 其 中 该 运 行 没 有 可 见 的 已 积 分 信 号 您 可 以 单 击 保 留 时 间 视 图 中 的 条 带 以 激 活 该 运 行 的 色 谱 图 您 会 看 到 运 行 在 y7 离 子 对 保 留 的 信 号 非 常 低 在 没 有 其 它 运 行 获 取 的 信 息 作 为 参 考 时, 不 要 单 独 选 择 这 个 离 子 对 来 代 表 一 个 肽 段 39

按 以 下 步 骤 可 更 正 该 运 行 的 积 分 : 在 D_154_REP3 的 图 形 上 单 击 峰 注 释 23.4( 点 积 0.82) 在 继 续 查 看 峰 积 分 前, 按 以 下 步 骤 来 返 回 峰 面 积 图 形 以 显 示 相 对 离 子 丰 度 值 : 右 键 单 击 峰 面 积 视 图, 选 择 归 一 化 并 单 击 总 数 您 会 看 到 已 更 正 的 峰 现 在 与 汇 总 图 中 的 其 他 运 行 更 加 一 致 继 续 进 行 到 上 方 的 肽 段 在 肽 段 GMYESLPVVAVK, 您 会 看 到 在 汇 总 图 中 的 一 致 性 非 常 差, 建 议 您 无 需 费 力 调 整 积 分, 而 是 直 接 删 除 这 个 肽 段 肽 段 ETGLMAFTNLK 仅 需 在 一 个 运 行 中 进 行 调 整 此 项 运 行 应 该 会 在 峰 面 积 图 形 中 非 常 明 显 进 行 到 本 教 程 的 这 个 阶 段, 您 应 该 已 非 常 熟 悉 哪 些 地 方 会 出 错 以 及 如 何 解 决 问 题 在 做 完 更 正 后, 如 果 您 仍 不 确 定 ETGLMAFTNLK 肽 段 在 所 有 情 况 下 积 分 的 均 为 相 同 肽 段 的 相 同 峰, 那 么 您 可 按 以 下 任 一 种 方 式 快 速 查 看 所 有 色 谱 图 图 形 : 单 击 目 标 视 图 顶 部 的 重 复 测 定 下 拉 列 表 使 用 向 上 和 向 下 箭 头 按 键 在 各 运 行 间 移 动, 激 活 色 谱 图 图 形 或 者 同 时 按 Ctrl 和 向 上 箭 头 或 Ctrl 和 向 下 箭 头 在 各 运 行 间 移 动 40

在 许 多 图 形 中 您 会 看 到, 在 被 选 中 的 峰 前 大 约 1.5 分 钟 处,y3 和 y4 离 子 对 有 一 个 肽 段 干 扰 这 让 您 对 已 积 分 的 峰 的 一 致 性 更 有 把 握 继 续 在 目 标 列 表 中 操 作, 您 会 发 现 有 些 肽 段 (YANVIAYDHSR 和 TDEDVPSGPPR) 显 示 出 实 际 测 量 的 相 对 离 子 丰 度 值 和 匹 配 库 谱 图 的 差 异 您 可 以 在 峰 面 积 图 形 中 看 到 这 些 差 异 : 41

您 也 会 在 色 谱 图 中 观 察 到 这 些 差 异, 而 在 这 些 色 谱 图 中 Skyline 在 峰 保 留 时 间 下 边 显 示 了 较 低 的 点 积 值 ( 点 积 0.28) 当 在 图 形 上 有 另 一 个 点 积 值 较 高 的 峰 时,Skyline 便 会 显 示 这 样 的 点 积 值 在 上 述 情 况 中, 您 无 法 看 到 点 积 值 更 高 的 峰, 这 是 因 为 它 接 近 被 选 中 峰 的 噪 声 级 别 按 以 下 步 骤 可 查 看 这 个 峰 : 单 击 相 关 图 形 的 色 谱 图 以 将 其 激 活 将 鼠 标 光 标 放 置 在 y 轴 的 左 边 使 用 鼠 标 滚 轮 或 轨 迹 板 的 滚 动 手 势 来 向 上 滚 动 这 样 图 形 的 y 轴 比 例 会 缩 放, 直 到 您 可 以 看 到 点 积 值 更 高 的 较 小 峰 如 果 您 十 分 确 信 库 谱 图 是 在 与 此 实 验 中 使 用 的 质 谱 仪 相 似 的 仪 器 中 收 集, 您 所 看 到 的 内 容 一 定 会 让 您 怀 疑 已 积 分 的 峰 实 际 上 没 有 在 测 量 我 们 所 讨 论 的 肽 段 但 在 此 例 中, 您 不 知 道 这 个 谱 图 的 来 源, 而 除 了 使 用 这 个 样 本 制 备 测 量 此 肽 段 外 也 不 太 可 能 有 其 他 选 择 从 峰 面 积 和 保 留 时 间 图 形 中 各 运 行 间 一 致 性 来 看, 您 可 确 信 相 同 的 肽 段 在 所 有 运 行 中 是 由 6 个 共 洗 脱 的 离 子 对 测 量 的 尽 管 丰 度 值 最 高 的 离 子 是 选 择 性 低 的 y3 离 子, 您 也 可 以 删 除 这 个 离 子 对 以 更 仔 细 地 查 看 其 他 离 子 的 一 致 性 和 共 洗 脱 信 息 (y9 是 丰 度 值 第 二 高 的 离 子 ) 在 您 确 定 这 个 峰 后, 您 可 以 使 用 撤 消 按 钮 (Ctrl-Z) 将 已 删 除 的 y3 离 子 对 还 原 到 Skyline 文 档 中 在 TDEDVPSGPPR 上 方 的 7 个 肽 段 中, 您 应 仅 看 到 肽 段 SPQGLGASTAEISAR 的 一 个 错 误 积 分 的 峰 您 现 在 应 该 可 更 容 易 地 识 别 和 更 正 这 个 问 题 42

