第 30 卷 第 2 期 2015 年 4 月 天 津 科 技 大 学 学 报 Journal of Tianjin University of Science & Technology Vol. 30 No. 2 Apr. 2015 DOI:10.13364/j.issn.1672-6510.20140064 IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 的 构 建 和 性 能 分 析 骆 健 美, 郑 媛 媛, 王 敏 ( 工 业 发 酵 微 生 物 教 育 部 重 点 实 验 室, 天 津 市 工 业 微 生 物 重 点 实 验 室, 天 津 科 技 大 学 生 物 工 程 学 院, 天 津 300457) 摘 要 : 利 用 pet-28a(+) 质 粒 将 来 源 于 耐 辐 射 异 常 球 菌 (Deinococcus radiodurans)r1 的 irre 基 因 在 大 肠 杆 菌 (Escherichia coli)bl21(de3) 中 进 行 异 源 表 达, 在 IPTG 终 浓 度 2,mmol/L 诱 导 温 度 37, 诱 导 培 养 6,h 条 件 下 进 行 了 蛋 白 诱 导. 进 一 步 考 察 IrrE 异 源 表 达 对 大 肠 杆 菌 生 长 性 能 和 耐 受 能 力 的 影 响, 结 果 表 明 :IrrE 的 表 达 能 够 提 高 大 肠 杆 菌 正 常 条 件 下 的 生 长 速 率 和 最 终 生 物 量 ; 同 时, 能 够 不 同 程 度 提 高 大 肠 杆 菌 在 压 力 冲 击 下 的 存 活 能 力, 其 中, 高 渗 条 件 下 存 活 能 力 的 提 高 最 为 明 显. 而 重 组 菌 株 在 压 力 冲 击 下 的 生 长 速 率 和 最 终 生 物 量 均 明 显 高 于 对 照 菌 株. 这 说 明 IrrE 在 提 高 大 肠 杆 菌 的 压 力 耐 受 性 方 面 表 现 出 良 好 的 效 果. 关 键 词 :IrrE; 大 肠 杆 菌 ; 异 源 表 达 ; 全 局 转 录 ; 耐 受 性 中 图 分 类 号 :Q786 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 :1672-6510(2015)02-0006-05 The Construction of Recombinant Escherichia coli by IrrE and Cell Performance Analysis LUO Jianmei,ZHENG Yuanyuan,WANG Min (Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology,College of Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China) Abstract:The heterologous expression of irre,from Deinococcus radiodurans R1,in E. coli BL21(DE3)was carried out using the vector pet-28a(+). The optimal protein expression conditions of IrrE were as follows.the final concentration of IPTG was 2,mmol/L,and the induction temperature and time were 37, and 6,h,respectively. The influence of IrrE on cell growth and tolerance was further investigated. The results indicated that IrrE could enhance the growth rate and produce more final biomass of Escherichia coli under normal conditions,and improve the survival ability of the cell under stress shock to different extent,especially the tolerance to osmotic shock. The growth rate was higher and significantly more final biomasses of the recombinant strain containing pet-28a( + )-irre under stress were found than