Phire Hot StartII DNA 聚合酶

重 要 提 示 Phusion 人 源 样 本 直 接 PCR 试 剂 盒 产 品 货 号 :F-150,200rxns x 20μl 变 性 温 度 为 98 C 退 火 温 度 与 众 多 常 规 DNA 聚 合 酶 ( 如 Taq DNA 聚 合 酶 ) 不 同, 具 体 请 参 照 6.3 延 伸 时, 若 扩 增 子 片 段 1kb, 则 延 伸 时 间 设 定 为 15s 即 可 ; 若 扩 增 子 片 段 >1kb, 则 按 15s/kb 设 定 延 伸 时 间 将 样 品 直 接 加 入 PCR 反 应 液 中 而 不 是 空 白 管 中 Phusion DNA 聚 合 酶 产 生 的 是 平 末 端 DNA 产 物 -20 C 保 存, 有 效 期 为 1 年 稀 释 缓 冲 液 一 旦 解 冻 可 放 于 4 C 保 存 1. 简 介 Thermo Scientific Phusion 人 源 样 本 直 接 PCR 试 剂 盒 可 直 接 以 各 种 人 源 样 本 为 模 板 进 行 PCR, 而 无 需 DNA 的 纯 化 如 口 腔 拭 子 唾 液 指 甲 牙 齿 毛 发, 羊 水 和 皮 肤 活 体 组 织 都 可 以 作 为 实 验 的 起 始 材 料 该 试 剂 盒 适 用 于 新 鲜 冷 冻, 甚 至 是 福 尔 马 林 固 定 石 蜡 包 埋 (FFPE) 的 人 源 组 织 样 本 注 意 : 本 产 品 仅 适 用 于 实 验 室 研 究 2. 包 装 信 息 组 分 Phusion 人 源 样 本 DNA 聚 合 酶 80 μl 2x Phusion 人 源 样 本 PCR 缓 冲 液 2 x 1 ml ( 包 含 dntps and MgCl 2 ) 通 用 对 照 引 物 ( 每 种 25 μm) 40 μl 稀 释 缓 冲 液 2 x 5 ml DNARelease TM 添 加 剂 3 x 100μl 材 料 安 全 数 据 表 见 www.finnzymes.com 3. PCR 操 作 指 南 Phusion 人 源 样 本 直 接 PCR 试 剂 盒 提 供 改 良 的 Phusion 热 启 动 II 高 保 真 DNA 聚 合 酶 该 酶 是 一 种 特 殊 的 工 程 酶, 融 合 有 DNA 双 链 结 合 蛋 白, 不 但 聚 合 能 力 强, 而 且 对 许 多 人 源 样 本 中 的 PCR 抑 制 剂 表 现 出 超 强 的 抵 抗 力 使 用 前 请 对 各 管 小 心 混 匀 并 离 心, 以 保 证 均 质, 提 高 产 物 得 率 PCR 的 建 立 可 在 室 温 下 完 成 注 意 : 请 于 最 后 将 样 品 加 到 反 应 中 请 参 照 第 4 节 的 样 品 处 理 指 南 Phusion 人 源 样 本 直 接 PCR 试 剂 盒 包 含 了 适 用 于 直 接 法 和 稀 释 法 两 种 实 验 方 案 的 所 有 试 剂 针 对 不 同 的 实 验 材 料 提 供 不 同 的 操 作 指 南 ( 详 见 第 4 节 的 操 作 流 程 选 择 ) 当 使 用 新 的 引 物 对 或 者 样 品 材 料 时, 推 荐 首 先 使 用 稀 释 法 方 案 该 试 剂 盒 提 供 对 照 引 物, 可 用 以 扩 增 来 自 人 源 样 本 的 237bp 片 段 该 试 剂 盒 通 常 用 于 终 点 PCR Page 1