之 后 您 会 看 到 肽 段 CSSLLWAGAAWLR 根 据 您 将 在 汇 总 图 ( 见 下 方 ) 看 到 的 方 差, 最 初 您 可 能 想 删 除 这 个 肽 段 并 继 续 前 进 : 但 是 如 果 您 仔 细 查 看, 您 会 发 现 在 健 康 受 试 对 象 中 存 在 一 致 的 区 域 按 以 下 步 骤 可 更 清 晰 地 查 看 此 内 容 : 右 键 单 击 峰 面 积 图 形, 选 择 依 据 顺 序 并 单 击 文 档 图 形 会 变 为 这 样 : 43

这 样 可 更 明 显 地 看 出 在 健 康 受 试 对 象 中 有 一 个 一 致 的 峰 可 被 积 分, 而 在 患 病 受 试 对 象 中 并 没 有 如 果 查 看 健 康 受 试 对 象 的 峰, 您 会 看 出 它 的 强 度 相 当 低, 且 主 要 依 靠 y4 y5 和 y6 离 子 的 共 洗 脱 这 个 共 洗 脱 很 可 能 由 一 个 肽 段 引 起, 但 要 确 定 这 个 肽 段 是 否 为 CSSLLWAGAAWLR 是 很 困 难 的 如 果 查 看 患 病 受 试 对 象 的 色 谱 图, 您 偶 尔 可 在 y6 离 子 对 大 约 21 分 钟 处 发 现 可 能 为 某 个 峰 的 东 西, 但 通 常 很 难 观 察 到 任 何 一 致 的 洗 脱 模 式 : 44

D_102_REP3 D_108_REP1 然 而 在 患 病 受 试 对 象 色 谱 图 中 很 明 显 没 有 可 见 峰, 即 没 有 生 成 类 似 健 康 受 试 对 象 中 观 察 到 的 峰 面 积 从 您 现 在 已 获 得 的 关 于 峰 漂 移 和 截 短 的 经 验 来 看, 您 应 该 很 有 把 握 这 个 峰 不 仅 仅 漂 移 在 所 有 患 病 受 试 对 象 的 已 测 量 范 围 外, 还 有 健 康 受 试 对 象 注 射 的 随 机 性 亦 也 许 让 您 对 此 更 有 信 心 但 对 当 前 研 究 来 说, 这 三 个 重 复 测 定 循 环 已 经 足 够 了 当 您 以 最 大 努 力 更 正 积 分 后, 您 也 许 还 注 意 到 此 肽 段 中 两 个 带 有 明 显 可 见 峰 的 患 病 受 试 对 象 运 行 紧 跟 在 健 康 受 试 对 象 运 行 之 后 (D_102_REP2 和 D_102_REP3) 您 所 观 察 到 的 内 容 可 能 暗 示 存 在 延 滞 效 应 45

最 后, 这 些 离 子 对 可 能 代 表 着 本 文 档 中 最 强 的 生 物 标 记 候 选 者 之 一 现 在 您 可 以 订 购 一 个 合 成 肽 段, 让 您 更 有 把 握 您 事 实 上 是 在 测 量 CSSLLWAGAAWLR 肽 段 您 也 可 以 尝 试 在 这 个 峰 范 围 内 采 集 M S/MS 谱 图 ( 使 用 平 行 反 应 监 测 PRM) 来 查 看 它 是 否 可 以 由 一 个 肽 段 搜 索 引 擎 明 确 鉴 定 最 后 如 果 这 个 方 法 失 败 了, 您 可 以 尝 试 MS/MS 谱 图 重 头 测 序, 识 别 出 是 什 么 导 致 了 健 康 受 试 对 象 中 的 峰 在 靶 向 蛋 白 质 组 学 中, 并 不 总 是 需 要 以 明 确 鉴 定 开 始 或 许 与 SDS-PAGE 凝 胶 条 带 更 相 似, 找 到 差 异 即 可 以 启 动 发 现 现 在, 您 应 该 可 以 完 成 对 剩 余 肽 段 的 操 作, 更 正 积 分 以 及 删 除 表 现 差 的 肽 段 您 可 在 一 个 小 时 内 完 成 您 会 发 现, 那 些 表 现 良 好 可 被 时 序 安 排 的 保 留 时 间 窗 口 完 全 捕 获 的 肽 段 几 乎 不 需 要 更 正 通 常 仅 需 看 一 眼 峰 面 积 和 保 留 时 间 图 形 即 可 分 辨 出 来 对 于 表 现 较 差 许 多 峰 被 截 短 或 在 时 序 安 排 窗 口 缺 失 的 肽 段, 建 议 您 直 接 将 其 删 除 但 小 心 不 要 过 早 下 此 结 论, 否 则 您 可 能 会 错 过 观 察 到 一 些 有 趣 的 内 容 准 备 使 用 重 复 测 定 注 释 的 统 计 分 析 在 完 成 了 仔 细 验 证 和 更 正 您 的 Skyline 文 档 中 的 所 有 积 分 问 题 后, 您 应 将 注 意 力 转 向 寻 找 在 不 同 实 验 条 件 之 间 可 能 存 在 丰 度 差 异 的 肽 段 无 论 在 Skyline 或 其 外 部 统 计 工 具 中, 该 分 析 都 需 要 将 测 量 的 样 本, 即 Skyline 中 的 重 复 测 定, 进 行 进 一 步 分 类 Skyline 对 这 样 的 分 类 提 供 重 复 测 定 注 释 在 本 教 程 中, 您 将 使 用 到 三 个 重 复 测 定 注 释 :SubjectId BioReplicate 和 Conditio n 按 以 下 步 骤 可 定 义 SubjectId 注 释 : 在 设 置 菜 单 上 单 击 文 档 设 置 在 文 档 设 置 窗 口 的 注 释 标 签, 单 击 编 辑 列 表 按 钮 46

