保健食品功能学评价程序和检验方法

保 健 食 品 功 能 学 评 价 程 序 和 检 验 方 法 (1996 年 7 月 18 日 卫 监 发 [1996]38 号 发 布, 自 发 布 之 日 起 实 行 ) 1. 主 题 内 容 和 适 用 范 围 本 程 序 和 检 验 方 法 规 定 了 评 价 食 品 保 健 作 用 的 统 一 程 序 和 检 验 方 法 本 程 序 和 检 验 方 法 适 用 于 评 价 食 品 的 免 疫 调 节 延 缓 衰 老 改 善 记 忆 促 进 生 长 发 育 抗 疲 劳 减 肥 耐 缺 氧 抗 辐 射 抗 突 变 抑 制 肿 瘤 调 节 血 脂 改 善 性 功 能 等 作 用 本 程 序 和 检 验 方 法 规 定 了 评 价 食 品 保 健 作 用 的 人 体 试 食 试 验 规 程 2. 进 行 食 品 保 健 作 用 评 价 的 基 本 要 求 2.1 对 受 试 物 的 要 求 2.1.1 提 供 受 试 物 的 物 理 化 学 性 质 ( 包 括 化 学 结 构 纯 度 稳 定 性 等 ) 等 有 关 资 料 2.1.2 受 试 物 必 须 是 规 格 化 的 产 品, 即 符 合 既 定 的 生 产 工 艺 配 方 及 质 量 标 准 2.1.3 提 供 受 试 物 安 全 性 毒 理 学 评 价 的 资 料, 受 试 物 必 须 是 已 经 过 食 品 安 全 性 毒 理 学 评 价 确 认 为 安 全 的 物 质 2.2 对 实 验 动 物 的 要 求 2.2.1 根 据 各 种 试 验 的 具 体 要 求, 合 理 选 择 实 验 动 物 常 用 大 鼠 和 小 鼠, 品 系 不 限, 推 荐 使 用 近 交 系 动 物 2.2.2 动 物 的 性 别 不 限, 可 根 据 试 验 需 要 进 行 选 择 动 物 的 数 量 的 要 求 为 小 鼠 每 组 至 少 10 只 ( 单 一 性 别 ), 大 鼠 每 组 至 少 8 只 ( 单 一 性 别 ) 动 物 的 年 龄 可 根 据 具 体 试 验 需 要 而 定 2.2.3 动 物 应 达 到 二 级 实 验 动 物 的 要 求 2.3 给 受 试 物 的 剂 量 及 时 间 2.3.1 各 种 试 验 至 少 应 设 3 个 剂 量 组,1 个 对 照 组, 必 要 时 可 设 阳 性 对 照 组 剂 量 选 择 应 合 理, 尽 可 能 找 出 最 低 有 效 剂 量 在 3 个 剂 量 组 中, 其 中 一 个 剂 量 应 相 当 于 人 推 荐 摄 入 量 的 5-10 倍 左 右 2.3.2 给 受 试 物 的 时 间 应 根 据 具 体 试 验 而 定, 原 则 上 至 少 1 个 月 3. 试 验 项 目 试 验 原 则 及 结 果 判 定 3.1 免 疫 调 节 作 用 3.1.1 试 验 项 目 3.1.1.1.1 脏 器 / 体 重 比 值 胸 腺 / 体 重 比 值 脾 脏 / 体 重 比 值 3.1.1.1.2 细 胞 免 疫 功 能 测 定 小 鼠 脾 淋 巴 细 胞 转 化 实 验

