玉 米 科 学 2015,23(3):50~56 文 章 编 号 :1005-0906(2015)03-0050-07 Journal of Maize Sciences DOI: 10.13597/j.cnki.maize.science.20150309 玉 米 内 生 细 菌 Y19 的 荧 光 标 记 及 其 在 玉 米 体 内 的 定 殖 应 用 效 果 1,2 蒋 晓 玲, 何 鹏 飞 1, 王 娅 玲 3, 郭 力 维 1 2,3, 吴 毅 歆, 杨 静 1 2,3, 何 月 秋 (1. 云 南 农 业 大 学 植 物 保 护 学 院, 昆 明 650201;2. 微 生 物 菌 种 筛 选 与 应 用 国 家 地 方 联 合 工 程 研 究 中 心, 昆 明 650207; 3. 云 南 农 业 大 学 农 学 与 生 物 技 术 学 院, 昆 明 650201) 摘 要 :Y19 是 从 玉 米 种 子 分 离 的 具 有 促 生 防 病 效 果 的 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 为 探 究 其 在 玉 米 体 内 及 根 围 土 壤 中 的 定 殖 情 况, 通 过 自 然 转 化 方 式 将 含 有 绿 色 荧 光 蛋 白 基 因 gfpmut3a 的 质 粒 phapii 导 入 Y19, 获 得 具 有 良 好 荧 光 表 型 的 标 记 菌 株 Y19-GFPmut3a 室 内 平 板 对 峙 玉 米 盆 栽 促 生 定 殖 实 验 的 结 果 表 明, 质 粒 的 引 入 对 Y19 的 拮 抗 病 原 及 促 生 效 果 并 无 明 显 的 影 响, 接 种 后 的 第 40 天, 仍 能 在 玉 米 的 根 围 土 壤 根 茎 及 叶 组 织 中 检 测 到 标 记 菌 株 ; 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 观 察 结 果 显 示, 接 菌 后 的 第 9 天, 即 可 观 察 到 其 在 玉 米 根 茎 及 叶 部 组 织 的 定 殖, 表 明 Y19 在 玉 米 体 内 具 有 良 好 的 运 输 传 导 性 能 关 键 词 : 玉 米 ; 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 ; 绿 色 荧 光 蛋 白 ; 质 粒 ; 遗 传 转 化 中 图 分 类 号 :S513.035 文 献 标 识 码 :A GFP-tagging and Colonization Effect of an Endophityic Bacterial Strain Y19 in Maize JIANG Xiao-ling 1,2, HE Peng-fei 1, WANG Ya-ling 2, GUO Li-wei 1, WU Yi-xin 2,3, YANG Jing 1, HE Yue-qiu 2,3 (1. Faculty of Plant Protection, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201; 2. National and Local Joint Engineering Research Center for Screening and Application of Microbial Strains, Kunming 650207; 3. Faculty of Agronomy and Biotechnology, Kunming 650201, China) Abstract: Bacillus amyloliquefaciens strain Y19 isolated from maize seed has the capacity to promote plant growth and control disease. To investigate its colonization into maize tissues and rhizosphere, a tagged strain Y19- GFPmut3a with good fluorescence was obtained through transformation of phapii into Y19 by natural competence. The introduction of exogenous plasmid has no significant effect on the antagonism and plant growth- promotion of Y19, according to the plate antagonistic bioassay and maize pot experiment in the greenhouse. In 40 days after inoc ulation (DAI), the gfp- tagged strain still could be detected in rhizospheric soil, roots, stems and leaves tissues of maize, meanwhile its colonization into roots, stems and leaves was observed at 9 DAI by confocal laser scanning mi croscope. These indicated that Y19 owns a good transduction in host plant. Key words: Maize; Maize endophytic bacteria; Green fluorescent protein; Plasmid; Genetic