单 击 定 义 注 释 窗 口 中 的 添 加 按 钮 在 定 义 注 释 窗 口 的 名 称 字 段 输 入 SubjectId 在 应 用 于 列 表 中, 勾 选 重 复 测 定 窗 口 如 下 所 示 : 单 击 定 义 注 释 窗 口 中 的 确 定 按 钮 单 击 定 义 注 释 窗 口 中 的 确 定 按 钮 勾 选 您 刚 刚 创 建 的 SubjectId 注 释 文 档 设 置 窗 口 如 下 所 示 : 47

单 击 确 定 按 钮 尽 管 本 教 程 不 会 讲 述 太 多 有 关 Skyline 外 部 工 具 MSstats 中 可 用 的 统 计 分 析 方 法, 但 却 能 很 好 地 适 用 于 此 类 分 析 这 组 特 定 的 数 据 集 已 在 许 多 课 程 和 培 训 中 被 用 于 展 示 MSstats 的 使 用 如 果 您 有 兴 趣 探 索 MSstats 对 此 种 类 型 的 分 析 有 何 帮 助, 您 可 以 按 以 下 步 骤 安 装 MSstats 到 Skyl ine 中 以 获 得 所 需 的 其 他 两 个 注 释 : 单 击 工 具 菜 单 上 的 工 具 商 店 从 工 具 列 表 中 选 择 MSstats 48

从 工 具 商 店 安 装 窗 口 如 下 所 示 : 单 击 安 装 按 钮 并 遵 循 提 示, 直 到 MSstats 安 装 完 成 按 以 下 步 骤 可 查 看 在 MSstats 安 装 过 程 中 添 加 注 释 或 不 安 装 MSstats 直 接 添 加 : 在 设 置 菜 单 上 单 击 文 档 设 置 在 文 档 设 置 窗 口 的 注 释 标 签, 单 击 编 辑 列 表 按 钮 如 果 您 安 装 了 MSstats, 则 选 择 BioReplicate 注 释, 再 单 击 编 辑 按 钮 否 则 单 击 添 加 按 钮 对 Condition 注 释 重 复 这 些 步 骤 49

这 些 注 释 的 定 义 如 下 所 示 : 单 击 确 定 返 回 到 文 档 设 置 窗 口 勾 选 BioReplicate 和 Condition 注 释, 将 其 添 加 到 您 的 文 档 中 文 档 设 置 窗 口 如 下 所 示 : 单 击 确 定 按 钮 50

按 以 下 步 骤 可 设 置 已 添 加 到 文 档 的 注 释 : 在 视 图 菜 单 单 击 文 档 网 格 在 文 档 网 格 窗 口 的 左 上 角 的 视 图 菜 单 单 击 重 复 测 定 文 档 网 格 窗 口 如 下 所 示 : 现 在 您 可 以 手 动 将 所 有 42 个 重 复 测 定 的 注 释 输 入 到 网 格 中 您 也 可 以 将 电 子 表 格 中 的 值 直 接 粘 贴 到 这 个 表 中 您 可 以 按 以 下 步 骤 执 行 : 在 Excel 中, 打 开 GroupedStudies1\Heart Failure\raw 文 件 夹 的 Annotations.xl sx 文 件 选 择 标 题 行 下 3 个 注 释 栏 的 所 有 42 行 值 的 单 元 格 按 Ctrl 加 C 键 复 制 单 元 格 在 Skyline 中 选 择 SubjectId 栏 的 顶 部 单 元 格 注 释 : 在 此 步 骤 不 要 进 入 单 元 格 编 辑 模 式 如 果 在 顶 部 SubjectId 单 元 格 内 看 到 闪 烁 的 光 标, 按 Esc 键 文 档 网 格 窗 口 如 下 所 示 : 51

按 Ctrl 加 V 键 粘 贴 到 文 档 网 格 中 Skyline 会 使 用 电 子 表 格 中 的 值 填 写 文 档 网 格 中 的 单 元 格, 如 下 所 示 : 注 释 问 题 峰 的 肽 段 您 可 能 也 想 注 释 峰 被 删 除 或 有 截 短 的 肽 段, 因 为 这 两 者 均 可 能 在 统 计 分 析 中 引 起 问 题 按 以 下 步 骤 可 定 义 您 将 用 于 此 目 的 的 注 释 : 在 设 置 菜 单 上 单 击 文 档 设 置 在 文 档 设 置 窗 口 的 注 释 标 签, 单 击 编 辑 列 表 按 钮 选 择 注 释 列 表 中 的 最 后 一 个 注 释 单 击 添 加 按 钮 在 定 义 注 释 分 类 的 名 称 字 段 输 入 MissingData 52

在 类 型 下 拉 列 表 中 选 择 真 / 假 在 应 用 于 列 表 中, 勾 选 肽 段 定 义 注 释 窗 口 如 下 所 示 : 单 击 确 定 按 钮 单 击 定 义 注 释 窗 口 中 的 确 定 按 钮 勾 选 您 刚 刚 定 义 的 MissingData 注 释 文 档 设 置 窗 口 如 下 所 示 : 53