in the control strain(harboring the empty vector pet-28a(+)). It can be concluded that the expression of IrrE could enhance the tolerance of E. coli to stress. Key words:irre;escherichia coli;heterologous expression;global transcription;tolerance 采 用 微 生 物 细 胞 工 厂 生 产 各 种 化 学 品 的 过 程 中, 有 机 化 学 品 产 物 或 有 害 的 环 境 ( 高 温 和 低 温 极 端 ph 渗 透 压 营 养 饥 饿 有 害 的 底 物 有 毒 的 污 染 物 高 浓 度 的 代 谢 产 物 或 者 副 产 物 等 ) 往 往 会 对 微 生 物 细 胞 或 胞 内 酶 产 生 严 重 的 毒 害 效 应, 从 而 导 致 细 胞 死 亡 或 酶 催 化 剂 失 活, 进 而 严 重 影 响 生 物 催 化 转 化 过 程 的 生 产 效 能. 因 此, 越 来 越 多 的 研 究 者 开 始 关 注 如 何 获 得 满 足 各 种 工 业 应 用 属 性 的 微 生 物 菌 种. 与 自 然 分 离 的 方 法 相 比, 利 用 现 代 分 子 生 物 学 技 术 对 微 生 物 进 行 遗 传 改 造 是 提 高 其 环 境 耐 受 性 的 更 为 有 效 方 法 [1]. 近 年 来, 单 个 外 源 与 抗 逆 性 相 关 基 因 的 异 源 表 达 已 成 为 提 高 宿 主 微 生 物 耐 受 性 的 重 要 途 径 [2 3]. 但 生 物 的 代 谢 途 径 呈 网 络 体 系, 细 胞 表 型 与 基 因 之 间 并 非 简 单 的 线 性 对 应 关 系, 细 胞 的 耐 受 性 往 往 由 多 个 基 因 收 稿 日 期 :2014 04 25; 修 回 日 期 :2014 05 27 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 (21306138); 天 津 市 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 (13JCYBJC20600) 作 者 简 介 : 骆 健 美 (1978 ), 女, 湖 南 人, 教 授,luojianmei@tust.edu.cn.
2015 年 4 月 骆 健 美, 等 :IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 的 构 建 和 性 能 分 析 7 共 同 控 制. 因 此, 单 个 或 几 个 基 因 的 改 造 和 修 饰 对 于 目 标 表 型 整 体 水 平 上 的 提 高 表 现 出 一 定 的 局 限 性 [4 5] [6].2006 年, 美 国 麻 省 理 工 学 院 的 Alper 等 提 出 了 全 局 转 录 机 制 工 程 ( 也 称 全 转 录 工 程,global transcription machinery engineering,gtme) 的 概 念, 该 技 术 通 过 基 因 工 程 方 法 改 造 全 局 转 录 调 控 因 子 使 得 整 个 转 录 调 控 过 程 发 生 变 化, 是 一 种 在 整 体 水 平 上 改 变 细 胞 基 因 组 转 录, 获 得 有 益 细 胞 表 型 的 全 新 的 定 向 进 化 方 法. IrrE 是 来 源 于 耐 辐 射 异 常 球 菌 (Deinococcus radiodurans)r1 的 一 个 全 局 转 录 因 子.2010 年,Ying [7] 等 将 耐 辐 射 异 常 球 菌 中 的 irre 基 因 在 运 动 发 酵 单 胞 菌 (Zymomonas mobilis) 异 源 表 达, 有 效 地 提 高 了 微 生 物 对 乙 醇 酸 渗 透 压 和 热 冲 击 等 多 重 压 力 的 耐 受 性, 使 得 菌 种 在 发 酵 过 程 高 醇 和 高 酸 的 压 力 下 仍 然 保 持 旺 盛 的 生 长 和 代 谢 活 力, 乙 醇 产 量 达 到 14.59,g/L, 比 改 造 前 菌 株 的 生 产 能 力 提 高 了 66.7%. 同 年, 高 加 [8] 旺 等 利 用 穿 梭 质 粒 pradz3 将 irre 转 入 枯 草 芽 孢 杆 菌 中 进 行 稳 定 表 达. 对 数 期 和 稳 定 期 内 重 组 菌 对 H 2 O 2 氧 化 压 力 的 耐 受 能 力 分 别 提 高 了 10% 和 7%, 紫 外 线 辐 照 下 的 存 活 率 提 高 2 倍 左 右. 