迟 发 型 变 态 反 应 3.1.1.1.3 体 液 免 疫 功 能 测 定 抗 体 生 成 细 胞 检 测 血 清 溶 血 素 测 定 3.1.1.1.4 单 核 - 巨 噬 细 胞 功 能 测 定 小 鼠 碳 廓 清 试 验 小 鼠 腹 腔 巨 噬 细 胞 吞 噬 鸡 红 细 胞 试 验 3.1.1.1.5 N 细 胞 活 性 测 定 3.1.1.2 人 体 试 食 试 验 3.1.1.2.1 细 胞 免 疫 功 能 测 定 外 周 血 淋 巴 细 胞 转 化 试 验 3.1.1.2.2 体 液 免 疫 功 能 试 验 单 向 免 疫 扩 散 法 测 定 IgG IgA IgM 3.1.1.2.3 非 特 异 性 免 疫 功 能 测 定 吞 噬 与 杀 菌 试 验 3.1.1.2.4 N 细 胞 活 性 测 定 3.1.2 试 验 原 则 要 求 选 择 一 组 能 够 全 面 反 映 免 疫 系 统 各 方 面 功 能 的 试 验, 其 中 细 胞 免 疫 体 液 免 疫 单 核 - 巨 噬 细 胞 功 能 三 个 方 面 至 少 各 选 择 1 种 试 验, 在 确 保 安 全 的 前 提 下 尽 可 能 进 行 人 体 试 食 试 验 3.1.3 结 果 判 定 在 一 组 试 验 中, 受 试 物 对 免 疫 系 统 某 方 面 的 试 验 具 有 增 强 作 用 而 对 其 他 试 验 无 抑 制 作 用, 可 以 判 定 该 受 试 物 具 有 该 方 面 的 免 疫 调 节 效 应 ; 对 任 何 一 项 免 疫 试 验 具 有 抑 制 作 用 可 判 定 该 受 试 物 具 有 免 疫 抑 制 效 应 在 细 胞 免 疫 功 能 体 液 免 疫 功 能 单 核 - 巨 噬 细 胞 功 能 及 N 细 胞 功 能 检 测 中, 如 有 两 个 以 上 ( 含 两 个 ) 功 能 检 测 结 果 阳 性, 即 可 判 定 该 受 试 物 具 有 免 疫 调 节 作 用 3.2 延 缓 衰 老 作 用 3.2.1 试 验 项 目 3.2.1.1 动 物 试 验 3.2.1.1.1 生 存 试 验 小 鼠 生 存 试 验 大 鼠 生 存 试 验 果 蝇 生 存 试 验 3.2.1.1.2 过 氧 化 脂 质 含 量 测 定 血 ( 或 组 织 ) 中 过 氧 化 脂 质 降 解 产 物 丙 二 醛 (MDA) 含 量 测 定

组 织 中 脂 褐 质 含 量 测 定 3.2.1.1.3 抗 氧 化 酶 活 力 测 定 血 ( 或 组 织 ) 中 超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD) 活 力 测 定 血 ( 或 组 织 ) 中 谷 胱 甘 肽 过 氧 化 物 酶 (GS-PX) 活 力 测 定 3.2.1.2 人 体 试 食 试 验 血 中 过 氧 化 脂 质 降 解 产 物 丙 二 醛 (MDA) 含 量 测 定 血 中 超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD) 活 力 测 定 血 中 谷 胱 甘 肽 过 氧 化 物 酶 (GS-PX) 活 力 测 定 3.2.2 试 验 原 则 衰 老 机 制 比 较 复 杂, 迄 今 尚 无 一 种 公 认 的 衰 老 机 制 学 说, 因 而 无 单 一 简 便 实 用 的 衰 老 指 标 可 供 应 用, 应 采 用 尽 可 能 多 的 试 验 方 法, 以 保 证 试 验 结 果 的 可 信 性 动 物 试 验, 除 上 述 生 存 试 验, 过 氧 化 脂 质 含 量 测 定 抗 氧 化 酶 活 力 测 定 3 个 方 面 各 选 一 项 必 做 外, 可 能 时 应 多 选 择 一 些 指 标 ( 如 脑 肝 组 织 中 单 胺 氧 化 酶 (MAO-B) 活 力 测 定 等 ) 加 以 辅 助 生 存 试 验 是 最 直 观 最 