单 击 确 定 按 钮 按 以 下 步 骤 可 准 备 对 所 有 峰 截 短 的 肽 段 设 置 新 的 MissingData 注 释 : 在 文 档 网 格 的 视 图 菜 单, 单 击 您 之 前 创 建 的 截 短 的 母 离 子 视 图 在 相 同 的 视 图 菜 单 上 单 击 编 辑 视 图 在 自 定 义 视 图 分 类 中, 展 开 列 的 树 状 目 录, 勾 选 蛋 白 质 > 肽 段 >MissingData, 向 您 刚 刚 创 建 的 注 释 添 加 一 列 自 定 义 视 图 窗 口 如 下 所 示 : 54

单 击 确 定 按 钮 单 击 两 次 截 尾 计 数 的 栏 标 题 来 降 序 排 序 文 档 网 格 窗 口 如 下 所 示 : 55

是 否 恰 好 存 在 223 个 截 短 的 母 离 子 峰 组 取 决 于 您 处 理 剩 余 文 档 的 方 式 您 可 以 一 次 勾 选 一 个 肽 段 的 MissingData 复 选 框 当 您 勾 选 了 任 一 肽 段 的 方 框 后, 其 余 会 自 动 勾 选, 因 为 注 释 仅 会 应 用 于 任 一 肽 段 一 次 按 以 下 步 骤 来 立 即 尝 试 一 下 : 勾 选 网 格 首 行 MissingData 标 题 紧 下 方 的 复 选 框 按 下 输 入 键 文 档 网 格 窗 口 如 下 所 示 : 您 也 可 以 使 用 Excel 和 文 档 网 格 支 持 按 如 下 所 示 在 一 次 粘 贴 中 设 置 所 有 163 行 : 在 空 白 Excel 的 电 子 表 格 中, 向 下 滚 动 到 第 163 行 在 163 行 的 首 列 输 入 TRUE 56

选 择 您 刚 刚 输 入 的 单 元 格 单 击 并 拖 拽 选 择 矩 形 右 下 角 的 范 围 扩 展 方 块, 将 163 行 至 第 1 行 的 首 列 单 元 格 填 满 TR UE 值 按 Ctrl 加 C 键 复 制 这 些 单 元 格 返 回 到 Skyline, 选 择 MissingData 列 中 的 第 一 个 单 元 格 按 Ctrl 加 V 键 将 TRUE 值 粘 贴 到 MissingData 中 的 所 有 163 行 你 可 能 发 觉 这 样 有 些 多 余 您 只 需 要 针 对 每 一 个 肽 段 将 MissingData 注 释 设 置 为 真 但 相 对 于 单 击 每 个 峰 截 短 的 31 个 肽 段 的 复 选 框 来 说, 这 种 方 法 可 以 更 快 地 实 现 想 要 的 结 果 当 您 完 成 了 上 述 步 骤 后 您 会 注 意 到, 目 标 列 表 顶 部 的 许 多 肽 段 均 在 肽 段 名 称 的 右 上 角 被 标 记 了 一 小 块 红 色 的 三 角 形 如 果 您 将 鼠 标 光 标 悬 浮 在 这 些 三 角 形 上, 您 会 看 到 一 则 消 息 显 示 Missing Data 真 对 于 您 删 除 了 而 没 有 积 分 的 峰 截 短 的 所 有 肽 段, 按 以 下 步 骤 重 复 此 过 程 : 在 文 档 网 格 的 视 图 菜 单, 单 击 管 理 视 图 选 择 您 一 直 使 用 的 截 短 的 母 离 子 视 图 单 击 复 制 按 钮 在 自 定 义 视 图 分 类 的 视 图 名 称 字 段, 输 入 缺 失 的 峰 使 用 每 列 列 表 右 边 的 按 钮 删 除 母 离 子 和 截 尾 计 数 列 勾 选 枢 轴 重 复 测 定 名 称 复 选 框 自 定 义 视 图 窗 口 如 下 所 示 : 57

单 击 过 滤 器 标 签 单 击 按 钮 来 删 除 截 尾 计 数 的 现 有 过 滤 器 展 开 列 树 状 目 录, 勾 选 蛋 白 质 > 肽 段 > 母 离 子 > 母 离 子 结 果, 为 总 面 积 列 添 加 一 个 过 滤 器 在 操 作 列 选 择 为 空 白 自 定 义 视 图 窗 口 如 下 所 示 : 单 击 确 定 按 钮 单 击 管 理 视 图 分 类 中 的 确 定 按 钮 58