transformation 收 稿 日 期 :2014-08-21 基 金 项 目 : 云 南 省 玉 米 产 业 体 系 项 目 作 者 简 介 : 蒋 晓 玲 (1988-), 女, 新 疆 阿 勒 泰 人, 硕 士, 主 要 从 事 植 物 病 害 生 物 防 治 研 究 E-mail:850273778@qq.com 何 鹏 飞 为 并 列 第 一 作 者 何 月 秋 为 本 文 通 讯 作 者 植 物 内 生 细 菌 的 发 现 可 追 溯 至 19 世 纪 70 年 [1] 代, 它 是 一 类 生 活 于 植 物 组 织 内 对 寄 主 的 生 长 发 育 无 持 续 性 伤 害 的 细 菌 [2] 内 生 细 菌 除 了 在 植 物 营 养 污 染 物 降 解 胁 迫 防 御 反 应 等 方 面 发 挥 着 重 要 的 作 用 外 [3~5], 还 能 促 进 植 物 生 长 防 控 病 害 [6,7] 越 来 越 多 的 内 生 芽 孢 杆 菌 (Bacillus) 被 从 不 同 植 物 组 织 中 分 离 出 来 [8~10], 其 在 植 物 寄 主 体 内 的 生 存 运 行 规 律 与 促 生 防 病 等 功 能 关 系 也 得 到 了 重 视 在 众 多 研
3 期 蒋 晓 玲 等 : 玉 米 内 生 细 菌 Y19 的 荧 光 标 记 及 其 在 玉 米 体 内 的 定 殖 应 用 效 果 51 究 技 术 中, 绿 色 荧 光 蛋 白 (Green fluorescent protein, GFP) 标 记 因 具 有 无 须 外 源 反 应 底 物 操 作 简 单 荧 光 稳 定 检 测 方 便 对 靶 标 生 物 或 细 胞 的 活 性 无 不 良 影 响 以 及 可 原 位 实 时 动 态 观 察 等 特 点, 作 为 一 种 良 [11~13] 好 标 记 而 被 广 泛 采 用 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 Y19( 简 称 Y19) 是 本 实 验 室 从 玉 米 种 子 上 分 离 出 的 具 有 抑 制 多 种 植 物 病 原 真 菌 菌 [14] 株, 对 玉 米 等 不 同 作 物 具 有 良 好 的 促 生 效 果 为 进 一 步 探 究 Y19 在 玉 米 体 内 的 定 殖 情 况 和 为 后 续 的 产 品 制 剂 开 发, 将 绿 色 荧 光 质 粒 phapii 导 入 Y19 的 自 然 感 受 细 胞 中, 获 得 GFP 标 记 的 工 程 菌 株 并 研 究 其 在 玉 米 上 的 定 殖 规 律 1 材 料 与 方 法 1.1 实 验 材 料 菌 株 和 质 粒 : 内 生 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 Y19 玉 米 茎 腐 镰 刀 菌 (Fusarium graminearum,f. verticillium) 大 肠 杆 菌 (E. coli)tg1 为 本 实 验 室 保 存 ; 携 带 氨 苄 青 霉 素 抗 性 和 卡 那 霉 素 抗 性 标 记 质 粒 phapⅡ 由 南 京 农 [15] 业 大 学 沈 其 荣 教 授 提 供 培 养 基 :LB 固 体 或 液 体 培 养 基, 解 淀 粉 芽 孢 杆 [16] 菌 自 然 转 化 培 养 基 GCHE GC 以 及 转 化 缓 冲 液, PDA 固 体 培 养 基 抗 生 素 : 卡 那 霉 素 (Kan) 的 使 用 浓 度 25 μg/ml 玉 米 品 种 : 广 玉 88, 由 云 南 广 大 种 业 有 限 公 司 提 供 1.2 实 验 方 法 1.2.1 GFP 质 粒 phapii 的 提 取 从 大 肠 杆 菌 中 提 取 质 粒 phapii 参 考 分 子 克 隆 实 验 指 南 [17] 1.2.2 Y19 的 自 然 转 化 Y19 自 然 感 受 态 细 胞 的 制 备 参 考 Idris 提 出 的 方 法, 略 作 修 改 挑 取 LB 平 板 上 过 夜 活 化 的 Y19 单 菌 落 于 液 体 LB 中,37 170 r/min 振 荡 培 养 过 夜 ; 次 日, 吸 取 一 定 体 积 的 Y19 过 夜 培 养 物 于 新 鲜 无 菌 的 GCHE 培 养 液 中, 并 使 其 溶 液 OD 600 在 0.3 左 右 ;37 220 r/min 剧 烈 振 荡 培 养 至 OD 600 约 1.4 左 右 ; 加 入 等 体 积 的 GC 培 养 液 稀 释, 相 同 条 件 继 续 振 荡 1~1.5 h; 将 此 时 的 细 菌 培 养 物 均 匀 分 成 两 管, 在 5 000 r/min 下 于 室 温 离 心 5 min; 留 下 1/20 培 养 基 与 沉 淀, 重 悬 后 即 为 Y19 的 自 然 感 受 态 细 胞 Y19 的 自 然 转 化 及 标 记 菌 株 的 筛 选 : 向 感 受 态 细 胞 悬 液 中 加 入 2 ml 混 有 1 μg phapii 质 粒 的 转 化 缓 冲 液 ; 混 匀, 于 37 75 r/min 摇 床 缓 慢 振 荡 20~ 30 min; 向 其 中 加 入 含 500 μl 卡 那 霉 素 的 液 体 LB, 剧 烈 振 摇 培 养 90 min;10 000 r/min, 室 温 离 心 4 min, 留 下 1/5 培 养 基 与 沉 淀, 将 重 悬 细 胞 均 匀 涂 布 于 含 有 卡 那 霉 素 的 LB 平 板 上 ;37 过 夜 培 养, 次 日 观 察 平 板 上 有 无 抗 性 菌 落 的 形 成, 并 在 光 电 折 射 仪 ( 蓝 盾 621) 下 观 察 有 无 绿 色 荧 光 菌 落 的 出 现 挑 取 发 绿 色 荧 光 的 单 菌 落 ( 定 名 为 