可 靠 的 实 验 方 法, 果 蝇 具 有 生 长 周 期 短 繁 殖 快 饲 养 简 便 等 优 点, 通 常 多 选 果 蝇 作 生 存 试 验, 但 果 蝇 种 系 分 类 地 位 与 人 较 远, 故 必 须 辅 助 过 氧 化 脂 质 含 量 测 定 及 抗 氧 化 酶 活 力 测 定 才 能 判 断 是 否 具 有 延 缓 衰 老 作 用 生 化 指 标 测 定 应 选 用 老 龄 鼠, 除 设 老 龄 对 照 外, 最 好 同 时 增 设 少 龄 对 照, 以 比 较 受 试 物 抗 氧 化 的 程 度, 必 要 时 可 将 动 物 试 验 与 人 体 试 食 试 验 相 结 合 综 合 评 价 3.2.3 结 果 判 定 若 大 鼠 或 小 鼠 生 存 试 验 为 阳 性, 即 可 判 定 该 受 试 物 具 有 延 缓 衰 老 的 作 用 若 果 蝇 生 存 试 验, 过 氧 化 脂 质 和 抗 氧 化 酶 三 项 指 标 均 为 阳 性, 即 可 判 定 该 受 试 物 具 有 延 缓 衰 老 的 作 用 若 过 氧 化 脂 质 和 抗 氧 化 酶 两 项 为 阳 性, 可 判 定 该 受 试 物 具 有 抗 氧 化 作 用, 并 提 示 可 能 具 有 延 缓 衰 老 作 用 3.3 改 善 记 忆 作 用 3.3.1 动 物 试 验 跳 台 试 验 避 暗 试 验 穿 梭 箱 试 验 水 迷 宫 试 验 3.3.1.2 人 体 试 食 试 验 韦 氏 记 忆 量 表 临 订 记 忆 量 表 3.3.2 试 验 原 则 3.3.2.1 试 验 应 通 过 训 练 前 训 练 后 及 重 测 验 前 3 种 不 同 的 给 予 受 试 物 方 法 观 察 其 对 记 忆 全 过 程 ( 记 忆 的 获 得 记 忆 巩 固 记 忆 再 现 ) 的 影 响 3.3.2.2 应 采 用 一 组 (2 个 以 上 ) 行 为 学 试 验 方 法, 以 保 证 实 验 结 果 的 可 靠 性 3.3.2.3 人 体 试 食 试 验 为 必 做 项 目, 并 应 在 动 物 试 验 有 效 的 前 提 下 进 行

3.3.2.4 除 上 述 试 验 项 目 外, 还 可 以 选 用 嗅 觉 厌 恶 试 验 味 觉 厌 恶 试 验 操 作 式 条 件 反 射 试 验, 连 续 强 化 程 序 试 验 比 率 程 序 试 验 间 隔 程 序 试 验 3.3.3 结 果 判 定 动 物 试 验 2 项 或 2 项 以 上 的 指 标 为 阳 性, 且 2 次 或 2 次 以 上 的 重 复 测 试 结 果 一 致, 可 以 认 为 该 受 试 物 具 有 改 善 该 类 动 物 记 忆 作 用 ; 若 人 体 试 食 试 验 结 果 阳 性, 则 可 认 为 该 受 试 物 具 有 改 善 人 体 记 忆 作 用 3.4 促 进 生 长 发 育 作 用 3.4.1 试 验 项 目 3.4.1.1 胎 仔 情 况 活 胎 数 雄 比 例 死 胎 数 分 娩 胎 仔 总 数 3.4.1.2 体 重 及 食 物 利 用 率 记 录 出 生 时 及 生 后 4 7 14 21 30 60d 幼 鼠 的 体 重, 计 算 断 乳 后 幼 鼠 的 食 物 利 用 率 3.4.1.3 生 理 发 育 指 标 记 录 耳 廓 分 离 门 齿 萌 出 开 眼 长 毛 时 间 阴 道 开 放 睾 丸 下 降 时 间 3.4.1.4 神 经 反 射 指 标 平 面 翻 正 前 肢 抓 力 悬 崖 回 