表 1. 加 样 指 南 组 份 20μl 反 应 50μl 反 应 H 2 O 定 容 至 20 μl 定 容 至 50 μl 2x Phusion 人 源 样 本 PCR 缓 冲 液 终 浓 度 10 μl 25 μl 1x 引 物 A x μl x μl 0.5 μm 引 物 B x μl x μl 0.5 μm Phusion 人 源 样 本 DNA 聚 合 酶 样 本 量 ( 详 见 第 4 部 分 ) 直 接 法 : 稀 释 法 : 循 环 步 骤 起 始 变 性 变 性 退 火 ( 详 见 6.3) 延 伸 ( 详 见 6.4) 最 后 延 伸 0.4 μl 1 μl 0.5μl 表 2. 循 环 扩 增 程 序 推 荐 1.25 μl 两 步 法 三 步 法 循 环 温 度 时 间 温 度 时 间 98 5min 98 5min 98-4 1s - 15s 1kb 15 s/kb > 1 kb 1 min 保 持 98 X 4 1 s 5 s 15s 1kb 15 s/kb > 1 kb 1 min 保 持 数 1 35-40 1 a) 直 接 法 : 使 用 Harris TM Uni-Core 取 样 工 具 ( 可 单 独 提 供 ), 打 出 一 个 直 径 约 0.5mm 的 圆 孔 样 品, 然 后 将 其 直 接 放 入 20μl PCR 反 应 液 中 在 某 些 实 验 中, 将 反 应 体 积 增 加 到 50μl 或 者 将 样 品 直 径 减 少 到 0.35mm 有 利 于 获 得 更 好 的 实 验 结 果 b) 稀 释 法 : 将 口 腔 拭 子 的 末 端 插 入 含 有 50μl 稀 释 缓 冲 液,1.5μl DNARelease TM 添 加 剂 和 250μl TE (ph8.0) 的 1.5ml 离 心 管 中, 旋 转 5-10 次, 然 后 轻 轻 地 对 着 管 壁 挤 压 拭 子 的 末 端, 取 出 拭 子 涡 旋 振 荡 混 匀 并 离 心 将 离 心 管 置 于 98 温 浴 2 分 钟, 再 次 离 心, 然 后 取 0.5μl 上 清 做 模 板, 在 20μl PCR 反 应 内 进 行 扩 增 注 意 : 拭 子 的 使 用 技 巧 和 贮 存 条 件 ( 不 能 太 干 燥 ) 可 能 影 响 产 物 得 率 4.2.2 头 发 a) 直 接 法 : 取 1-2mm 带 毛 囊 的 头 发, 将 其 直 接 加 入 20μl 的 PCR 反 应 中 在 某 些 实 验 中, 将 反 应 体 积 增 加 到 50μl 有 利 于 获 得 更 好 的 实 验 结 果 b) 稀 释 法 : 将 2-3mm 带 毛 囊 的 头 发 放 入 含 有 20μl 稀 释 缓 冲 液 和 0.5μl DNARelease TM 添 加 剂 的 反 应 管 中, 确 保 头 发 浸 没 在 溶 液 中 涡 旋 振 荡 混 匀 并 离 心 将 其 于 室 温 下 放 置 2-5 分 钟, 而 后 在 98 孵 育 2 分 钟, 再 次 离 心, 取 0.5μl 上 清 做 模 板, 于 20μl PCR 反 应 内 扩 增 4.2.3 牙 齿 4. 样 品 处 理 指 南 a) 直 接 法 : 取 尺 寸 如 右 黑 点 ( ) 大 小 的 牙 齿, 将 其 直 接 加 入 20μl 的 PCR 反 应 中 4.1 样 品 类 型 及 相 应 的 操 作 方 法 该 试 剂 盒 已 经 过 优 化, 适 用 于 多 种 人 源 样 本 请 参 考 4.2 人 源 样 本 列 表 每 一 种 样 本 材 料 都 有 其 专 门 的 实 验 方 案 4.2 固 体 样 本 4.2.1 口 腔 拭 子 ( 如, 尼 龙 绒 拭 子 ) 注 意 : 当 扩 增 DNA 片 段 大 于 1kb 时, 建 议 使 用 稀 释 法 进 行 PCR 