生物技术通报 研究报告 IOTECHNOLOGY ULLETIN 05, (0):6- 重组人纤溶酶原激活剂转基因兔的制备及其表达产物的 检测 陆睿 宋绍征 祁正强 葛欣 邵宾 成勇 江苏省转基因动物制药工程研究中心扬州 5009 摘 要 人组织纤溶酶原激活剂 ht-pa 是临床血栓疾病治疗的主要生物药品应用转基因动物乳腺生物反应器制备已有 报道但重组人纤溶酶原激活剂 rhpa 在转基因动物中表达尚未见报道 设计了以人 t-pa 的 F E K 区位点缺失体为编码序 列以山羊 β- 酪蛋白 /CMV 杂合启动 / 增强子构建了乳腺特异性表达载体 PCL5/rhPA通过受精卵原核显微注射法制备转基因兔 用 PCR 检测及其产物测序筛选转基因兔ELISA 试剂盒及纤维蛋白平板溶圈法检测转基因兔的表达产物 实验获得原代转基因兔 5 只 其中 只乳腺中表达人重组纤溶酶原激活剂rhPA 浓度最高可达 00 μg/ml表达产物比活性是现有阿替普酶 的 50-00 倍 实验结果表明重组人纤溶酶原激活剂 rhpa 可以在山羊 β-酪蛋白 /CMV 杂合启动 / 增强子调控下获得乳腺特 异性表达表达重组蛋白具有较高的溶栓活性 关键词 转基因兔 人组织纤溶酶原激活剂 ht-pa 乳腺特异性表达 DOI 0.560/j.cnki.biotech.bull.985.05.0.0 Preparation of Recombinant Human Plasminogen Activator in Rabbit Mammary Gland and Detection of Expressed Products Lu Rui Song Shaozheng Qi Zhengqiang Ge Xin Shao in Cheng Yong Engineering Research Centre for Transgenic Animal Pharming of Jiangsu ProvinceYangzhou 5009 Abstract: Human tissue-type plasminogen activator ht-pa is a major biomedicine used in the clinical treatment of thrombotic diseases. There have been some reports on transgenic animal mammary gland as bioreactor producing ht-pa, however, there has been no report about recombinant human-tissue plasminogen activator rhpa expressed in transgenic animals. Here we report the preparation of transgenic rabbits by microinjection of fertilized eggs with the constructed mammary gland-specifically expressed vector of PCL5/rhPA while using F, E, and K loci deletants of human t-pa as coding sequence driven by the goat beta-casein/cmv chimeric promoter. PCR and sequencing PCR products were used to identify the transgenic rabbits from candidates, and ELISA and fibrin agarose plate assay FAPA to analyze the expressed products of the transgenic rabbits. Results showed that 5 rabbits, were transgenic rabbits and rhpa were expressed in their milk of rabbits with maximum content of 00 μg/ml, and its biological activity was 50-00 times of alteplase. This study implies that rhpa can be expressed specifically in the mammary glands under the regulation of