避 嗅 觉 定 位 听 觉 警 戒 负 趋 地 性 回 旋 运 动 视 觉 发 育 空 中 翻 正 游 泳 发 育 3.4.2 试 验 原 则 3.4.2.1 给 受 试 物 的 时 间 可 根 据 具 体 情 况 选 择 在 母 鼠 孕 期 或 哺 乳 期 至 成 年 期 3.4.2.2 在 神 经 反 射 指 标 中 应 选 择 一 组 (5 个 以 上 ) 的 行 为 学 试 验 方 法, 以 保 证 结 果 的 可 靠 性 3.4.3 结 果 判 定 在 胎 仔 情 况 体 重 及 食 物 利 用 率 生 理 发 育 神 经 反 射 4 类 指 标 中 有 3 类 以 上 ( 含 3 类 ) 指 标 为 阳 性, 可 认 为 受 试 物 有 促 进 生 长 发 育 的 作 用 3.5 抗 疲 劳 作 用 3.5.1 试 验 项 目 负 重 游 泳 试 验 爬 杆 试 验 血 乳 血 清 尿 素 氮 肝 / 肌 糖 原 测 定 3.5.2 试 验 原 则 运 动 试 验 与 生 化 指 标 检 测 相 结 合 在 进 行 游 泳 或 爬 杆 试 验 前, 动 物 应 进 行 初 筛 除 以 上 生 化 指 标 外, 还 可 检 测 血 糖 乳 酸 胶 氢 血 红 蛋 白 以 及 磷 肌 酸 等 指 标 3.5.3 结 果 判 定 若 1 项 以 上 ( 含 1 项 ) 运 动 试 验 和 2 项 以 上 ( 含 2 项 ) 生 化 指 标 为 阳 性, 即 可 以 判 断 该 受 试 物 具 有 抗 疲 劳 作 用 3.6 减 肥 作 用 3.6.1 减 肥 原 则

3.6.1.1 减 除 体 现 人 多 余 的 脂 肪, 不 单 纯 以 减 轻 体 重 为 标 准 3.6.1.2 每 日 营 养 素 的 摄 入 量 应 基 本 保 证 机 体 正 常 生 命 活 动 的 要 求 3.6.1.3 对 机 体 健 康 无 明 显 损 害 3.6.2 试 验 项 目 3.6.2.1 动 物 试 验 体 重 体 内 脂 肪 重 量 ( 睾 丸 及 肾 周 围 脂 肪 垫 ) 3.6.2.2 人 体 试 食 试 验 体 重, 体 重 指 数, 腰 围, 腹 围, 臀 围 体 内 脂 肪 含 量 3.6.3 试 验 原 则 在 进 行 减 肥 试 验 时, 除 以 上 指 标 必 测 外, 还 应 进 行 机 体 营 养 状 况 检 测, 运 动 耐 力 测 试 以 及 与 健 康 有 关 的 其 它 指 标 的 观 察 人 体 试 食 试 验 为 必 做 项 目, 动 物 试 验 与 人 体 试 食 试 验 相 结 合, 综 合 进 行 评 价 3.6.4 结 果 判 定 在 动 物 试 验 中, 体 重 及 体 内 脂 肪 垫 2 个 指 标 均 阳 性, 并 且 对 机 体 健 康 无 明 显 损 害, 即 可 初 步 判 定 该 受 试 物 具 有 减 肥 作 用 在 人 体 试 食 试 验 中, 体 内 脂 肪 量 显 著 减 少, 且 对 机 体 健 康 无 明 显 损 害, 可 判 定 该 受 试 物 具 有 减 肥 作 用 3.7 耐 缺 氧 作 用 3.7.1 试 验 项 目 小 鼠 常 压 耐 缺 氧 实 验 3.7.2 结 果 判 定 耐 缺 氧 实 验 阳 性, 说 明 该 受 试 物 具 有 耐 缺 氧 作 用 3.8 抗 辐 射 作 用 3.8.1 试 验 项 目 3.8.1.1 亚 急 性 试 验 30 天 存 活 率 或 平 均 存 活 时 间 白 细 胞 总 数 3.8.1.2 亚 慢 性 或 慢 性 试 验 小 鼠 睾 丸 染 色 体 畸 变 试 验 小 鼠 骨 髓 细 胞 微 核 试 验 3.8.2 试 验 原 则 较 高 剂 量 一 次 辐 射, 选 择 亚 急 性 试 验 ; 小 剂 量 多 次 辐 射, 选 择 亚 慢 性 或 慢 性 试 验 3.8.3 结 果 判 定