扩 增 b) 稀 释 法 : 将 约 13-15mg 的 牙 齿 样 本 放 入 含 有 50μl 稀 释 缓 冲 液 和 1.5μl DNARelease TM 添 加 剂 的 反 应 管 中, 确 保 牙 齿 浸 没 在 溶 液 中 涡 旋 振 荡 混 匀 并 离 心 将 其 于 室 温 下 放 置 2-5 分 钟, 而 后 在 98 孵 育 2 分 钟, 再 次 离 心, 取 0.5μl 上 清 做 模 板, 于 20μl PCR 反 应 内 扩 增 Page 2

注 意 : 如 果 样 本 被 充 分 磨 碎, 实 验 效 果 会 更 好, 例 如 提 升 反 应 的 灵 敏 度 可 以 使 用 研 钵 或 者 匀 浆 器 于 液 氮 内 磨 碎 样 本 4.2.4 皮 肤 活 体 组 织 ( 未 固 定 ) a) 直 接 法 : 使 用 Harris TM Uni-Core 取 样 工 具 ( 可 单 独 提 供 ), 打 出 一 个 直 径 约 0.5mm 的 圆 孔 样 品, 然 后 将 其 直 接 放 入 20μl PCR 反 应 液 中 在 某 些 实 验 中, 将 反 应 体 积 增 加 到 50μl 或 者 将 样 品 直 径 减 少 到 0.35mm 有 利 于 获 得 更 好 的 实 验 结 果 b) 稀 释 法 : 将 直 径 2mm 的 皮 肤 小 块 放 入 含 有 20μl 稀 释 缓 冲 液 和 0.5μl DNARelease TM 添 加 剂 的 反 应 管 中, 确 保 样 本 浸 没 在 溶 液 中 涡 旋 振 荡 混 匀 并 离 心 将 其 于 室 温 下 放 置 2-5 分 钟, 而 后 在 98 孵 育 2 分 钟, 再 次 离 心, 取 0.5μl 上 清 做 模 板, 于 20μl PCR 反 应 内 扩 增 4.2.5 指 甲 a) 直 接 法 : 取 一 小 块 样 本 ( 大 约 1x2mm, 或 者 < 1 mg), 将 其 直 接 放 入 20μl 的 PCR 反 应 液 中 注 意 : 当 扩 增 DNA 片 段 大 于 1kb 时, 建 议 使 用 稀 释 法 进 行 PCR 扩 增 b) 稀 释 法 : 将 约 7mg 的 指 甲 样 本 放 入 含 有 50μl 稀 释 缓 冲 液 和 1.5μl DNARelease TM 添 加 剂 的 反 应 管 中, 确 保 样 本 浸 没 在 溶 液 中 涡 旋 振 荡 混 匀 并 离 心 将 其 于 室 温 下 放 置 2-5 分 钟, 而 后 在 98 孵 育 2 分 钟, 再 次 离 心, 取 0.5μl 上 清 做 模 板, 于 20μl PCR 反 应 内 扩 增 注 意 : 如 果 样 本 被 充 分 切 碎, 实 验 效 果 会 更 好, 例 如 可 以 提 高 反 应 的 灵 敏 度 4.2.6 福 尔 马 林 固 定 石 蜡 包 埋 (FFPE) 的 组 织 样 本 a) 直 接 法 : 不 推 荐 b) 稀 释 法 : FFPE 组 织 切 片 : 将 一 块 约 7-10μm 厚 的 FFPE 人 源 组 织 样 本 放 入 含 有 50μl 稀 释 缓 冲 液,1.5μl DNARelease TM 添 加 剂 和 50μl TE(pH8.0) 的 反 应 管 中,* 用 枪 头 捣 碎 组 织, 并 离 心, 确 保 样 本 浸 没 在 溶 液 中 将 反 应 置 于 60 孵 育 1h, 而 后 在 98 孵 育 10 分 钟, 冷 却 后 离 心 (16000x g, 2 min), 转 移 上 清 到 一 个 新 的 离 心 管 中 取 0.5μl 上 清 做 模 板, 于 20μl