在 文 档 网 格 视 图 的 视 图 菜 单 单 击 缺 失 的 峰 文 档 网 格 窗 口 如 下 所 示 : 注 释 : 如 果 您 没 有 完 全 成 功 处 理 您 的 文 档, 则 您 仅 会 看 到 肽 段 GSYNLQDLLAQ 的 一 行 下 一 个 注 释 说 明 了 如 何 打 开 一 个 全 处 理 完 全 的 文 档 在 该 视 图 中, 您 可 获 得 在 所 有 运 行 中 缺 失 一 个 峰 的 肽 段 的 简 要 列 表 您 能 明 显 看 到 有 10 个 肽 段, 其 中 只 有 2 个 没 有 截 短 的 峰,8 个 设 置 了 MissingData 注 释 带 有 缺 失 峰 的 重 复 测 定 名 称 位 于 肽 段 和 缺 失 数 据 列 右 侧 的 枢 轴 若 要 完 成 标 记 所 有 数 据 缺 失 的 肽 段 : 勾 选 TLNSINIAVFSK 和 IFSQQADLSR 的 缺 失 数 据 复 选 框 关 闭 文 档 网 格 恭 喜 您! 您 已 经 完 成 了 这 个 数 据 集 的 初 始 数 据 处 理 在 更 清 晰 地 理 解 了 可 能 影 响 数 据 质 量 的 问 题, 且 在 已 采 集 数 据 允 许 的 范 围 内 进 行 了 峰 积 分 优 化 后, 您 已 经 可 以 开 始 运 行 更 高 级 别 的 统 计 以 进 一 步 评 估 数 据 质 量 我 们 希 望, 您 会 开 始 理 解 哪 些 肽 段 或 蛋 白 质 可 能 在 事 实 上 被 证 明 适 用 于 研 究 中 病 症 的 生 物 标 记 注 释 : 如 果 进 行 到 本 教 程 的 这 个 位 置 您 还 没 有 完 全 处 理 文 档, 或 者 您 想 将 您 的 处 理 过 程 与 本 教 程 作 者 的 过 程 比 较, 那 么 您 可 以 打 开 随 附 于 本 教 程 中 的 已 完 全 处 理 的 文 件, 方 法 如 下 : 在 文 件 菜 单 上 单 击 保 存 (Ctrl-S) 来 保 存 您 的 文 档 在 文 件 菜 单 上 单 击 打 开 (Ctrl-O) 向 上 导 航 一 个 文 件 夹 至 GroupedStudies1\Heart Failure 并 选 择 Rat_plasma.sky.zi p 单 击 打 开 按 钮 59

Skyline 初 始 多 重 复 测 定 检 查 与 Skyline 当 前 提 供 的 分 析 相 比, 您 一 定 想 对 任 何 这 样 的 数 据 做 更 深 层 次 的 统 计 分 析, 而 Skyli ne 正 好 可 提 供 一 些 有 用 的 方 法 进 行 方 差 和 组 平 均 值 初 始 检 查 按 以 下 步 骤 可 了 解 如 何 获 得 每 个 受 试 对 象 的 技 术 重 复 测 定 中 的 方 差 : 选 择 全 局 内 标 肽 段 列 表 上 方 的 肽 段 DVFSQQADLSR 在 视 图 菜 单 选 择 离 子 对 并 单 击 总 数 右 键 单 击 峰 面 积 视 图, 选 择 归 一 化 并 单 击 全 局 标 准 右 键 单 击 峰 面 积 视 图, 选 择 分 组 依 据 并 单 击 SubjectId 右 键 单 击 峰 面 积 视 图, 并 单 击 CV 值 ( 如 果 没 有 勾 选 ) 这 样 峰 面 积 图 形 如 下 所 示 : 现 在 您 可 查 看 更 多 肽 段 在 每 个 受 试 对 象 的 技 术 重 复 测 定 中 的 变 异 系 数 (CV) 您 会 看 到 大 部 分 在 2 5% 以 下 然 而 在 理 想 情 况 下,CV 应 比 在 本 实 验 中 观 察 到 的 更 低 值 得 说 明 的 一 点 是,3 组 测 量 相 比 10 组 测 量 更 容 易 获 取 相 同 且 较 低 的 CV 这 是 因 为, 在 统 计 学 上, 我 们 容 易 低 估 小 型 样 本 的 标 准 偏 差 最 终, 通 过 使 用 Skyline, 您 能 初 步 了 解 本 实 验 研 究 中 两 组 的 肽 段 表 达 差 异 按 以 下 步 骤 可 初 步 查 看 健 康 组 与 患 病 组 之 间 平 均 肽 段 丰 度 值 的 差 异 : 右 键 单 击 峰 面 积 视 图, 选 择 分 组 依 据 并 单 击 状 态 右 键 单 击 峰 面 积 视 图, 并 单 击 CV 值 取 消 勾 选 这 个 菜 单 项 目 在 目 标 视 图 中 选 择 多 个 肽 段 您 会 在 峰 面 积 视 图 中 看 到 如 下 方 蛋 白 质 NP_872280 肽 段 的 图 形 : 60