亚 急 性 试 验 项 目 中 2 项 结 果 为 阳 性, 则 可 判 定 该 受 试 物 对 较 高 剂 量 一 次 辐 射 有 拮 抗 作 用 亚 慢 性 或 慢 性 试 验 中 2 项 结 果 为 阳 性, 则 可 判 定 该 受 试 物 对 小 剂 量 多 次 辐 射 有 拮 抗 作 用 3.9 抗 突 变 作 用 3.9.1 试 验 项 目 Ames 试 验 或 V79 细 胞 基 因 突 变 试 验 小 鼠 骨 髓 细 胞 微 核 试 验 小 鼠 睾 丸 染 色 体 畸 变 试 验 3.9.2 试 验 原 则 Ames 试 验 与 V79 细 胞 基 因 突 变 试 验 任 选 一 项, 采 用 体 内 与 体 外 试 验 相 结 合 的 原 则 3.9.3 结 果 判 定 抗 突 变 三 项 试 验 中 有 两 项 为 阳 性 时, 则 可 判 定 该 受 试 物 具 有 抗 突 变 作 用 3.10 抑 制 肿 瘤 作 用 3.10.1 试 验 项 目 动 物 诱 发 性 肿 瘤 试 验 动 物 移 植 性 肿 瘤 试 验 免 疫 功 能 试 验 N 细 胞 活 性 测 定 单 核 - 巨 噬 细 胞 功 能 测 定 3.10.2 试 验 原 则 验 动 物 诱 发 性 肿 瘤 试 验 及 动 物 移 植 性 肿 瘤 试 验 两 项 中 任 选 一 项, 同 时 必 做 2 项 免 疫 功 能 试 3.10.3 结 果 判 定 动 物 诱 发 性 肿 瘤 试 验 及 动 物 移 植 性 肿 瘤 试 验 两 项 试 验 中 有 一 项 为 阳 性, 并 且 对 免 疫 功 能 无 抑 作 用, 则 可 判 定 该 受 试 物 具 有 抑 制 肿 瘤 的 作 用 3.11 调 节 血 脂 作 用 3.11.1 试 验 项 目 大 鼠 脂 代 谢 紊 乱 模 型 法 人 体 试 食 试 验 3.11.2 试 验 原 则 尽 可 能 动 物 试 验 和 人 体 试 食 试 验 相 结 合, 综 合 进 行 评 价 3.11.3 结 果 判 定 大 鼠 脂 代 谢 紊 乱 模 型 法 : 结 果 为 阳 性 时, 可 初 步 判 定 该 受 试 物 具 有 调 节 血 脂 作 用 人 体 试 食 试 验 阳 性, 可 判 定 该 受 试 物 对 人 体 具 有 调 节 血 脂 作 用

3.12 改 善 性 功 能 作 用 3.12.1 试 验 项 目 3.12.1.1 交 配 试 验 大 鼠 交 配 试 验 小 鼠 交 配 试 验 3.12.1.2 勃 起 试 验 3.12.2 试 验 原 则 评 价 改 善 性 功 能 作 用, 应 主 要 观 察 是 否 增 强 性 交 功 能 及 阴 茎 勃 起 功 能 考 虑 到 影 响 性 功 能 的 因 素 很 多, 而 睾 酮 对 性 功 能 的 维 持 具 有 重 要 意 义, 必 要 时 可 对 血 清 睾 酮 水 平 进 行 测 定 3.12.3 结 果 判 定 交 配 试 验 ( 大 小 鼠 交 配 试 验 任 选 一 项 ) 或 勃 起 试 验 中 有 一 项 试 验 结 果 为 阳 性, 即 可 判 定 该 受 试 物 具 有 改 善 性 功 能 的 作 用 3.13 人 体 试 食 试 验 规 程 4. 