Y19-GFPmut3a) 于 含 有 卡 那 霉 素 的 液 体 LB 中,37,160 r/min 振 荡 培 养 6~8 h, 提 取 质 粒 并 转 化 大 肠 杆 菌 感 受 态 细 胞 予 以 验 证 1.2.3 标 记 菌 株 的 遗 传 稳 定 性 测 定 过 夜 活 化 标 记 菌 株 Y19-GFPmut3a, 以 0.1%(v/v) 比 例 转 接 于 无 抗 生 素 LB 液 体 培 养 基 中,37, 160 r/min 振 荡 培 养 5 h; 再 以 相 同 的 接 种 比 例 转 接 于 无 抗 生 素 的 LB 液 体 培 养 基, 相 同 条 件 下 培 养, 如 此 重 复 培 养 10 次 每 次 转 接 前, 取 样 10 倍 梯 度 稀 释 并 均 匀 涂 布 于 不 含 抗 生 素 的 LB 平 板 上,37 过 夜 培 养, 统 计 菌 落 总 数 和 发 绿 色 荧 光 的 菌 落 数, 计 算 标 记 菌 在 非 选 择 压 力 下 的 稳 定 性 1.2.4 野 生 菌 株 和 标 记 菌 株 的 生 长 曲 线 测 定 过 夜 活 化 Y19 与 Y19-GFPmut3a, 离 心 收 集 菌 体, 用 无 菌 的 液 体 LB 洗 涤, 加 入 适 量 的 液 体 LB 将 其 密 度 调 整 至 OD 600 为 1.0 左 右, 以 1% (v/v) 接 种 比 例 分 别 接 种 至 无 菌 的 LB 液 体 培 养 基 中,37,160 r/min 振 荡 培 养 在 接 种 后 的 第 3 4 5 6 8 10 小 时 以 及 随 后 每 隔 10 h 测 定 细 胞 培 养 物 的 OD 600 直 到 60 h 为 止, 绘 制 出 野 生 型 和 标 记 菌 的 生 长 曲 线 1.2.5 标 记 菌 株 对 玉 米 茎 腐 病 原 菌 以 及 轮 枝 镰 刀 菌 拮 抗 活 性 观 察 分 别 截 取 一 小 块 玉 米 茎 腐 病 原 菌 和 轮 枝 镰 刀 菌 的 菌 丝 块 接 种 于 PDA 平 板 中 央,28 下 化 培 养 2~3 d; 用 5 mm 打 孔 器 在 菌 落 的 边 缘 打 取 菌 饼, 并 用 接 种 针 将 其 转 移 至 新 制 备 的 PDA 平 板 中 央, 无 菌 牙 签 蘸 取 Y19-GFPmut3a 和 Y19, 点 接 于 距 菌 饼 3.0 cm 处 28 下 培 养 5~7 d, 观 察 抑 菌 圈 大 小 1.2.6 野 生 菌 株 和 标 记 菌 株 对 玉 米 的 促 生 效 果 比 较 菌 液 的 制 备 : 挑 取 Y19-GFPmut3a 和 Y19 的 单 菌 落 分 别 接 种 于 含 或 不 含 卡 那 霉 素 LB 液 体 培 养 基, 37 160 r/min 振 荡 培 养 3~4 d, 使 其 营 养 耗 尽 至 90% 以 上 细 胞 形 成 芽 孢,10 倍 梯 度 稀 释 并 涂 布 培 养 以 检 测 菌 量 接 菌 与 培 养 : 取 大 田 土 与 漂 浮 育 苗 基 质 按 4 1 比 例 混 合,180, 干 热 灭 菌 5 h, 自 然 冷 却 后 过 夜, 再 灭 菌 1 次, 用 于 玉 米 的 栽 培 种 植 ; 拌 入 适 量 的 细 菌 悬 液 至 菌 体 密 度 达 10 6 CFU/g 土, 均 匀 分 装 于 盆 钵 中 并 播 入 玉 米 种 子 (4 粒 / 盆 ) 实 验 设 置 无 菌 水 液 体 LB 野 生 型 及 荧 光 标 记 菌 共 4 个 处 理, 每 个 处 理 3 个 重
52 玉 米 科 学 23 卷 复, 每 个 重 复 4 盆 出 苗 后, 根 据 土 壤 墒 情 补 入 适 量 的 水 分 在 播 种 后 的 第 30 天 测 量 玉 米 型 高 ( 茎 基 到 最 长 叶 尖 间 的 距 离 ) 根 长 鲜 重 干 重 等 性 状 指 标 1.2.7 标 记 菌 株 的 回 收 及 其 在 玉 米 体 内 定 殖 部 位 的 观 察 按 1.2.6 中 方 法 种 植 玉 米, 在 玉 米 种 子 播 种 后 的 第 3 6 9 12 20 30 及 40 d 分 别 取 样 调 查 根 际 根 围 根 表 土 壤 以 及 根 茎 和 叶 片 组 织 中 的 Y19-GF [18] Pmut3a 存 活 数 量 10 倍 梯 度 稀 释 根 际 根 围 根 表 土, 制 备 土 壤 悬 浮 液, 吸 取 200 μl 的 土 壤 稀 释 液, 均 匀 涂 布 于 含 有 卡 那 霉 素 的 LB 平 板 上,37 过 夜 培 养, 在 光 电 折 射 仪 下 统 计 绿 色 荧 光 菌 落 数 分 别 取 玉 米 苗 植 株 的 根 茎 及 叶 各 0.5 g,1% 次 氯 酸 钠 表 面 消 毒 5 min,75 % 酒 精 消 毒 3 min, 无 菌 水 漂 洗 3~4 次, 吸 取 最 后 1 次 漂 洗 水 涂 布 于 含 卡 那 霉 素 的 LB 平 板 上, 以 确 认 表 面 消 毒 彻 底 ; 加 入 2 ml 无 菌 水 研 磨 成 匀 浆 状, 静 置 30 min,10 倍 梯 度 稀 释, 吸 取 一 定 体 积 的 稀 释 液, 均 匀 涂 布 于 含 有 卡 那 霉 素 的 LB 平 板 上,37 过 夜 培 养, 在 光 电 折 射 仪 下 统 计 绿 色 荧 光 菌 落 数 在 播 种 后 的 第 3 6 9 天, 观 察 玉 米 叶 茎 初 生 根 次 生 根 不 同 部 位 上 的 发 绿 色 荧 光 菌 从 土 壤 拔 出 玉 米 苗, 用 无 菌 水 洗 净 黏 附 在 根 表 的 泥 土, 以 无 菌 吸 水 纸 吸 干 玉 米 根 表 水 分 随 后 用 干 净 的 手 术 刀 将 根 切 成 长 1 cm 左 右 