这 些 结 果 表 明, IrrE 作 为 一 个 全 局 转 录 因 子 在 微 生 物 耐 受 性 表 型 的 定 向 进 化 中 表 现 出 广 泛 的 应 用 潜 力. 本 文 利 用 pet-28a(+) 质 粒 将 来 源 于 耐 辐 射 异 常 球 菌 (D.,radiodurans)R1 的 irre 基 因 在 大 肠 杆 菌 (Escherichia coli)bl21(de3) 中 进 行 异 源 表 达, 通 过 调 整 IPTG 浓 度 和 诱 导 温 度 等 参 数 对 诱 导 条 件 进 行 优 化. 考 察 了 IrrE 异 源 表 达 对 大 肠 杆 菌 生 长 性 能 及 其 对 各 种 条 件 耐 受 能 力 的 影 响. 该 工 作 为 深 入 研 究 全 局 转 录 因 子 IrrE 在 微 生 物 耐 受 性 表 型 定 向 进 化 中 的 作 用 奠 定 了 基 础. 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 1.1.1 菌 种 和 质 粒 大 肠 杆 菌 (Escherichia coli)bl21(de3) 由 本 研 究 室 保 存 ; 耐 辐 射 异 常 球 菌 (Deinococcus radiodurans)r1 购 买 自 普 通 微 生 物 菌 种 保 藏 中 心. 质 粒 pet-28a(+) 由 本 研 究 室 保 存. 1.1.2 主 要 试 剂 和 工 具 酶 限 制 性 内 切 酶 NcoI EcoRI,Takara 公 司 ;HiFi DNA Polymerase;T4 连 接 酶,Promega 公 司 ; 卡 那 霉 素 IPTG, 生 工 生 物 工 程 ( 上 海 ) 股 份 有 限 公 司. 蛋 白 电 泳 主 要 溶 液 蛋 白 上 样 缓 冲 液 等 均 按 Takara 公 司 商 品 说 明 书 配 制. SanPrep 柱 式 PCR 产 物 纯 化 试 剂 盒, 生 工 生 物 工 程 ( 上 海 ) 股 份 有 限 公 司 ;Easy Pure plasmid Miniprep Kit,TransGen Biotech; 柱 式 DNA 胶 回 收 试 剂 盒, 北 京 天 恩 泽 基 因 科 技 有 限 公 司 ;Ni-Agarose His 标 签 蛋 白 纯 化 试 剂 盒 ( 可 溶 型 蛋 白 ), 康 为 世 纪 公 司. 1.1.3 培 养 基 LB(Luria-Bertani) 培 养 基 (g/l): 胰 蛋 白 胨 10 酵 母 浸 出 粉 5 NaCl 5,pH 7.0. LA 培 养 基 (g/l): 胰 蛋 白 胨 10 酵 母 浸 出 粉 5 NaCl 5 琼 脂 粉 20,pH 7.0~7.2. 1.2 方 法 1.2.1 IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 的 构 建 从 NCBI 中 获 得 irre 基 因 的 序 列 信 息, 由 Primer 5 软 件 设 计 引 物 P1:TGCCATGGAAATGCCCAGTG CCAACGTC 和 P2:TCGAATTCCTGTGCAGCGTCC TGCGG( 下 划 线 部 分 分 别 为 NcoI 和 EcoRI 的 酶 切 位 点 ). 以 耐 辐 射 异 常 球 菌 R1 总 DNA 为 模 板, 使 用 HiFi DNA Polymerase 酶 进 行 PCR( 扩 增 条 件 :94, 预 变 性 5,min,94, 变 性 30,s,63, 退 火 30,s,72, 延 伸 1,min,30 个 循 环,72, 延 伸 10,min). 扩 增 得 到 的 irre 用 NcoI 和 EcoRI 双 酶 切 后 插 入 pet-28a(+) 的 NcoI 和 EcoRI 位 点 之 间, 采 用 热 激 法 转 入 大 肠 杆 菌 BL21, 通 过 菌 液 PCR( 菌 液 扩 增 条 件 :94, 预 变 性 10,min,94, 变 性 30,s,55, 退 火 30,s,72, 延 伸 1,min,30 个 循 环,72, 延 伸 10,min) 和 测 序 对 IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 进 行 筛 选 和 鉴 定. 1.2.2 IrrE 在 大 肠 杆 菌 中 的 表 达 条 件 的 优 化 将 重 组 菌 E. coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-irrE 和 含 有 空 质 粒 的 E.,coli BL21(DE3)/pET-28a(+)( 对 照 菌 株 ) 分 别 接 种 于 50,mL 含 有 卡 那 霉 素 (50,µg/mL) 的 LB 液 体 培 养 基 中,37, 180,r/min 振 荡 过 夜 培 养. 