goat beta-casein/cmv chimeric promoter, and the expressed recombinant protein possesses the high activity of thrombolysis. Key words: transgene rabbit human tissue-type plasminogen activator ht-pa mammary gland-specifically expression 血栓病是心脑血管疾病中死亡率和严重致残率 较高的人类重大疾病之一在国内外有较高的病率 虽然人组织纤溶酶原激活剂 ht-pa 是目前临床血 栓疾病的治疗主要生物药品之一但是有着出血副 收稿日期 05-0-9 江苏省科技支撑项目 E0679 江苏省优势学科建设工程资助项目 基金项目 国家转基因生物新品种培育重大专项 0ZX08008-00 大学研究生科研创新项目 CXLX-5 扬州大学研究生科研创新项目 CXLX-5 作者简介 陆睿男硕士研究方向 动物转基因与生物制药 E-mail halurui@6.com 通讯作者 成勇男博士研究方向 动物胚胎工程 克隆 和动物转基因 E-mail chengyong@yzu.edu.cn
陆睿等 重组人纤溶酶原激活剂转基因兔的制备及其表达产物的检测 05,(0) 7 作用较大 半衰期短的缺点 重组人纤溶酶原 HCG 097丽珠集团丽珠制药厂 胎牛血清 激活剂 rhpaf E K 区缺失体 具有出血副作 SH0070.0HyClone M G80Sigma 用小 半衰期长 溶栓活性高等特点能够更安全 M6 A8Sigma 引物为生工生物工程 上 -7 目前用于血栓疾病治疗的 海 有限公司合成 ELISA 试剂盒为上海西唐生物 重组药用蛋白主要靠原核生物生产具有生物溶栓 科技有限公司产品 阿替普酶 oehringer Ingelheim 活性较低 生产成本高等缺点 使用转基因动物乳 Pharma Gmbh & Co. Kg 纤 维 蛋 白 原 F860 腺生物反应器可获得活性高 生产成本低的重组药 Sigma 凝血酶 T68Sigma 组织裂解液 冲 有效地治疗血栓病 用蛋白 卵液自配 参照小鼠胚胎操作实验手册 所用药品 均购自 Sigma 公司 家兔是最早用于胚胎移植等研究的实验动物之 一具有多胎 妊娠期短 繁殖快 全年多发情.. 产仔率高等优点并且泌乳能力较高因而可用家 验室 兔乳腺生产重组药用蛋白 受精卵原核显微注射制.. 备转基因动物早有报道但依然是一种相当合适的 DNA 扩增仪 S000 Thermal Cycler io-rad 美国 酶标仪 RT-6000Rayto深圳 常规小动物手术 PCL5/rhPA通过受精卵原核显微注射法制备转基 器械 因兔.. 材料与方法 乳腺特异性表达载体 质粒 PCL5/rhPA 由 本实验室制备并保存 在乳腺特异性表达载体 pc 的 Xho I 限 制 性 酶 切 位 点 处 插 入 化 学 合 成 的 rhpa 材料 试剂 倒置显微镜和显微操作仪 针 仪 P-7 Micropipette PullerNarisgige 日 本 杂 合 启 动 / 增 强 子 构 建 了 乳 腺 特 异 性 表 达 载 体.. 主要仪器和器具 CO 培养箱 No.Forma Science Inc. 美国 拉 K 区位点缺失体为编码序列以山羊 β-酪蛋白 /CMV. 性成熟的中国家兔饲养于本实 Leica德国 体视显微镜 厦门麦克奥迪公司 制备转基因兔的方法 本研究以人 t-pa 的 F E 实验动物 Not I Sal I Taq 等酶为大连 TaKaRa cdna 片段 构建成的含有目的基因 rhpa cdna 片 公司产品 苯酚 氯仿 无水乙醇等均为国产分析 段的乳腺特异性表达载体命名为 PCL5/rhPA大小 纯 DNA 胶回收纯化试剂盒 8770QIAGEN 为 6 bp 用 Not I 和 Sal I 双酶切去除原核基 FSH 0069 宁 波 市 三 生 药 业 有 限 公 司 因片段并使之线性化 图 Sal I LCR 5 β-casein β-casein rhpa 6700 bp 000 bp 图. Not I 乳腺特异性表达载体 PCL5/rhPA 结构 U/ 只 第 天 7 00 肌 肉 注 射 FSH 0 U/ 只9 方法 用 Not I 和 Sal I 双酶 00 肌 肉 注 射 FSH 5 U/ 只 第 天 7 00 肌 肉 注 射 切质粒 PCL5/rhPA用 DNA 胶回收纯化试剂盒回 FSH 5 U/ 只9 00 静脉注射 hcg 00 U/ 只后与正 收真核部分供显微注射用 用 TE 缓冲液 5 mmol/l 常公兔配种 第 5 天 00 手术取卵 89.. 显微注射用基因制备 在供体兔配种的同时挑取自然发情的成年母 TrispH 7. 0. mmol/l EDTA 溶解定量为 5 ng/μl 分装为 0 μl/ 管-0 短暂低温保存 兔作受体兔耳缘静脉注射 HCG 00 U/ 只以备次.. 日手术移植 母兔发情的主要标志为阴道黏膜呈潮 兔超数排卵 挑选未发情成年母兔作为供体 兔第 天 9 00 肌肉注射 FSH 5 U/ 只 第 天 7 红色 00 肌肉注射 FSH 5 U/ 只9 00 肌肉注射 FSH 0.. 回收胚胎 供体兔注射 hcg 后 7 h仰卧保