PCR 反 应 进 行 扩 增 在 某 些 实 验 中, 如 果 上 清 中 的 组 织 碎 片 或 者 DNA 量 非 常 高, 建 议 稀 释 上 清 可 用 水 或 者 TE 对 其 进 行 1:10 或 者 1:100 的 稀 释 然 后 取 0.5μl 稀 释 后 的 上 清 加 入 20μl PCR 反 应, 进 行 扩 增 FFPE 组 织 显 微 切 片 ( 未 染 色 ): 将 稀 释 缓 冲 液 和 TE(pH8.0) 缓 冲 液 按 1:1 的 体 积 比 进 行 混 合 充 分 振 荡 后 吸 取 100μl 混 合 液 加 到 4-7μm 厚 的 FFPE 组 织 显 微 切 片 上, 用 枪 头 将 玻 片 上 的 组 织 刮 离, 并 将 溶 液 和 组 织 一 同 转 到 干 净 离 心 管 中, 并 加 入 1.5μl DNARelease TM 添 加 剂 * 用 枪 头 吹 打 溶 液, 并 离 心 确 保 样 本 浸 没 在 溶 液 中 将 其 于 60 孵 育 1h, 接 下 来 在 98 孵 育 10min, 冷 却 后 离 心 (16000x g, 2min), 转 移 上 清 到 一 个 新 的 离 心 管 中 取 0.5μl 上 清 加 入 到 20μl PCR 反 应 内, 进 行 扩 增 在 某 些 实 验 中, 如 果 上 清 中 的 组 织 碎 片 或 者 DNA 量 非 常 高, 建 议 稀 释 上 清 可 用 水 或 者 TE 对 其 进 行 1:10 或 者 1:100 的 稀 释 然 后 取 0.5μl 稀 释 后 的 上 清 置 于 20μl PCR 反 应, 充 当 扩 增 模 板 注 意 : 通 常 FFPE 组 织 中 的 DNA 会 被 片 段 化, 故 能 够 被 成 功 扩 增 的 PCR 产 物 长 度 有 限 我 们 建 议 扩 增 子 最 好 小 于 300bp 对 于 某 些 实 验, 如 果 第 一 步 的 孵 育 时 间 从 1 小 时 延 长 至 过 夜, 可 提 高 PCR 产 物 的 得 率 4.3 液 体 样 本 4.3.1 唾 液 a) 直 接 法 : 取 0.2 0.5 μl 唾 液 直 接 加 入 20μl 的 PCR 反 应 中 b) 稀 释 法 : 取 5μl 唾 液 样 本 加 入 含 有 20μl 稀 释 缓 冲 液 和 0.5μl DNARelease TM 添 加 剂 的 反 应 管 中 Page 3

涡 旋 振 荡 混 匀, 并 离 心 将 其 于 98 孵 育 2min, 再 次 离 心 后 取 0.5μl 上 清 加 入 到 20μl PCR 反 应 内, 进 行 扩 增 注 意 : 推 荐 使 用 新 鲜 的 唾 液 样 本 如 果 需 要 在 PCR 前 将 唾 液 样 本 贮 存 一 段 时 间, 建 议 使 用 商 用 唾 液 收 集 管 ( 如 Oragene. DNA from Genotek) 5.3 稀 释 缓 冲 液 稀 释 缓 冲 液 与 DNARelease 一 起 使 用 可 促 进 各 种 人 源 样 本 释 放 DNA, 该 缓 冲 液 已 经 过 严 格 优 化 ( 详 见 5.4) 5.4 DNARelease TM 添 加 剂 4.3.2 羊 水 a) 直 接 法 : 取 0.5 2 μl 羊 水 直 接 加 入 20μl 的 PCR 反 应 中 DNARelease 添 加 剂 在 稀 释 法 中 使 用, 它 能 促 使 人 源 样 品 中 DNA 的 释 放 5.5 引 物 b) 稀 释 法 : 不 推 荐 5. 