以 1% 接 种 量 接 入 50,mL 含 有 卡 那 霉 素 (50,µg/mL) 的 LB 培 养 液 中,37, 180,r/min 培 养 至 A 600 约 为 0.6, 加 入 不 同 终 浓 度 的 IPTG, 在 不 同 温 度 下 诱 导 6,h,6,000,r/min 离 心 5,min 收 集 适 量 菌 体, 加 入 蛋 白 上 样 缓 冲 液, 沸 水 浴 5,min,10,000,r/min 离 心 5,min 后 取 上 清 液, 进 行 SDS-PAGE 电 泳. 1.2.3 IrrE 表 达 对 大 肠 杆 菌 生 长 特 性 的 影 响 挑 取 IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 和 含 有 空 质 粒 的 E.,coli
8 天 津 科 技 大 学 学 报 第 30 卷 第 2 期 中,37, 180,r/min 振 荡 过 夜 培 养, 将 两 个 菌 的 培 养 液 A 600 调 为 相 同, 然 后 以 0.5% 接 种 量 转 接 到 新 鲜 的 含 有 2,mmol/L IPTG 50,µg/mL 卡 那 霉 素 的 LB 液 体 培 养 基 中,37, 180,r/min 振 荡 培 养, 每 间 隔 2,h 取 样 测 定 A 600, 绘 制 生 长 曲 线. 1.2.4 IrrE 表 达 对 大 肠 杆 菌 压 力 耐 受 能 力 的 影 响 将 IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 和 含 有 空 质 粒 的 E.,coli 中,37, 180,r/min 振 荡 过 夜 培 养. 以 1% 接 种 量 接 入 50,mL 含 有 卡 那 霉 素 (50,µg/mL) 的 LB 液 体 培 养 基 中,37, 180,r/min 培 养 至 A 600 约 为 0.6, 此 时, 加 入 终 浓 度 为 2,mmol/L 的 IPTG,37, 下 诱 导 培 养 6,h. 取 1,mL 培 养 液,6,000,r/min 离 心 10,min 收 集 菌 体, 将 两 个 菌 的 菌 体 质 量 调 为 相 同 后 分 别 转 接 到 50,mL 含 有 不 同 压 力 冲 击 条 件 (3,mol/L 山 梨 醇 极 端 ph 2 或 12 体 积 分 数 10% 甲 醇 体 积 分 数 12% 乙 醇 体 积 分 数 1%H 2 O 2 ) 和 卡 那 霉 素 (50,µg/mL) 的 LB 培 养 基 中 冲 击 30,min. 冲 击 后 的 培 养 液 采 用 10 倍 逐 级 稀 释 法 在 含 卡 那 霉 素 (50,µg/mL) 的 LA 平 板 上 进 行 涂 布,37, 培 养 16,h 后 观 察 不 同 稀 释 度 下 平 板 上 的 菌 落 数 量, 按 照 式 (1) 计 算 存 活 率. 压 力 下 的 菌 落 数 存 活 率 = 100% (1) 正 常 条 件 下 的 菌 落 数 挑 取 IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 和 含 有 空 质 粒 的 E.,coli 中,37, 180,r/min 振 荡 过 夜 培 养, 将 两 个 菌 的 培 养 液 A 600 值 调 为 相 同, 以 0.5% 接 种 量 分 别 转 接 到 新 鲜 的 含 有 2,mmol/L IPTG 50,µg/mL 卡 那 霉 素 的 LB 液 体 培 养 基 中, 向 培 养 基 中 分 别 加 入 终 浓 度 为 1,mol/L 的 山 梨 醇 溶 液 4% 乙 醇 和 5% 甲 醇 继 续 培 养,37, 180,r/min 振 荡 培 养, 每 间 隔 2,h 取 样 测 定 A 600 值, 绘 制 生 长 曲 线, 考 察 不 同 压 力 冲 击 条 件 下 野 生 型 IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 的 生 长 能 力. 2 结 果 与 讨 论 2.1 IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 的 构 建 以 pet-28a(+) 载 体 上 的 通 用 引 物 T7/T7ter 进 行 菌 液 PCR 验 证, 筛 选 阳 性 克 隆, 结 果 如 图 1 所 示. 由 图 1 可 知 : 电 泳 条 带 约 1,200,bp, 与 预 计 大 小 相 符. 