在 这 些 图 形 中, 条 带 表 示 所 有 重 复 测 定 间 的 平 均 值 ( 在 此 例 中, 是 相 对 于 总 体 标 准 品 的 峰 面 积 比 率 ), 触 须 线 表 示 平 均 值 任 一 边 的 标 准 偏 差 这 样 您 会 了 解 平 均 值 来 源 于 的 样 本 分 布 在 解 读 这 份 图 形 时, 您 需 要 理 解 测 量 各 样 本 组 间 差 异 的 目 的, 这 很 重 要 两 个 最 普 遍 的 目 的 是 : 1. 区 分 : 尝 试 识 别 各 组 之 间 的 差 异 ( 例 如, 测 试 是 否 一 种 处 理 方 法 造 成 了 相 关 途 径 中 的 活 性 减 少 ) 2. 预 测 : 尝 试 识 别 可 预 测 属 于 某 一 特 定 组 的 肽 段 表 达 ( 例 如, 测 试 是 否 一 组 肽 段 可 作 为 一 组 特 定 的 生 物 标 记 物 ) 如 果 您 只 是 想 检 测 两 组 中 是 否 在 统 计 上 有 显 著 差 异, 那 么 与 分 布 的 标 准 偏 差 相 比, 您 应 更 关 注 平 均 值 的 标 准 偏 差 T 检 验 中 的 p 值 会 提 供 一 个 单 独 数 值, 显 示 了 具 有 统 计 学 意 义 的 显 著 平 均 值 差 异, 而 这 个 差 异 与 那 两 个 平 均 值 的 标 准 偏 差 值 相 关 您 不 能 从 上 方 的 图 形 中 看 出 标 准 错 误 值, 所 以 它 们 对 于 了 解 差 异 表 达 没 有 起 到 应 有 的 作 用 在 预 测 方 面, 两 个 群 体 的 基 础 分 布 很 重 要 如 果 两 组 在 一 个 标 准 偏 差 上 就 有 多 个 重 叠, 所 以 单 独 这 个 肽 段 并 不 可 能 成 为 有 效 的 生 物 标 记 物 候 选 者 在 此 种 情 况 下, 我 们 很 难 预 测 是 哪 些 分 布 产 生 了 任 何 单 一 测 量 在 这 里 值 得 注 意 的 一 点 是, 我 们 仍 有 可 能 从 非 单 独 预 测 的 一 系 列 肽 段 中 建 立 一 个 有 力 的 生 物 标 记 物 组 上 图 中 的 肽 段 平 均 值 在 统 计 上 有 显 著 的 差 异, 但 并 不 具 备 单 独 预 测 性, 而 这 由 一 个 标 准 偏 差 的 分 布 范 围 重 叠 进 行 了 诠 释 继 续 在 肽 段 / 蛋 白 质 列 表 中 操 作, 您 会 看 到 紧 上 方 的 蛋 白 质 NP_036714 可 以 作 为 更 有 效 的 生 物 标 记 物 候 选 者 : 61

本 实 验 中 的 许 多 肽 段 显 示 了 两 组 之 间 的 平 均 值 在 统 计 上 有 显 著 差 异 考 虑 到 我 们 的 目 标 列 表 来 源 是 关 于 心 脏 病 差 异 蛋 白 质 表 达 方 面 的 文 献, 这 也 就 不 足 为 奇 了 但 这 些 肽 段 单 独 来 看, 却 很 少 能 成 为 有 效 的 生 物 标 记 物 候 选 者 当 您 进 行 到 含 有 肽 段 CSSLLWAGAAWLR 的 蛋 白 质 NP_001007697 时, 您 会 观 察 到 这 样 一 种 情 况, 即 被 分 配 到 同 一 个 蛋 白 质 的 肽 段 在 健 康 组 和 患 病 组 之 间 表 现 出 非 常 不 同 的 相 对 表 达 水 平 : 这 告 诉 我 们, 虽 然 您 能 有 把 握 在 许 多 样 本 中 测 量 相 同 的 肽 段 分 子, 但 却 通 常 对 将 多 个 肽 段 母 离 子 分 配 到 相 同 来 源 的 蛋 白 质 方 面 几 乎 没 有 把 握 有 很 多 原 因 可 以 解 释 这 种 观 察 现 象 例 如, 一 种 肽 段 可 能 拥 有 翻 译 后 修 饰 (PTM), 这 使 其 成 为 重 要 的 生 物 标 记 物 候 选 者, 而 剩 余 的 蛋 白 质 可 能 没 受 到 影 响 Skyline 中 的 简 单 群 组 比 较 自 Skyline 3.1 开 始 便 可 以 进 行 简 单 的 肽 段 或 蛋 白 质 峰 面 积 的 成 对 群 组 比 较 比 较 的 方 法 为, 汇 总 一 个 肽 段 或 蛋 白 质 的 可 用 离 子 对 峰 面 积 按 标 准 化 标 准 分 割 ( 可 选 ) 做 记 录 平 均 所 有 技 术 62

重 复 测 定 并 对 结 果 值 执 行 T 检 验 Skyline 会 自 动 丢 弃 缺 少 值 或 在 非 标 记 数 据 中 有 截 短 峰 的 重 复 测 定 按 以 下 步 骤 可 在 您 一 直 处 理 的 数 据 集 中 进 行 尝 试 : 在 设 置 菜 单 上 单 击 文 档 设 置 在 文 档 设 置 窗 口 的 群 组 比 较 标 签, 单 击 添 加 按 钮 在 编 辑 群 组 比 较 窗 口 的 名 称 字 段, 输 入 健 康 与 患 病 对 控 制 群 组 注 释, 选 择 状 态 对 控 制 群 组 值, 选 择 健 康 对 比 较 值, 选 择 患 病 对 身 份 注 释, 选 择 SubjectId 对 标 准 化 方 法, 选 择 相 对 于 总 体 标 准 品 比 率 在 置 信 级 字 段 输 入 99 % 对 范 围 选 择 蛋 白 质 编 辑 群 组 比 较 窗 口 如 下 所 示 : 63

单 击 确 定 按 钮 文 档 设 置 窗 口 如 下 所 示 : 单 击 确 定 按 钮 按 以 下 步 骤 可 查 看 您 刚 刚 定 义 的 群 组 比 较 : 在 视 图 菜 单 选 择 群 组 比 较 并 单 击 健 康 与 患 病 Skyline 会 显 示 如 下 的 网 格 : 如 果 倍 数 变 化 结 果 列 不 显 示 完 整 的 置 信 区 间, 则 双 击 倍 数 变 化 结 果 和 已 调 整 的 p 值 标 题 之 间 的 垂 直 线 若 要 查 看 已 记 录 的 倍 数 变 化 值 和 置 信 区 间 图 表 : 64