各 反 应 组 分 说 明 5.1 酶 我 们 所 推 荐 的 引 物 最 终 浓 度 是 0.5μM 引 物 Tm 值 的 计 算 结 果 会 随 着 使 用 方 法 的 不 同 而 不 同 请 使 用 我 们 网 站 上 (www.finnzymes.com) 的 Tm 计 算 器 和 操 作 指 南 计 算 引 物 的 Tm 值, 并 最 终 确 定 最 适 的 退 火 温 度 Phusion 人 源 样 本 DNA 聚 合 酶 是 一 种 带 有 独 特 结 构 域 的 具 有 校 正 功 能 的 聚 合 酶, 该 结 构 域 大 大 增 强 了 酶 的 处 理 能 力, 赋 予 了 其 强 劲 快 速 和 精 准 的 特 性 该 酶 的 热 启 动 技 术 是 基 于 可 逆 结 合 Affibody 蛋 白 的 失 活 技 术 1,2 Phusion 人 源 样 本 DNA 聚 合 酶 具 有 5 3 DNA 聚 合 酶 活 性 和 3 5 外 切 酶 活 性 6. 循 环 条 件 说 明 6.1 初 始 变 性 使 用 直 接 PCR 法, 初 始 变 性 时 间 需 要 延 长 到 5min, 以 使 细 胞 裂 解, 基 因 组 DNA 释 放 6.2 变 性 当 使 用 Phusion 人 源 样 本 DNA 聚 合 酶 扩 增 克 隆 片 断 时, 我 们 推 荐 使 用 平 末 端 克 隆 如 果 需 进 行 TA 克 隆, 可 以 使 用 诸 如 DyNAzyme TM II DNA 聚 合 酶 (F-501) 给 平 末 端 PCR 产 物 加 A 尾 但 是 在 加 A 尾 之 前, 请 务 必 纯 化 PCR 产 物, 以 将 Phusion Hot start II DNA 聚 合 酶 去 除 Phusion Hot start II DNA 聚 合 酶 的 任 何 残 留 都 可 能 降 解 A 尾, 再 次 产 生 平 末 端 所 得 PCR 产 物 的 后 续 TA 克 隆 操 作 指 南 可 在 我 们 的 相 关 网 站 上 找 到 (www.finnzymes.com) 5.2 Phusion 人 源 样 本 PCR 缓 冲 液 试 剂 盒 中 所 配 备 的 2x Phusion PCR 缓 冲 液 已 经 针 对 人 源 样 本 进 行 过 严 格 优 化 它 包 含 了 dntps 和 终 反 应 浓 度 为 1.5mM 的 MgCl 2 保 持 变 性 时 间 尽 可 能 短 对 于 大 多 数 模 板, 通 常 在 98 保 持 1s 就 足 够 了 注 意 : 变 性 时 间 和 温 度 可 能 会 随 着 热 循 环 仪 的 缓 变 率 和 温 度 控 制 模 式 而 改 变 6.3 引 物 退 火 对 于 Phusion 人 源 样 本 DNA 聚 合 酶, 最 佳 的 退 火 温 度 与 其 他 基 于 Taq 的 聚 合 酶 有 着 明 显 不 同 请 使 用 我 们 相 关 网 站 (www.finnzymes.com) 上 的 Tm 计 算 器 和 操 作 指 南 确 定 特 定 引 物 的 Tm 值 和 最 适 的 退 火 温 度 设 置 引 物 退 火 温 度 的 基 本 原 则 是 : 若 引 物 >20nt, 则 退 火 程 序 设 置 为 :Tm+3,5s, 该 Tm 值 指 两 引 物 中 较 低 的 那 一 个 Tm 值 ; 若 引 物 所 含 碱 基 数 < =20nt, 则 直 接 使 用 两 引 物 中 较 低 的 那 一 个 Tm Page 4