的 小 段, 将 其 置 于 载 玻 片 上 滴 加 一 滴 10% 的 无 菌 甘 油, 盖 上 盖 玻 片, 在 莱 卡 激 发 共 聚 焦 荧 光 显 微 镜 下 观 察, 观 察 时 使 用 的 激 发 波 长 为 480 nm, 收 集 波 长 为 510~560 nm 叶 茎 等 组 织 部 位 的 荧 光 观 察, 除 了 无 需 用 无 菌 水 洗 涤 外, 其 他 操 作 细 节 与 根 系 类 似 2 结 果 与 分 析 2.1 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 Y19 的 GFP 标 记 将 大 肠 杆 菌 芽 孢 杆 菌 穿 梭 GFP 质 粒 phapii 导 入 Y19 的 自 然 感 受 态 细 胞, 结 果 发 现, 在 卡 那 霉 素 LB 平 板 上 长 出 抗 性 菌 落 抗 性 菌 落 在 光 电 折 射 仪 上 的 形 态 呈 现 出 明 亮 的 绿 色 ; 在 荧 光 显 微 镜 下 也 可 以 观 察 到 单 个 菌 体 细 胞 发 出 强 烈 的 绿 色 荧 光, 菌 体 的 形 状 清 晰, 呈 典 型 的 杆 状, 表 明 GFP 在 Y19 的 细 胞 内 被 成 功 地 表 达 ( 图 1) 注 :A 为 Y19-GFPmut3a 菌 落 ;B 为 Y19-GFPmut3a 菌 体 细 胞 Note: A, Y19-GFPmut3a colonies; B, Y19-GFPmut3a cells. Fig.1 图 1 光 电 折 射 仪 及 荧 光 显 微 镜 下 的 Y19-GFPmut3a GFP-tagged strain Y19-GFPmut3a under optical refractometer and fluorescence microscope 2.2 标 记 菌 株 Y19-GFPmut3a 中 质 粒 的 遗 传 稳 定 性 连 续 稀 释 培 养 的 试 验 结 果 表 明, 随 着 培 养 时 间 的 加 长, 质 粒 phapii 在 菌 体 Y19 细 胞 中 不 断 地 丢 失 ; 继 代 培 养 10 次 (50 h) 后, 兼 有 卡 那 霉 素 抗 性 且 发 荧 光 的 菌 株 占 菌 落 总 数 的 比 例 为 46%, 明 显 低 于 其 [19] 他 人 的 实 验 结 果 表 明 质 粒 phapii 在 Y19 中 不 太 稳 定 芽 孢 杆 菌 在 实 验 室 营 养 丰 富 的 条 件 下 大 约 20~30 min 分 裂 1 次, 在 自 然 条 件 下 繁 殖 一 代 所 需 的 时 间 为 50~100 h [20] 据 此 推 算, 初 步 认 为 标 记 菌 株 适 合 于 较 短 时 期 的 定 殖 研 究 2.3 野 生 菌 株 和 标 记 菌 株 的 生 长 曲 线 比 较 菌 株 Y19 与 Y19-GFPmut3a 在 LB 液 体 培 养 基 中 的 生 长 曲 线 如 图 3 所 示, 在 培 养 的 前 10 h, 标 记 菌 株 的 生 长 速 度 比 野 生 菌 株 略 慢, 但 差 异 不 明 显, 之 后 两 株 菌 生 长 曲 线 的 变 化 趋 势 基 本 相 同 说 明 外 源 多 拷 贝 质 粒 的 引 入 和 外 源 蛋 白 的 表 达 对 宿 主 菌 的 生 长 量 并 未 产 生 明 显 的 不 利 影 响 2.4 野 生 菌 株 和 标 记 菌 株 对 玉 米 茎 腐 病 菌 拮 抗 能 力 比 较 从 图 4 可 以 看 出, 标 记 菌 株 与 野 生 型 菌 株 对 玉 米 茎 腐 病 菌 ( 禾 谷 镰 刀 菌 和 轮 枝 镰 刀 菌 ) 的 拮 抗 能 力 基 本 相 同, 外 源 质 粒 的 引 入 对 Y19 的 病 原 真 菌 拮 抗 活 性 并 无 太 大 的 影 响
质 粒 保 持 率 (%) Plasmid retention rate 3 期 蒋 晓 玲 等 : 玉 米 内 生 细 菌 Y19 的 荧 光 标 记 及 其 在 玉 米 体 内 的 定 殖 应 用 效 果 53 120 100 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 转 接 次 数 (5 h/ 次 ) Adapter frequency 图 2 Y19-GFPmut3a 的 质 粒 稳 定 性 检 测 Fig.2 Plasmid stability detection of Y19-GFPmut3a 3.00 2.50 2.00 OD 600 1.50 1.00 0.50 0.00 Bam-Y19 Y19-GFPmut3a 3 4 5 6 8 10 20 30 40 50 60 培 养 时 间 (h) Culture time 图 3 野 生 型 Y19 与 Y19-GFPmut3a 的 生 长 曲 线 Fig.3 Growth curve of Y19 and Y19-GFPmut3a 注 :A 为 禾 谷 镰 刀 菌 ;B 为 轮 枝 镰 刀 菌 ( 左 : 对 照 ; 中 :Y19 野 生 型 ; 右 :Y19-GFPmut3a) Note: A, Fusarium graminearum; B, F. verticillium (Left: blank control; middle: Y19; right: Y19-GFPmut3a). 