单 击 网 格 视 图 中 工 具 栏 上 方 菜 单 的 显 示 图 形 按 钮 Skyline 会 添 加 一 个 图 形 标 签 到 健 康 与 患 病 视 图, 如 下 所 示 : 单 击 并 拖 拽 视 图 底 部 的 健 康 与 患 病 : 图 形 标 签, 直 至 出 现 一 个 蓝 色 悬 浮 矩 形 松 开 鼠 标 按 钮, 调 整 网 格 和 图 形 视 图, 进 行 并 行 查 看 在 网 格 上 单 击 倍 数 变 化 结 果 标 题, 在 出 现 的 菜 单 上 单 击 升 序 排 序 这 样 网 格 将 被 整 理, 而 如 果 您 切 换 回 图 形, 您 会 看 到 图 形 也 已 被 整 理 请 注 意, 有 许 多 置 信 区 间 的 触 须 线 横 跨 了 基 准 线, 说 明 在 99% 的 置 信 度 下, 观 测 数 据 随 机 出 现 十 分 寻 常, 而 且 这 还 是 在 没 有 对 多 重 假 设 检 验 做 任 何 更 正 的 情 况 下 发 生 的 在 网 格 视 图 中 按 以 下 步 骤, 可 基 于 Benjamini-Hochberg 已 调 整 的 P 值 设 置 阈 值, 这 种 方 法 可 以 估 计 错 误 发 现 率 (FDR): 单 击 已 调 整 的 P 值 标 题, 再 单 击 过 滤 器 在 过 滤 器 类 型 字 段, 选 择 小 于 在 其 下 方 的 字 段 输 入 0.01 单 击 确 定 按 钮 您 会 看 到 网 格 工 具 栏 显 示 的 行 数 从 48 减 少 到 14, 图 形 如 下 所 示 : 65

请 注 意, 显 著 变 化 的 蛋 白 质 列 表 包 括 您 早 前 检 查 过 的 S 蛋 白 质, 且 它 只 包 括 两 个 有 问 题 的 降 解 肽 段 和 一 个 标 准 化 肽 段 在 某 种 程 度 上, 这 指 出 了 未 能 使 样 本 顺 序 随 机 化 可 引 起 的 问 题 因 为 在 所 有 三 组 测 量 循 环 中, 先 测 定 患 病 组 受 试 对 象 后 测 定 健 康 组 受 试 对 象, 应 该 考 虑 到 任 何 不 计 入 标 准 化 的 降 解 均 将 会 使 得 倍 数 变 化 在 患 病 组 中 上 调 且 在 本 数 据 集 中, 对 于 S 蛋 白 质 里 所 有 在 患 病 组 中 几 乎 没 有 显 著 上 调 的 蛋 白 质, 我 们 应 以 怀 疑 的 态 度 看 待 它 正 确 指 定 技 术 重 复 测 定 如 果 您 如 本 实 验 一 样 收 集 技 术 重 复 测 定 数 据, 有 一 点 对 您 的 统 计 推 断 极 其 重 要, 即 您 需 在 编 辑 群 组 比 较 窗 口 中 正 确 地 指 定 这 些 重 复 测 定 如 果 您 没 有 正 确 指 定, 那 么 每 一 个 测 量 均 将 被 认 为 来 自 一 个 不 同 的 生 物 受 试 对 象, 这 样 会 错 误 地 缩 小 您 的 标 准 偏 差, 最 终 降 低 置 信 区 间 且 导 致 人 为 地 降 低 P 值 按 以 下 步 骤 可 查 看 实 际 运 行 情 况 : 单 击 网 格 视 图 中 工 具 栏 上 方 菜 单 的 更 改 设 置 文 本 对 身 份 注 释, 选 择 顶 部 的 空 白 元 素 您 会 看 到 网 格 视 图 显 示 了 37 行 ( 图 形 显 示 37 个 条 带 ), 已 调 整 的 p 值 小 于 0.01 这 是 因 为 现 在 的 统 计 是 假 设 您 有 42 个 不 同 的 受 试 对 象 进 行 计 算 的, 而 不 是 14 个 受 试 对 象 每 个 受 试 对 象 做 3 组 测 量 这 是 很 重 要 的 差 别, 如 您 所 见, 在 这 一 步 出 错 可 能 造 成 十 分 尴 尬 过 度 乐 观 的 统 计 推 断 在 健 康 组 和 患 病 组 间, 原 本 有 14 个 蛋 白 质 的 平 均 值 在 统 计 上 有 显 著 差 异,FDR 约 为 1%, 而 在 这 种 情 况 下, 却 增 长 到 37 个 蛋 白 质 66