生物技术通报 iotechnology ulletin 8 定静脉空气针处死兔无菌剖腹取出卵巢和输卵 观察 管连同子宫移到实验室胚胎间剪除粘附的脂肪 反复冲洗直至不再出血为止用.5 ml 注射器吸取 冲卵液从子宫方向朝输卵管喇叭口方向冲胚回收 受精卵细胞在体视显微镜下计数观察.. 显微注射与移植 将已回收定量的显微注射 片导入受精卵的雄原核内培养 0 min 后手术移植. 结果 显微注射片段纯化回收 用 Not I 和 Sal I 双酶切质粒 PCL5/rhPA使用 胶回收纯化试剂盒纯化 6 700 bp 片段作显微注射片 段电泳结果见图 到同步发情的受体母体输卵管内待孕..5 PCR 检测 05,Vol.,No.0 利用 Primer5.0 设计检测引物上 M bp 游引物 F 位于 CMV下游引物 R 位于 rhpa 编码区 99 77 6 5 7 690 扩增产物大小为 556 bp跨越 CMV 与 rhpa 接头区 引物序列如下 F 5'-CGTGGATAGCGGTTTGA -'R 5'-GAGCCCTCCTTTGATGC -' PCR 参数为 95 预变性 5 min 9 变性 5 s 88 89 57 退火 5 s7 延伸 min共 0 个循环 最 后 7 延伸 0 min..6 转 基 因 兔 乳 腺 特 异 性 rhpa 表 达 检 测 转 质粒 PCL5/rhPA 质粒 PCL5/rhPA 经 Not I 和 Sal I 双酶切后产物 显微注射用 DNA 片段 双蒸水 5 λ-ecot DNA Marker 图 基 因 母 兔 配 种 怀 孕 挤 奶 收 集 乳 汁 乳 汁 离 心 Not I 和 Sal I 双酶切 PCL5/rhPA 电泳结果 0 000 g0 min去除上层脂肪及下层浑浊吸 取乳清 用上海西唐生物科技有限公司 ELISA 试剂. 整合检测结果 通过对 8 只供体兔超数排卵获得 5 枚受精卵 盒检测具体操作见说明书 使用纤维蛋白 挑选较好的 枚受精卵进行显微注射培养后再 平 板 法 FAPA 检 测 rhpa 的 生 物 活 性 0 以 挑选其中形态较好的 09 枚移植到 5 只同步发情的 PS 为溶剂配制.0% 琼脂糖凝胶 0 mg/ml 纤 母兔输卵管中其中 只怀孕妊娠到期共出生 9 维蛋白原 制品中含少量的纤溶酶原Fibrinogen 只仔兔 经 PCR 及产物测序筛选 共获得 5 只兔 F U/mL 凝血酶 ThrombinT 煮沸熔化琼脂 整合有目的基因 图 出生仔兔整合率为 糖凝胶取 0 ml 置小烧杯内待其温度降至 55-9.7% 两只公兔 K9 K0 分别与正常母兔配种 60 取预热至 7 的纤维蛋白原 ml 注入摇匀 获得 K9 F 代整合兔 只 K0 F 代 再取预热至 的凝血酶注入摇匀后迅速倒入直 整合兔 7 只 图 径为 9 cm 的玻璃培养皿内室温凝固后打孔 封底...7 转基因兔表达产物活性检测 每孔加入 0 μl 样品放置 7 恒温箱孵育过夜后 5 6 7 8 9 0 ELISA检测结果 只原代母兔乳清经 ELISA 检测其中 A0 乳 M 5 6 7 8 9 DW WT WT P P -9 F0 代待测兔基因组 DW 双蒸水作空白对照 WTWT 正常兔基因组 M DL000 DNA Marker P P 显微注射片段 PCR 扩增产物作阳性对照 图 F0 代仔兔 PCR 检测结果