图 4 野 生 型 Y19 与 Y19-GFPmut3a 对 茎 腐 病 菌 的 拮 抗 Fig.4 Antagonism of Y19 and Y19-GFPmut3a against Fusarium 2.5 野 生 菌 株 和 标 记 菌 株 的 促 生 长 效 果 比 较 测 量 玉 米 播 种 第 30 天 玉 米 的 型 高 根 长 鲜 重 及 干 重 ( 表 1) 与 无 菌 水 及 液 体 LB 处 理 比 较, 拌 施 Y19 和 Y19-GFPmut3a 的 处 理 组 玉 米 的 平 均 型 高 干 重 及 鲜 重 都 显 著 增 加, 以 Y19-GFPmut3a 处 理 组 促 生 效 果 最 为 明 显 与 空 白 对 照 相 比,Y19-GFPmut3a 处 理 的 根 长 差 异 不 显 著, 但 玉 米 型 高 鲜 重 以 及 干 重 分 别 增 加 26.63% 73.54% 和 155.21%, 略 高 于 野 生 型 处 理, 说 明 质 粒 的 引 入 没 有 影 响 Y19 促 进 玉 米 生 长 的 活 性 2.6 标 记 菌 株 在 玉 米 根 围 土 壤 及 不 同 组 织 中 的 定 殖 标 记 菌 株 在 玉 米 的 根 围 土 壤 及 玉 米 组 织 部 位 中 的 定 殖 总 体 上 呈 现 出 先 上 升 后 下 降 的 趋 势 ( 图 5) 接 菌 的 初 期 阶 段, 标 记 菌 在 根 表 土 中 的 数 量 持 续 增 加, 接 种 后 的 第 12 天 达 到 最 高 峰, 后 期 开 始 下 降, 至 第 40 天 与 最 初 的 接 种 量 基 本 持 平 ; 根 围 土 中 标 记 菌 数 量 在 前 期 (3~12 d) 略 高 于 根 际 土, 初 期 稳 定 (3~ 9 d), 中 期 缓 慢 增 长 (9~30 d), 随 后 略 有 下 降, 仍 保 持 在 一 种 高 数 量 水 平, 表 明 内 生 细 菌 Y19 与 宿 主 玉 米 存 有 良 好 的 互 作 关 系
回 收 菌 落 的 对 数 值 (l g CFU/g) Recovery of colony on the numerical 54 玉 米 科 学 23 卷 Table 1 表 1 野 生 菌 株 和 标 记 菌 株 的 促 生 长 效 果 Growth-promotion effect of Y19 wild type and tagged strain Y19-GFPmut3a 处 理 型 高 (cm) 根 长 (cm) 鲜 重 (g) 干 重 (g) Treatment Type height Root length Fresh weight Dry weight H2O 33.46±0.30 c 27.04±0.65 a 45.12±1.89 b 3.17±0.57 b LB 34.20±0.48 bc 2.21 27.92±0.83 a 3.25 42.89±0.59 b -4.94 4.52±0.25 b 42.59 Y19 39.50±0.56 bc 18.05 26.73±0.58 a -1.15 66.12±0.57 a 46.54 7.10±0.40 a 123.97 Y19-GFPmut3a 42.37±0.89 a 26.63 26.73±0.59 a -1.15 73.54±0.51 a 73.54 8.09±0.68 a 155.21 7.00 6.50 6.00 5.50 5.00 4.50 4.00 3.50 根 茎 叶 根 际 土 根 围 土 根 表 土 3.00 2.50 2.00 3d 6d 9d 12d 20d 30d 40d 取 样 时 间 Sampling time 图 5 Fig.5 荧 光 标 记 菌 Y19-GFPmut3a 在 玉 米 根 围 土 壤 及 不 同 组 织 内 的 定 殖 动 态 Colonizing dynamic of Y19-GFPmut3a in maize rhizospheric soils and tissues 2.7 标 记 菌 株 在 玉 米 体 内 的 定 殖 显 微 观 察 注 :A 为 根 对 照 ;B 为 茎 对 照 ;C 为 叶 对 照 ;D 为 根 毛 ;E 为 主 根 ;F 为 次 生 根 ;G 为 茎 薄 壁 组 织 ( 第 6 天 );H 为 叶 组 织 ( 第 9 天 );I 为 根 冠 组 织 箭 头 表 示 Y19-GFPmut3a 菌 株 所 在 位 置 Note: A-C, Negative controls, Root(A), Stem(B), Leaf(C); D, Root hairs; E, Main root; F, Secondary root; G, Stem parenchyma(6 DAI); H, Leaf(9 DAI); I, Root cap. The arrow showing colonization sites of Y19-GFPmut3a. Fig.6 图 6 Y19-GFPmut3a 在 玉 米 根 茎 及 叶 组 织 中 的 定 殖 The colonization of Y19-GFPmut3a in maize root, stem and leaf tissues
3 期 蒋 晓 玲 等 : 玉 米 内 生 细 菌 Y19 的 荧 光 标 记 及 其 在 玉 米 体 内 的 定 殖 应 用 效 果 55 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 观 察,Y19-GFPmut3a 在 玉 米 植 株 体 内 的 定 殖 结 果 如 图 6 所 示 接 种 后 的 第 3 天 就 可 以 观 察 到 标 记 菌 在 玉 米 根 系 定 殖, 优 先 定 殖 于 玉 米 的 根 毛 分 生 区 以 及 伸 长 区, 同 时 还 伴 随 有 致 密 的 生 物 膜 形 成 ; 第 6 天, 在 茎 组 织 的 切 片 中 发 现 标 记 菌 的 踪 迹, 这 与 在 茎 组 织 中 回 收 到 标 记 菌 的 结 果 相 吻 合 ; 第 9 天, 在 叶 片 组 织 有 标 记 菌 株 的 存 在, 说 明 标 记 菌 株 能 向 地 上 运 输 在 根 