值 作 为 退 火 温 度 如 果 有 必 要, 可 以 使 用 温 度 梯 度 找 到 每 一 对 模 板 / 引 物 的 最 适 退 火 温 度 退 火 梯 度 可 以 扩 展 到 延 伸 温 度 ( 两 步 法 PCR) 对 于 Tm 值 较 高 的 引 物 对 (Tm 至 少 在 69-), 建 议 使 用 无 退 火 步 骤 的 两 步 法 循 环 6.4 延 伸 延 伸 应 该 在 的 温 度 下 进 行 对 于 片 段 小 于 或 等 于 1kb 的 扩 增 子, 延 伸 时 间 建 议 设 置 成 15s, 对 于 片 段 大 于 1kb 的 扩 增 子, 延 伸 时 间 建 议 按 照 15s/kb 进 行 设 置 表 3. 对 照 反 应 的 加 样 指 南 组 份 20μl 反 应 50μl 反 应 H 2 O 定 容 至 20 μl 定 容 至 50 μl 2x Phusion 人 源 样 本 PCR 缓 冲 液 10 μl 25 μl 通 用 对 照 引 物 混 合 物 0.4 μl 1 μl Phusion 人 源 样 本 DNA 聚 合 酶 0.4 μl 1 μl 样 本 量 ( 详 见 第 4 部 分 ) 直 接 法 : 稀 释 法 : 0.5 μl 1.25 μl 7. 对 照 反 应 7.1 使 用 对 照 引 物 进 行 直 接 PCR 对 照 反 应 我 们 建 议 无 论 使 用 直 接 法 还 是 稀 释 法 进 行 直 接 PCR 实 验, 最 好 设 置 对 照 反 应, 对 照 引 物 随 试 剂 盒 提 供, 模 板 可 使 用 实 际 实 验 所 要 检 测 的 样 品 表 4. 对 照 反 应 的 循 环 程 序 设 置 说 明 循 环 步 骤 温 度 时 间 循 环 数 细 胞 裂 解 98 5min 1 变 性 98 1s 35-40 退 火 / 延 伸 15s 最 后 延 伸 4 1min 保 持 1 对 照 引 物 是 溶 解 于 水 中 的 兼 并 引 物 混 合 物, 可 扩 增 哺 乳 动 物 基 因 组 DNA 中 237bp 的 片 段 该 扩 增 3 区 位 于 SOX21 基 因 上 游, 为 高 度 保 守 的 非 编 码 区 每 一 种 引 物 的 浓 度 是 25μM 引 物 1(24 mer): 5 - AGCCCTTGGGGASTTGAATTGCTG -3, 熔 点 :73.5 C 引 物 2(27-mer): 5 - GCACTCCAGAGGACAGCRGTGTCAATA -3 熔 点 : 72.2 C (R=A), 75.3 C (R=G) 图 1. 从 各 种 人 源 样 本 中 扩 增 237bp 的 DNA 片 段 将 不 同 样 本 直 接 置 于 20μl PCR 反 应 中 用 试 剂 盒 中 的 对 照 引 物 混 合 物 进 行 扩 增 泳 道 1: 口 腔 拭 子 ; 泳 道 2: 头 发 ; 泳 道 3: 牙 齿 ; 泳 道 4: 指 甲 ; 泳 道 5: 唾 液 ; 泳 道 6: 羊 水 + 和 - 分 别 代 表 含 有 纯 化 DNA 模 板 和 未 含 纯 化 DNA 模 板 的 对 照 7.2 阳 性 对 照 和 阴 性 对 照 阳 性 对 照 : 当 对 反 应 条 件 进 行 优 化 时, 建 议 设 立 一 个 阳 性 对 照 以 确 保 PCR 条 件 最 优, 该 对 照 以 经 过 纯 化 的 DNA 为 模 板, 使 用 您 自 己 的 引 物 进 行 PCR 扩 增 若 阳 性 对 照 扩 增 失 败, 则 需 在 进 行 下 一 步 实 验 之 前 对 PCR 条 件 进 行 优 化 阴 性 对 照 : 建 议 对 所 有 直 接 PCR 实 验 都 加 一 个 Page 5