9 陆睿等 重组人纤溶酶原激活剂转基因兔的制备及其表达产物的检测 05,(0) 5 6 7 8 9 0 5 6 7 8 DW M WT P -6 K9 F 代仔兔基因组 7-8 K0 F 代仔兔基因组 DW 双蒸水作空白对照 M DL000 DNA Marker WT 正常兔基因组作阴性对照 P 显微注射片段 PCR 扩增产物作阳性对照 图 原代转基因公兔 F 代仔兔 PCR 检测结果 00 A 乳清中未检测出 两只原代公兔的 F 代母兔 00 K9- K0-6 乳清经 ELISA 检测 图 5 其中 K9- 乳清中检测到重组人纤溶酶原激活剂 rhpa 但 K0-6 乳 清 中 未 检 测 出 A0 乳 清 中 rhpa 含 量 为 60 μg/mlk9- 乳清中 rhpa 含量为 00 μg/ml 图 5 和图 6 中结果均为样品稀释 500 倍后实验所得 5 6 7 Concentration of rhpa/ ng ml- 清中检测到重组人纤溶酶原激活剂 rhpa A Alteplase standard curve 000 800 600 600 00 00 00 0 A 00 75 A 8.8 7.5 0 0. 0. 50 0.6 OD80.0 0.8.. 阿 替 普 酶 浓 度 标 准 曲 线 8.8 ng/ml7.5 ng/ml75 ng/ml50 ng/ml 00 ng/ml600 ng/ml00 ng/ml A 转基因兔 A0 奶样稀释 500 倍检 测结果 0 ng/ml 转基因兔 K9- 奶样稀释 500 倍检测结果 800 C ng/ml 图6 A0 乳清及 K9- 乳汁中 rhpa 浓度 D A-A7 阿替普酶用 PS 倍比稀释作阳性对照浓度依次为 00 600 A 00 50 75 7.5 和 8.8 ng/ml - PS 5-7C-C 正常兔奶样 C-C7D 依次为转基因兔 A0AAK0-6K9- 奶样 图5. C ELISA 检测 5 只雌性转基因兔乳清中 rhpa F 纤维蛋白平板溶圈法检测结果 D G K 经纤维蛋白平板溶圈法的体外活性检测结果 E H L I J M 图 7 表明两只表达兔的表达产物均具有体外溶纤 活性 其中 K9- 表达的 rhpa 活性约为阿替普酶 50-00 倍 重组人纤溶酶原激活剂转基因表达兔 A-E 转 基 因 兔 A0AAK9-K0-6 奶 样 F-J 阿 替 普 酶 用 K9- 及 A0 如图 8 所示 μg/ml0.0 μg/ml K PS L-M 正常兔奶样作阴性对照 讨论 人组织纤溶酶原激活剂 ht-pa 由 5 个功能相 PS 倍比稀释作阳性对照浓度依次为 00 μg/ml0 μg/ml μg/ml0. 图7 纤维蛋白平板溶圈法检测 5 只雌性转基因兔乳清中 rhpa 生物活性 对独立的结构域组成 F 区 E 区 三角区 K 的清除相关K P 区是与 t-pa 蛋白功能相关的重 三角区 K P 区 其中 F E K 区与 t-pa 在体内 要区域 Smalling 等 在 995 年报道了缺失 F E
0 生 物 技 术 通 报 iotechnology ulletin 05,Vol.,No.0 A A :K9-, 乳 汁 中 rhpa 浓 度 为 00 μg/ml ; :A0, 乳 汁 中 rhpa 浓 度 为 60 μg/ml 图 8 重 组 人 纤 溶 酶 原 激 活 剂 转 基 因 表 达 兔 K 片 段 可 延 长 纤 溶 酶 原 激 活 剂 在 体 内 的 溶 栓 作 用 时 间 及 更 好 的 溶 栓 特 性 本 研 究 以 ht-pa 的 F E K 区 位 点 缺 失 体 为 编 码 序 列, 构 建 了 乳 腺 特 异 性 表 达 载 体, 并 且 重 组 编 码 序 列 rhpa 基 因 可 以 在 转 基 因 家 兔 乳 腺 细 胞 中 表 达, 表 达 重 组 蛋 白 分 泌 到 乳 汁 中, 这 在 国 内 外 尚 未 见 报 道 本 研 究 中 的 乳 腺 特 异 性 表 达 载 体 上 携 带 山 羊 β- [] 酪 蛋 白 /CMV 杂 合 启 动 / 增 强 子 成 勇 在 007 年 报 道 了 山 羊 β- 酪 蛋 白 /CMV 杂 合 启 动 / 增 强 子 驱 动 人 乳 铁 蛋 白 (hlf) 在 小 鼠 乳 腺 中 特 异 性 表 达, 表 达 水 平 可 达 -8. g/l, 并 且 在 血 清 及 唾 液 中 均 未 检 测 到 rhlf 表 达, 表 明 山 羊 β- 酪 蛋 白 /CMV 杂 合 启 动 / 增 强 子 用 于 乳 腺 生 物 反 应 器 既 可 提 高 目 的 蛋 白 表 达 量 又 能 保 证 表 达 特 异 性 哺 乳 动 物 乳 腺 细 胞 相 对 于 原 核 生 物 及 酵 母 具 有 翻 译 后 更 完 善 的 修 饰 和 加 工 能 力, 从 而 能 保 证 表 达 [] 产 物 能 有 更 高 的 生 物 活 性 田 文 静 于 00 年 报 道 了 瑞 替 普 酶 (rhpa,f E K 区 缺 失 体 ) 在 大 肠 杆 菌 中 表 达, 表 达 产 物 复 性 后 具 有 溶 栓 活 性 本 研 究 用 山 羊 β- 酪 蛋 白 /CMV 杂 合 启 动 / 增 强 子 驱 动 