冠 部 分 很 少 有 标 记 菌 的 定 殖, 这 可 能 与 根 冠 部 分 的 细 胞 未 分 化 完 全 或 生 长 过 快 菌 体 数 量 少 难 以 见 到 有 关 3 结 论 与 讨 论 在 芽 孢 杆 菌 中 表 达 异 源 蛋 白 存 在 的 一 个 难 题 就 是 质 粒 不 稳 定 质 粒 不 稳 定 可 以 划 分 为 分 离 不 稳 定 和 结 构 不 稳 定, 其 中 结 构 不 稳 定 与 质 粒 的 复 制 方 式 有 关 目 前, 质 粒 复 制 方 式 主 要 有 滚 环 和 θ 复 制 以 芽 孢 杆 菌 质 粒 为 例, 滚 环 复 制 类 型 常 见 于 一 些 小 分 子 量 高 拷 贝 的 载 体 中, 如 pc194 pe19ts 及 pub110 等, 此 类 型 的 质 粒 在 复 制 时 会 形 成 大 量 的 由 单 链 DNA(ssDNAs) 和 高 分 子 量 多 聚 物 (HMWMs) 组 成 的 中 间 体, 这 些 物 质 较 为 活 跃, 积 极 参 与 质 粒 内 部 序 列 的 重 排 事 件, 从 而 导 致 质 粒 结 构 上 的 不 稳 定 [21] 同 时 [22] 也 有 报 道 认 为, 外 源 插 入 片 段 会 与 pub110 质 粒 内 部 的 同 源 序 列 发 生 交 换, 从 而 导 致 片 段 的 丢 失 荧 光 质 粒 phapii 是 以 pub110 为 骨 架 构 建 起 来 的, 在 无 选 择 压 条 件 下, 比 较 容 易 从 芽 孢 杆 菌 中 丢 失, 本 研 究 的 结 果 也 证 实 了 这 一 点 与 他 人 的 结 果 相 比, phapii 在 Y19 中 的 稳 定 性 更 差, 但 其 中 原 因 需 要 进 一 步 探 讨 标 记 菌 株 在 玉 米 根 内 的 定 殖 数 量 呈 现 持 续 增 长 的 趋 势, 可 能 与 玉 米 生 长 过 程 中 根 部 可 侵 入 并 定 殖 的 位 点 逐 渐 增 多 有 关 接 菌 第 3 天 就 在 玉 米 的 茎 叶 组 织 中 检 测 到 标 记 菌, 这 显 示 内 生 菌 在 宿 主 植 物 体 内 有 良 好 的 传 导 性 能 标 记 菌 在 茎 叶 中 的 定 殖 趋 势 表 现 出 前 期 不 断 上 升, 分 别 于 第 9 天 第 12 天 达 到 最 大 值, 后 开 始 下 降, 但 叶 片 组 织 中 的 菌 含 量 高 于 茎 组 织, 这 可 能 是 由 于 蒸 腾 拉 力 或 其 他 因 素 ( 如 细 菌 鞭 毛 运 动 水 流 等 ) 的 作 用 菌 株 可 以 在 维 管 束 内 由 地 下 部 向 茎 甚 至 叶 等 地 上 部 迁 移 或 扩 散, 而 叶 片 是 光 合 作 用 的 场 所, 富 含 有 更 多 新 合 成 碳 水 化 合 物 此 外, 茎 是 运 输 水 分 矿 物 质 养 分 的 通 道, 如 果 茎 组 织 中 含 菌 量 过 多 反 而 会 堵 塞 运 输 通 道 不 利 于 作 物 的 生 长, 作 物 不 能 很 好 生 长, 对 于 具 有 良 好 协 同 关 系 的 内 生 细 菌 来 说, 也 是 不 利 的 有 研 究 指 出,pHAPII 在 芽 孢 杆 菌 中 容 易 丢 失, [23] 只 适 合 于 短 期 (15~20 d) 研 究 本 研 究 中, 接 种 40 d 后, 仍 然 能 够 从 玉 米 的 根 围 土 壤 根 茎 及 叶 组 织 中 分 别 检 测 到 10 6 10 4 10 4 10 3 CFU/g 的 荧 光 标 记 菌, 表 明 高 拷 贝 不 稳 定 质 粒 的 引 入 虽 然 给 宿 主 菌 带 来 了 沉 重 的 能 量 负 荷, 但 在 玉 米 体 内 仍 然 高 剂 量 的 存 在, 这 一 方 面 证 明 Y19 来 自 玉 米 适 于 在 玉 米 体 内 生 存 ; 另 一 方 面 说 明 种 子 中 分 离 出 来 的, 它 与 玉 米 一 定 存 在 良 好 互 作 关 系, 在 玉 米 生 长 增 产 防 病 中 可 能 存 在 重 大 意 义 Y19-GFPmut3a 在 寄 主 植 物 上 的 定 殖 行 为 与 前 人 对 其 他 内 生 菌 的 报 道 相 似, 优 先 定 殖 于 根 毛 次 生 根 与 主 根 交 界 处 等 细 胞 间 隙 较 大 的 区 域 一 般 认 为, 生 防 细 菌 在 植 物 根 系 的 定 殖 与 根 系 分 泌 物 自 身 的 趋 化 性 及 生 物 膜 的 形 成 密 切 相 关 恶 臭 假 单 胞 杆 菌 (Pseudomonas putida) KT2440 接 种 48 h 后 就 可 在 [24] 玉 米 根 上 形 成 致 密 生 物 膜 并 实 现 最 大 化 的 定 殖 本 研 究 中 观 察 到, 在 接 种 的 第 3 天,Y19-GFPmut3a 也 能 在 玉 米 根 部 形 成 生 物 膜, 生 物 膜 的 形 成 有 助 于 生 防 细 菌 长 时 间 的 定 殖, 减 少 或 避 免 寄 主 植 物 遭 受 病 原 微 生 物 的 侵 染, 从 而 保 护 寄 主 植 物 荧 光 定 殖 观 察 结 果 表 明, 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 Y19 的 确 能 够 进 入 玉 米 的 内 部, 这 有 助 于 Y19 更 稳 定 地 发 挥 其 促 生 防 病 功 能 Y19-GFPmut3a 在 生 长 速 度 抑 菌 效 果 及 促 生 长 效 果 上 与 野 生 型 菌 株 Y19 相 似, 在 组 织 切 片 及 菌 量 检 测 证 明 它 能 很 好 地 在 玉 米 根 围 根 表 土 及 植 株 体 内 定 殖, 由 于 Y19 本 身 是 从 玉 米 种 子 中 分 离 到 的 内 生 菌, 从 而 间 接 地 表 明 Y19 可 以 用 于 玉 米 促 生 长 防 病 等 肥 料 及 药 剂 的 开 发 参 考 文 献 : [1] Hallmann J, Quadt-Hallmann A, Mahaffee W F, et al. Bacterial en dophytes in agricultural crops[j]. Canadian Journal of Microbiology, 1997, 43(10): 895-914. [2] Schulz B, Boyle C. What are endophytes?