评 价 食 品 保 健 作 用 时 要 考 虑 的 因 素 4.1 人 的 可 能 摄 入 量 除 一 般 人 群 的 摄 入 量 外, 还 应 考 虑 特 殊 的 和 敏 感 的 人 群 ( 如 儿 童 孕 妇 及 高 摄 入 量 人 群 ) 4.2 人 体 资 料 由 于 存 在 著 动 物 与 人 之 间 的 种 属 差 异 在 将 动 物 试 验 结 果 外 推 到 人 时, 应 尽 可 能 收 集 人 群 服 用 受 试 物 的 效 应 资 料, 若 体 外 或 体 内 动 物 试 验 未 观 察 到 或 不 易 观 察 到 食 品 的 保 健 效 应 或 观 察 到 不 同 效 应, 而 有 关 资 料 提 示 对 人 有 保 健 作 用 时, 在 保 证 安 全 的 前 提 下, 应 进 行 必 要 的 人 体 试 食 试 验 4.3 在 将 本 程 序 所 列 试 验 的 阳 性 结 果 用 于 评 价 食 品 的 保 健 作 用 时, 应 考 虑 结 果 的 重 复 性 和 剂 量 反 应 关 系, 并 由 此 找 出 其 最 小 有 作 用 剂 量 附 加 说 明 4.4 食 品 保 健 作 用 的 检 测 及 评 价 应 由 卫 生 部 认 定 的 保 健 食 品 功 能 学 检 验 机 构 承 担 本 程 序 和 检 验 方 法 由 卫 生 部 卫 生 监 督 司 提 出 本 程 序 和 检 验 方 法 由 卫 生 部 食 品 卫 生 监 督 检 验 所 保 健 食 品 功 能 学 评 价 程 序 和 检 验 方 法 起 草 小 组 负 责 起 草 本 程 序 和 检 验 方 法 由 卫 生 部 委 托 技 术 归 口 单 位 卫 生 部 食 品 卫 生 监 督 检 验 所 负 责 解 释 进 行 未 列 入 程 序 范 围 的 保 健 食 品 功 能 学 评 价 时, 应 由 保 健 食 品 的 研 制 生 产 者 提 出 检 验 及 评 价 方 法, 经 保 健 食 品 功 能 学 检 验 机 构 验 证 及 卫 生 部 食 品 卫 生 监 督 检 验 所 组 织 专 家 评 审, 报 卫 生 部 批 准 后 方 可 列 入 本 程 序 本 程 序 中 无 明 确 判 定 方 法 的 人 体 试 食 试 验 结 果, 可 由 负 责 试 验 单 位 组 织 专 家 组 ( 至 少 五 人 ), 按 本 程 序 提 出 的 原 则 要 求 共 同 予 以 评 价, 并 提 出 判 定 结 果 免 疫 调 节 作 用 检 验 方 法 动 物 试 验 1. 实 验 动 物 选 用 小 鼠 推 荐 使 用 近 交 系 小 鼠, 如 C57BL/6J BALB/C 等,6-8 周 龄,18-22g, 雌 雄 均 可, 数 量 为 单 一 性 别 每 组 至 少 10 只

2. 给 受 试 物 的 时 间 剂 量 分 组 经 口 给 予 受 试 物 15-30d, 设 3 个 剂 量 组 和 1 个 对 照 组 3 个 剂 量 组 中, 其 中 1 个 剂 量 应 相 当 于 人 推 荐 摄 入 量 的 10 倍 左 右 3. 