没 有 模 板 的 阴 性 对 照 在 稀 释 反 应 中 试 验 不 同 的 样 本 量 ( 不 同 尺 寸 或 体 积 ) 在 稀 释 反 应 中, 使 用 充 分 磨 碎 的 样 本 材 料 8. 疑 难 解 答 指 南 无 扩 增 产 物 或 者 产 物 量 很 少 常 见 原 因 : 若 阳 性 对 照 ( 使 用 您 自 己 的 引 物 扩 增 经 过 纯 化 的 DNA), 扩 增 完 成 后 检 测 无 产 物, 则 建 议 : 确 保 加 样 无 误, 所 用 循 环 程 序 与 我 们 推 荐 的 程 序 一 致 检 查 引 物 设 计 优 化 退 火 温 度 ( 进 行 温 度 梯 度 试 验 ) 试 验 不 同 浓 度 的 模 板 量 优 化 变 性 时 间 增 加 延 伸 时 间 直 接 法 : 若 您 的 目 的 检 测 管 没 有 扩 增 产 物, 但 阳 性 对 照 管 ( 使 用 您 自 己 的 引 物 扩 增 经 过 纯 化 的 DNA 模 板 ) 和 直 接 PCR 对 照 反 应 管 均 有 扩 增 产 物, 则 建 议 : 将 PCR 反 应 体 积 增 加 到 50μl 对 于 液 体 样 本 : 试 验 不 同 浓 度 的 模 板 量 ( 例 如 : 如 果 是 唾 液 样 本, 总 反 应 为 20μl, 则 唾 液 的 加 入 量 在 0.2-0.5μl 中 进 行 试 验 ) 对 于 固 体 样 本 : 使 用 尽 可 能 少 的 样 本 材 料 ( 如 0.35mm 大 小 的 小 块 ) 或 者 尝 试 充 分 磨 碎 样 本 使 用 稀 释 法 产 物 非 特 异 呈 现 高 分 子 量 弥 散 条 带 或 者 低 分 子 量 分 散 带 增 加 退 火 温 度 或 者 进 行 温 度 梯 度 试 验 减 少 总 循 环 数 降 低 引 物 浓 度 缩 短 延 伸 时 间 重 新 设 计 引 物 9. 参 考 文 献 1. Nord K. et al. (1997) Nature Biotechnol. 15: 772 777. 2. Wikman M. et al. (2004) Protein Eng. Des. Sel. 17: 455 562. 3. Woolfe A. et al. (2005) PLoS Biology 3: 116 130. 运 输 和 贮 存 Phusion 人 源 直 接 PCR 试 剂 盒 于 冰 上 运 输 到 货 后 即 将 所 有 组 分 放 入 -20 贮 存 稀 释 缓 冲 液 解 冻 后, 可 于 4 贮 存 若 贮 存 条 件 和 处 理 方 法 得 当, 该 试 剂 盒 的 有 效 期 为 1 年 稀 释 法 : 若 您 的 目 的 检 测 管 没 有 扩 增 产 物, 但 阳 性 对 照 管 ( 使 用 您 自 己 的 引 物 扩 增 经 过 纯 化 的 DNA 模 板 ) 和 直 接 PCR 对 照 反 应 管 均 有 扩 增 产 物, 则 建 议 : 可 用 水 或 者 TE 对 上 清 进 行 1:10 或 者 1:100 的 稀 释, 然 后 取 0.5μl 稀 释 后 的 上 清 充 当 扩 增 模 板 或 者 直 接 使 用 未 稀 释 的 上 清 做 模 板 (20μl PCR 反 应 最 多 可 以 加 2μl 上 清 ) 稀 释 反 应 可 在 较 高 的 温 度 下 进 行, 而 不 是 室 温 ( 温 度 最 高 可 设 置 到 65 ) 确 保 进 行 了 98 孵 育 的 操 作 ( 详 见 4.1) 对 于 FFPE 样 本, 尝 试 在 60 孵 育 更 长 时 间 ( 过 夜 ) 确 保 进 行 了 第 二 次 孵 育 操 作, 即 98 的 孵 育 Page 6