[m]//microbial root endo phytes[j]. Springer Berlin Heidelberg, 2006: 1-13. [3] Chi F, Shen S H, Cheng H P, et al. Ascending migration of endophyt ic rhizobia, from roots to leaves, inside rice plants and assessment of benefits to rice growth physiology[j]. Applied and Environmental Mi crobiology, 2005, 71(11): 7271-7278. [4] Siciliano S D, Fortin N, Mihoc A, et al. Selection of specific endo phytic bacterial genotypes by plants in response to soil contamination [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(6): 2469-2475. [5] Cho S J, Park S R, Kim M K, et al. Endophytic Bacillus sp. isolated from the interior of balloon flower root [J]. Bioscience, Biotechnolo gy, and Biochemistry, 2002, 66(6): 1270-1275.
56 玉 米 科 学 23 卷 [6] Feng Y, Shen D, Song W. Rice endophyte Pantoea agglomerans YS19 promotes host plant growth and affects allocations of host pho tosynthates[j]. Journal of Applied Microbiology, 2006, 100(5): 938-945. [7] Chanway C, Shishido M, Nairn J, et al. Endophytic colonization and field responses of hybrid spruce seedlings after inoculation with plant growth- promoting rhizobacteria[j]. Forest Ecology and Man agement, 2000, 133(1-2): 81-88. [8] Liu K, Ding X, Deng B, et al. Isolation and characterization of endo phytic taxol-producing fungi from Taxus chinensis[j]. Journal of In dustrial Microbiology & Biotechnology, 2009, 36(9): 1171-1177. [9] Rai R, Dash P K, Prasanna B M, et al. Endophytic bacterial flora in the stem tissue of a tropical maize (Zea mays L.) genotype: isolation, identification and enumeration[j]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2007, 23(6): 853-858. [10] Rijavec T, Lapanje A, Dermastia M, et al. Isolation of bacterial en dophytes from germinated maize kernels[j]. Canadian journal of mi crobiology, 2007, 53(6): 802-808. [11] 姚 震 声, 陈 中 义, 陈 志 谊, 等. 绿 色 荧 光 蛋 白 基 因 标 记 野 生 型 生 防 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 研 究 [J]. 生 物 工 程 学 报,2003,19(5):551-556. Yao Z S, Chen Z Y, Chen Z Y, et al. Genetically marking of natural biocntrol bacterium Bacillus subtilis strains with Green Fluorescent Protein Gene[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2003, 19(5): 551-556. (in Chinese) [12] 田 涛, 亓 雪 晨, 王 琦, 等. 