ht-pa 的 F E K 区 位 点 缺 失 体 编 码 序 列 在 家 兔 乳 腺 中 表 达 体 外 溶 纤 试 验 的 结 果 表 明, 表 达 产 物 具 有 溶 纤 活 性, 其 溶 栓 活 性 是 药 品 阿 替 普 酶 的 50-00 倍, 这 一 结 果 也 提 示 我 们, 不 仅 重 组 纤 溶 酶 原 激 活 剂 可 以 实 现 乳 腺 特 异 性 表 达, 而 且 重 组 体 有 更 好 的 药 理 学 特 性, 该 结 果 显 示 转 基 因 动 物 生 产 rhpa 的 优 势, 也 为 溶 血 栓 新 药 的 创 制 提 供 了 有 应 用 价 值 的 材 料 据 世 界 卫 生 组 织 (WHO) 统 计 分 析, 全 球 平 均 每 年 有 700 万 人 以 上 死 于 心 脑 血 管 病 ( 脑 血 栓 和 心 肌 梗 死 ), 临 床 上 对 溶 血 栓 药 的 需 求 量 很 大 目 前 国 内 纤 溶 酶 原 激 活 剂 溶 栓 药 物 中 有 阿 替 普 酶 瑞 替 普 酶 孟 替 普 酶 替 尼 普 酶 等, 但 这 些 溶 血 栓 药 大 部 分 是 由 大 肠 杆 菌 生 产, 比 活 性 较 低, 使 用 副 作 用 大 此 外, 这 些 产 品 都 是 国 外 专 利 产 品, 无 自 主 知 识 产 权, 因 此 价 格 昂 贵, 大 众 使 用 受 到 限 制 乳 腺 生 物 反 应 器 制 备 的 rhpa 具 有 比 活 性 高 半 衰 期 长 产 量 高 价 格 便 宜 等 特 点, 临 床 应 用 时 可 减 少 药 物 用 量 从 而 减 小 毒 副 作 用 结 论 本 研 究 设 计 了 重 组 人 纤 溶 酶 原 激 活 剂 编 码 序 列 (rhpa,f E K 区 缺 失 体 ), 并 获 得 了 乳 腺 特 异 性 表 达 rhpa 基 因 转 基 因 兔, 乳 汁 中 rhpa 表 达 水 平 达 00 μg/ml,rhpa 比 活 性 是 药 品 阿 替 普 酶 (ht-pa) 的 50-00 倍 参 考 文 献 []Sun XH, erthiller J, Trouillas P, et al. Early fibrinogen degradation coagulopathy :A predictive factor of parenchymal hematomas in cerebral rt-pa thrombolysis[j]. Journal of the Neurological Sciences, 05, 5(-):09-. []Collen D, Lijnen HR. The Tissue-Type Plasminogen Activator Story. Arteriosclerosis[J]. Thrombosis and Vascular iology, 009, 9(8): 5-55. []Smalling RW, ode C, Kalbfleish J, et al. More rapid, complete, and stable coronary thrombolysis with bolus administration of reteplase compared with alteplase infusion in acute myocardial in farction[j]. Circulation, 995, 9():75-7. [] 冮 洁, 路 福 平, 杜 连 祥. 组 织 型 纤 溶 酶 原 激 活 剂 - 及 其 突 变 体 的 表 达 研 究 进 展 [J]. 药 物 生 物 技 术, 00, 0():5-55. [5] 江 成 英, 郭 宏 文, 冮 洁. 人 组 织 型 纤 溶 酶 原 激 活 剂 - 突 变 体 的 研 究 现 状 及 进 展 [J]. 农 产 品 加 工 学 刊, 008, (7): -. [6] 周 雪 艳. 瑞 替 普 酶 (rpa) 及 其 突 变 体 的 构 建 和 在 大 肠 杆 菌 与 CHO 细 胞 中 的 表 达 研 究 [D]. 长 春 : 吉 林 大 学, 006. [7] 黄 坚, 龙 青, 任 启 生 等. 重 组 基 因 在 毕 赤 酵 母 细 胞 中 的 胞 内 表 达 研 究 [J]. 中 国 生 化 药 物 杂 志, 00, ():58-6. [8] 宋 绍 征, 葛 欣, 张 利 清, 等. 家 兔 超 数 排 卵 和 胚 胎 移 植 妊 娠 率
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