将 该 阳 性 克 隆 中 的 质 粒 重 提 后 进 行 测 序, 测 得 的 序 列 信 息 与 GenBank( 登 录 号 AE000513) 中 发 表 的 耐 辐 射 异 常 球 菌 (Deinococcus radiodurans)r1 来 源 的 irre 基 因 (DR0167) [8] 进 行 比 对, 结 果 显 示 具 有 99% 同 源 性, 说 明 IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 构 建 成 功. M. 250 bp DNA Ladder Marker;1. irre 图 1 E.,coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-irrE 的 菌 液 PCR 结 果 Fig. 1 PCR products of E.,coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-irrE 2.2 IrrE 在 大 肠 杆 菌 中 的 表 达 条 件 的 优 化 将 含 有 重 组 质 粒 pet-28a(+)-irre 的 E.,coli BL21(DE3) 菌 株 在 不 同 的 条 件 下 进 行 诱 导 培 养, 收 集 细 胞, 制 备 蛋 白 样 品. 利 用 SDS-PAGE 检 测 目 的 蛋 白 的 表 达 情 况, 结 果 如 图 2 所 示. M. 低 分 子 质 量 蛋 白 MarkerⅡ;1. E.,coli BL21(DE3)/pET-28a(+) 可 溶 性 蛋 白 ;2 6. 不 同 诱 导 条 件 下 E.,coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-irrE 可 溶 性 蛋 白 ( 未 诱 导 ;1,mmol/L IPTG,37, ;2,mmol/L IPTG,25, ; 1,mmol/L IPTG,25, ;2,mmol/L IPTG,37, ) 图 2 Fig. 2 E.,coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-irrE 和 E.,coli BL21 (DE3)/pET-28a(+) 的 蛋 白 电 泳 图 The SDS-PAGE of E.,coli BL21(DE3)/pET-28a(+)- irre and E.,coli BL21(DE3)/pET-28a(+) 由 图 2 可 知 : 不 同 浓 度 的 IPTG 均 能 够 诱 导 目 的 蛋 白 的 表 达, 当 IPTG 浓 度 达 到 2,mmol/L,37, 培 养 6,h 时, 目 的 蛋 白 的 可 溶 性 表 达 最 为 明 显. 因 此, 确 定 IrrE 蛋 白 的 最 佳 诱 导 条 件 为 IPTG 终 浓 度 2,mmol/L 诱 导 温 度 37, 诱 导 时 间 6,h. 2.3 IrrE 表 达 对 大 肠 杆 菌 生 长 特 性 的 影 响 在 不 添 加 压 力 的 培 养 基 中 IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 和 对 照 菌 的 生 长 曲 线 如 图 3 所 示. 在 不 添 加 压 力 的 培 养 基 中, 野 生 型 IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 和 对 照 菌 株 在 8,h 左 右 进 入 对 数 期,14,h 时 开 始 进 入 稳 定 期. 两 个 菌 株
2015 年 4 月 骆 健 美, 等 :IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 的 构 建 和 性 能 分 析 9 的 生 长 阶 段 的 划 分 情 况 基 本 一 致, 但 是 IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 的 生 长 速 率 和 最 终 生 物 量 均 高 于 对 照 菌 株. 这 说 明 IrrE 的 表 达 能 够 提 高 大 肠 杆 菌 的 生 长 特 性. 件 下 的 生 长 曲 线 如 图 5 所 示. 在 4% 乙 醇 压 力 冲 击 条 件 下 IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 和 对 照 菌 株 的 适 应 期 约 为 10,h, 而 在 5% 甲 醇 和 1,mol/L 山 梨 醇 的 压 力 冲 击 条 件 下, 两 个 菌 株 的 适 应 期 为 8,h, 表 现 出 更 好 的 适 应 能 力.3 种 压 力 冲 击 条 件 下,IrrE 重 组 菌 株 的 生 长 速 率 和 最 终 生 物 量 均 明 显 高 于 对 照 菌 株. 