实 验 方 法 3.1 ConA 诱 导 的 小 鼠 脾 淋 巴 细 胞 转 化 试 验 可 任 选 下 列 方 法 之 一 3.1.1 M 法 3.1.1.1 原 理 当 淋 巴 细 胞 受 ConA PA 等 致 分 裂 原 或 特 异 性 抗 原 刺 激 后 发 生 母 细 胞 转 化, 活 细 胞 特 别 是 增 殖 细 胞 通 过 线 粒 体 水 解 将 M( 一 种 淡 黄 色 的 唑 氮 盐 ) 分 解 为 兰 紫 色 的 甲 月 替 (formazan) 结 晶 而 显 色, 其 光 密 度 值 能 够 反 映 细 胞 的 增 殖 情 况 3.1.1.2 仪 器 和 材 料 RPMI1640 细 胞 培 养 液 小 牛 血 清 2- 巯 基 乙 醇 (2-ME) 青 霉 素 链 霉 素 刀 豆 蛋 白 A(ConA) 盐 酸 异 丙 醇 M Hanks 液 PBS 缓 冲 液 (p7.2-7.4) 200 目 筛 网 24 孔 培 养 板,96 孔 培 养 板 ( 平 底 ), 手 术 器 械 二 氧 化 碳 培 养 箱 酶 联 免 疫 检 测 仪 超 净 工 作 台 3.1.1.3 实 验 步 骤 完 全 培 养 液 RPMI1640 培 养 液 过 滤 除 菌, 用 前 加 入 10% 小 牛 血 清,1% 谷 氨 酰 胺 (200mmol/L), 青 霉 素 (100U/ml), 链 霉 素 (100ug/L) 及 5 10-5 mol/l 的 2- 巯 基 乙 醇, 用 无 菌 的 1mol/L 的 Cl 或 1mol/L 的 NaO 调 p 至 7.0-7.2, 即 完 全 培 养 液 ConA 液 用 双 蒸 水 配 制 成 100ug/ml 的 溶 液, 过 滤 除 菌, 在 低 温 冰 箱 (-20 ) 保 存 无 菌 Hanks 液 用 前 以 3.5% 的 无 菌 NaCO3 调 p7.2-7.4 M 液 将 5mgM 溶 于 1ml p7.2 的 PBS 中, 现 配 现 用 酸 性 异 丙 醇 溶 液 96ml 异 丙 醇 中 加 入 4ml 1mo1/L 的 C1, 临 用 前 配 制 3.1.1.3.2 脾 细 胞 悬 液 制 备 无 菌 取 脾, 置 于 盛 有 适 量 无 菌 Hanks 液 的 小 平 皿 中, 用 镊 子 轻 轻 将 脾 撕 碎, 制 成 单 个 细 胞 悬 液 经 200 目 筛 网 过 滤, 用 Hanks 液 洗 3 次, 每 次 离 心 10min (1000r/min) 然 后 将 细 胞 悬 浮 于 2ml 的 完 全 培 养 液 中, 用 台 酚 兰 染 色 计 数 活 细 胞 数 ( 应 在 95% 以 上 ), 调 整 细 胞 浓 度 为 2 10 6 个 /ml 3.1.1.3.3 淋 巴 细 胞 增 殖 反 应 将 细 胞 悬 液 分 两 孔 加 入 24 孔 培 养 板 中, 每 孔 1ml, 一 孔 加 50ul ConA 液 ( 相 当 5ug/ml), 另 一 孔 作 为 对 照, 置 5%CO2,37 培 养 72h 培 养 结 束 前 4h, 每 孔 轻 轻 吸 去 上 清 液 0.7ml 不 含 小 牛 血 清 的 RPMI1640 培 养 液, 同 时 加 入 M(5mg/ml)50u1/ 孔, 继 续 培 养 4h 培 养 结 束 后, 每 孔 加 入 1ml 酸 性 异 丙 醇, 吹 打 混 匀, 使 紫 色 结 晶 完 全 溶 解 然 后 分 装 到 96 孔 培 养 板 中, 每 个 孔 分 装 6 孔 作 为 平 行 样, 用 酶 联 免 疫 检 测 仪, 以 570nm 波 长 测 定 光 密 度 值 也 可 将 溶 解 液 直 接 移 入 1ml 比 色 杯 中, 在 721 分 光 光 度 计 上 比 色 测 定, 波 长 570nm 3.1.1.4 数 据 处 理 及 结 果 判 定 一 般 采 用 方 差 分 析 进 行 数 据 统 计 用 加 ConA 孔 的 光 密 度 值 减 去 不 加 ConA 孔 的 光 密 度 值 代 表 淋 巴 细 胞 的 增 殖 能 力, 受 试 物 组 的 光 密 度 值 显 著 高 于 对 照 组 的 光 密 度 值, 即 可 判 定 该 项 试 验 结 果 阳 性