按 区 分 调 整 回 到 本 实 验 最 初 的 目 的, 现 在 您 可 以 将 本 文 档 缩 减 为 仅 仅 一 个 肽 段 子 集, 这 些 肽 段 的 组 平 均 值 在 统 计 上 有 显 著 的 差 异,FDR 大 约 为 1% 但 需 要 注 意 的 是, 由 于 缺 乏 随 机 化 ( 患 病 组 始 终 在 健 康 组 前 测 量 ) 以 及 在 运 行 中 的 系 统 信 号 下 降, 这 组 数 据 集 可 能 夸 大 了 患 病 组 中 上 调 的 显 著 性 尽 管 如 此, 您 仍 可 以 按 以 下 步 骤 将 此 文 档 的 目 标 列 表 缩 减 为 一 组 组 平 均 值 差 异 大 约 为 1% FDR 的 肽 段 : 在 健 康 与 患 病 : 设 置 分 类 中 将 身 份 注 释 字 段 改 回 到 SubjectId 在 文 件 菜 单 上 单 击 另 存 为 将 文 档 保 存 为 名 称 Rat_plasma-diff.sky 在 健 康 与 患 病 : 设 置 分 类 中 选 择 范 围 栏 中 的 肽 段 选 项 单 击 已 调 整 的 P 值 标 题, 再 单 击 过 滤 器 在 过 滤 器 类 型 字 段, 选 择 大 于 或 等 于 单 击 确 定 按 钮 健 康 与 患 病 : 网 格 会 在 1% FDR 阈 值 上 方 显 示 92 行, 图 形 如 下 所 示 : 按 以 下 步 骤 可 将 这 些 肽 段 从 文 档 中 删 除 : 单 击 健 康 与 患 病 : 网 格 左 上 角 的 灰 色 矩 形, 即 行 与 列 标 题 相 交 处, 来 选 中 所 有 单 元 格 向 下 滚 动 网 格 直 到 您 找 到 S 蛋 白 质 中 的 VVLSGSDATLAYSAFK 肽 段 按 住 Ctrl 键 并 单 击 此 行 的 行 标 题 可 取 消 选 中 此 网 格 如 下 所 示 : 67

请 注 意,VVLSGSDATLAYSAFK 肽 段 的 倍 数 变 化 为 1,99% 的 置 信 区 间 为 1 至 1 这 是 作 为 标 准 化 全 局 标 准 的 单 一 肽 段 建 议 您 不 要 从 文 档 中 删 除 这 个 肽 段 这 就 是 取 消 选 定 它 的 原 因 单 击 网 格 工 具 栏 中 的 按 钮 Skyline 将 显 示 以 下 消 息 用 以 确 定 您 是 否 真 想 删 除 所 选 的 行 : 单 击 确 定 按 钮 现 在 您 可 以 关 闭 群 组 比 较 窗 口, 查 看 文 档 内 剩 余 的 34 个 肽 段 虽 然 这 些 肽 段 的 分 布 即 使 仅 在 一 个 标 准 偏 差 也 有 重 叠, 但 所 有 这 些 肽 段 均 会 显 示 两 个 群 组 平 均 值 的 差 异 也 就 是 说, 您 会 看 到 标 准 偏 差 触 须 线 在 峰 面 积 图 形 重 叠, 而 这 些 图 形 会 仍 显 示 按 状 态 分 组 的 峰 面 积 68

结 论 在 本 教 程 中, 您 学 习 到 了 一 些 视 觉 评 估 和 峰 积 分 的 更 正 方 法, 这 些 是 Skyline 对 所 有 导 入 的 LC- MS/MS 色 谱 数 据 自 动 执 行 的 操 作 尽 管 您 只 处 理 了 一 组 非 标 记 的 SRM 数 据 集, 但 您 在 本 教 程 应 用 的 技 巧 可 同 样 应 用 于 其 他 基 于 色 谱 的 定 量 方 法 的 数 据 这 项 检 查 和 更 正 需 手 动 操 作 的 性 质 使 其 完 美 适 合 于 包 括 不 超 过 两 千 个 肽 段 的 数 据 集 在 本 例 中,137 个 肽 段 花 费 了 大 约 1 小 时 来 处 理, 这 意 味 着 一 组 拥 有 2,000 个 肽 段 的 数 据 集 可 能 需 要 花 上 2 天 以 上 的 时 间 对 于 更 大 的 数 据 集, 建 议 您 首 先 了 解 肽 段 最 初 显 示 关 于 您 正 研 究 的 各 种 状 态 之 间 的 差 异, 然 后 根 据 这 份 信 息 对 肽 段 执 行 一 些 粗 略 的 筛 检 这 样 的 话, 您 仅 需 花 时 间 处 理 此 种 类 型 的 潜 在 相 关 肽 段 的 手 动 检 查 和 更 正 现 在 通 过 使 用 Skyline 群 组 比 较 支 持, 您 应 能 够 使 用 这 种 方 法 实 现 这 种 过 滤 结 果 您 可 以 对 已 调 整 的 p 值 ( 或 FDR 阈 值 ) 放 宽 限 制, 可 比 在 本 教 程 中 使 用 的 1% 略 宽 松, 但 方 法 仍 是 相 似 的 现 在 通 过 了 解 这 种 类 型 的 处 理 和 对 Skyline 具 备 的 功 能 的 专 业 使 用 方 法, 您 已 明 白 它 们 是 怎 样 帮 您 理 解 和 更 正 您 的 定 量 实 验 中 潜 在 的 错 误 来 源 同 时 您 也 亲 自 处 理 了 分 配 错 误 的 峰 干 扰 峰 截 短 丰 度 值 级 别 很 难 检 测 的 肽 段 200 倍 肽 段 信 号 降 解 和 共 洗 脱 肽 段 Skyline 提 供 了 一 系 列 工 具 用 于 理 解 更 正 和 注 释 这 些 问 题, 掌 握 了 这 些 工 具 后, 您 应 该 能 够 减 少 定 量 靶 向 蛋 白 质 组 学 实 验 中 的 错 误, 并 更 有 效 地 理 解 一 些 生 物 学 上 的 见 解 参 考 文 献 1. Bereman, M. S., MacLean, B., Tomazela, D. M., Liebler, D. C. & MacCoss, M. J.The d evelopment of selected reaction monitoring methods for targeted proteomics via emp irical refinement.proteomics 12, 1134 1141 (2012). 2. Zhang, H. et al.methods for Peptide and Protein Quantitation by Liquid Chromatogra phy-multiple Reaction Monitoring Mass Spectrometry.Mol.Cell.Proteomics MCP 10, (20 11). 69