芽 孢 杆 菌 绿 色 荧 光 蛋 白 标 记 及 其 在 小 麦 体 表 定 殖 的 初 探 [J]. 植 物 病 理 学 报,2004,34(4):346-351. Tian T, Qi X C, Wang Q, et al. Colonization study of GFP tagged Bacillus strains on wheat surface[j]. Acta Phytopathologica Sinica, 2004, 34(4): 346-351. (in Chinese) [13] 范 晓 静, 邱 思 鑫, 吴 小 平, 等. 绿 色 荧 光 蛋 白 基 因 标 记 内 生 枯 草 芽 孢 杆 菌 [J]. 应 用 与 环 境 生 物 学 报,2007,13(4):530-534. Fan X J, Qiu S X, Wu X P, et al. Endophytic Bacillus subtilis strain BS-2 labeled with Green Fluorescent Protein Gene[J]. Chin. J. Ap pl. Environ. Biol., 2007, 13(4): 530-534. (in Chinese) [14] 郭 力 维. 云 南 省 玉 米 内 生 细 菌 种 类 和 有 益 潜 力 菌 株 研 究 [D]. 昆 明 : 云 南 农 业 大 学,2013. [15] Cao Y, Zhang Z, Ling N, et al. Bacillus subtilis SQR9 can control Fusarium wilt in cucumber by colonizing plant roots[j]. Biology and Fertility of Soils, 2011, 47(5): 495-506. [16] Idris E S E, Iglesias D J, Talon M, et al. Tryptophan-dependent pro duction of indole-3-acetic acid (IAA) affects level of plant growth promotion by Bacillus amyloliquefaciens FZB42[J]. Molecular Plant-microbe Interactions, 2007, 20(6): 619-626. [17] DY J. Molecular Cloning- A Laboratory Manual[D]. Beijing: Sci ence Press, 2002. [18] 王 志 远, 吴 兴 兴, 何 月 秋, 等. 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 B9601-Y2 抗 性 基 因 标 记 及 其 在 作 物 根 部 的 定 殖 能 力 [J]. 华 中 农 业 大 学 学 报, 2012,31(3):313-319. Wang Z Y, Wu X X, He Y Q, et al. Resistance genes labeling and colonization ability of a biocontrol agent B9601-Y2 of Bacillus am yloliquefaciens in crop rhizosphere[j]. Journal of Huazhong Agricul tural University, 2012, 31(3): 313-319. (in Chinese) [19] Zhang N, Wu K, He X, et al. A new bioorganic fertilizer can effec tively control banana wilt by strong colonization with Bacillus subtil is N11[J]. Plant and Soil, 2011, 344(1-2): 87-97. [20] Hecker M, Schumann W, Völker U. Heat-shock and general stress response in Bacillus subtilis[j]. Molecular Microbiology, 1996, 19 (3): 417-428. [21] Gruss A, Ehrlich S D. The family of highly interrelated single-strand ed deoxyribonucleic acid plasmids[j]. Microbiological Reviews, 1989, 53(2): 231-241. [22] Chen X H, Vater J, Piel J, et al. Structural and functional character ization of three polyketide synthase gene clusters in Bacillus amylo liquefaciens FZB42[J]. Journal of Bacteriology, 2006, 188(11): 4024-4036. [23] 张 楠. 根 际 有 益 芽 孢 杆 菌 N11 及 SQR9 与 植 物 根 系 的 互 作 研 究 [D]. 南 京 : 南 京 农 业 大 学,2012. [24] Espinosa-Urgel M, Kolter R, Ramos J L. Root colonization by Pseu domonas putida: love at first sight[j]. Microbiology, 2002, 148(2): 341-343. ( 责 任 编 辑 : 高 阳 )