3.1.2 同 位 素 掺 入 法 3.1.2.1 原 理 淋 巴 细 胞 在 有 丝 分 裂 原 PA ConA 等 的 刺 激 下, 产 生 增 殖 反 应,DNA 和 RNA 合 成 明 显 增 加, 如 在 培 养 液 中 加 入 3- 胸 腺 嘧 啶 核 苷 (3H-TdR), 则 可 被 转 化 中 的 细 胞 摄 入 测 定 标 记 淋 巴 细 胞 和 放 射 强 度 可 反 映 淋 巴 细 胞 增 殖 的 程 度 3.1.2.2 仪 器 和 材 料 RPMI-1640 细 胞 培 养 液 小 牛 血 清 2- 巯 基 乙 醇 (2-ME) 青 霉 素 链 霉 素 刀 豆 蛋 白 A (ConA) Hanks 液 PBS 缓 冲 液 (p7.2-7.4) 3H-TdR 闪 烁 液 [2.5- 二 苯 基 噁 唑 (PPO) 0.5g 1,4- 双 -(5- 苯 基 噁 唑 基 )- 苯 (POPOP)0.25g 二 甲 苯 500ml 混 匀 ] 200 目 筛 网,96 孔 培 养 板 ( 平 底 ), 手 术 器 械 二 氧 化 碳 培 养 箱 超 净 工 作 台 液 体 闪 烁 仪 多 头 细 胞 取 集 器 49 型 玻 璃 纤 维 滤 纸 3.1.2.3 实 验 步 骤 3.1.2.3.1 脾 细 胞 悬 液 制 备 无 菌 取 脾, 置 于 盛 有 适 量 无 菌 Hanks 液 的 小 平 皿 中, 用 镊 子 轻 轻 将 脾 撕 碎, 制 成 单 细 胞 悬 液 经 200 目 筛 网 过 滤, 用 Hanks 液 洗 3 次, 每 次 离 心 10min(1000r/min) 然 后 将 细 胞 悬 浮 于 2ml 的 完 全 培 养 液 中, 用 台 酚 兰 染 色 计 数 活 细 胞 数 ( 应 在 95% 以 上 ), 最 后 RPMI1640 完 全 培 养 液 将 细 胞 数 调 成 5 10 5 个 /ml 3.1.2.3.2 淋 巴 细 胞 增 殖 反 应 : 将 脾 细 胞 悬 液 加 入 到 96 孔 培 养 板 中,200ul/ 孔, 每 一 份 脾 细 胞 悬 液 分 装 6 个 孔,3 孔 加 ConA(5ug/ml), 另 3 个 孔 不 加 ConA 作 为 对 照 置 5% CO2,37 培 养 72h, 培 养 结 束 前 6h, 每 孔 加 入 3H-TdR 20u1, 使 其 终 浓 度 为 (3.7-18.5) 10 4 Bq/ml 用 多 头 细 胞 取 集 器 将 细 胞 取 集 于 玻 璃 纤 维 滤 纸 上 滤 纸 片 充 分 干 燥 后 置 测 量 瓶 中, 加 入 7ml 闪 烁 液, 用 液 闪 仪 测 定 每 分 钟 脉 冲 数 (cpm) 3.1.2.4 数 据 处 理 及 结 果 判 定 一 般 采 用 方 差 分 析 进 行 数 据 统 计 以 每 分 钟 脉 冲 数 (cpm) 表 示 增 殖 程 度, 用 刺 激 指 数 (SI) 来 表 示 试 验 孔 cpm