其 中, 在 1mol/L 山 梨 醇 条 件 下,IrrE 重 组 菌 株 进 入 稳 定 期 后 的 A 600 达 到 1.70 左 右, 比 对 照 菌 株 提 高 了 21%. 这 说 明 IrrE 的 表 达 能 够 有 效 提 高 大 肠 杆 菌 对 有 机 溶 剂 和 渗 透 压 这 两 种 压 力 的 耐 受 性. 图 3 IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 和 对 照 菌 的 生 长 曲 线 Fig. 3 Growth curves of recombinant strain E.,coli and the control strain E. coli 2.4 IrrE 表 达 对 大 肠 杆 菌 压 力 耐 受 能 力 的 影 响 2.4.1 IrrE 表 达 对 大 肠 杆 菌 压 力 冲 击 条 件 下 存 活 情 况 的 影 响 各 种 压 力 冲 击 下 IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 和 对 照 菌 的 存 活 情 况 如 图 4 所 示.IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 在 1% H 2 O 2 极 端 ph 12% 乙 醇 这 3 种 压 力 冲 击 下 的 存 活 率 差 别 不 大, 在 10% 左 右 波 动, 但 均 高 于 对 照 菌 株. 在 10% 甲 醇 和 3,mol/L 山 梨 醇 的 压 力 冲 击 下,IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 存 活 率 分 别 为 37.5% 和 44.9%, 比 对 照 菌 分 别 提 高 了 5% 和 10% 左 右. 以 上 结 果 说 明 IrrE 的 表 达 能 够 不 同 程 度 地 提 高 大 肠 杆 菌 在 压 力 冲 击 下 的 存 活 能 力. (a) 4% 乙 醇 (b) 5% 甲 醇 图 4 各 种 压 力 冲 击 下 IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 和 对 照 菌 的 存 活 情 况 Fig. 4 Cell viability of recombinant strain E.,coli and the control strain E.,coli under various kinds of stress shock 2.4.2 IrrE 表 达 对 大 肠 杆 菌 压 力 冲 击 条 件 下 生 长 情 况 的 影 响 IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 和 对 照 菌 在 不 同 压 力 冲 击 条 图 5 Fig. 5 (c) 1,mol/L 山 梨 醇 IrrE 重 组 大 肠 杆 菌 和 对 照 菌 在 不 同 压 力 冲 击 下 的 生 长 曲 线 Growth curves of recombinant strain E.,coli and the control strain E.,coli under various kinds of stress
10 天 津 科 技 大 学 学 报 第 30 卷 第 2 期, 3 结 语 本 文 将 来 源 于 耐 辐 射 异 常 球 菌 (Deinococcus radiodurans)r1 的 irre 基 因 在 模 式 微 生 物 大 肠 杆 菌 (E.,coli) 中 进 行 异 源 表 达, 分 析 了 IrrE 表 达 对 大 肠 杆 菌 不 同 压 力 耐 受 能 力 的 影 响. 结 果 表 明 IrrE 能 够 不 同 程 度 地 提 高 大 肠 杆 菌 在 3,mol/L 山 梨 醇 ph=2 ph=12 10% 甲 醇 12% 乙 醇 和 1%H 2 O 2 压 力 冲 击 下 的 存 活 能 力, 同 时 改 善 大 肠 杆 菌 在 4% 乙 醇 5% 甲 醇 及 1,mol/L 山 梨 醇 压 力 下 的 生 长 情 况. 这 些 结 果 表 明, IrrE 在 微 生 物 复 杂 表 型 的 定 向 进 化 方 面 表 现 出 良 好 的 效 果. 参 考 文 献 : [1] Nicolaou S A,Gaida S M,Papoutsakis E T. A comparative view of metabolite and substrate stress and tolerance in microbial bioprocessing:from biofuels and chemicals,to biocatalysis and bioremediation[j]. Metabolic Engineering,2010,12(4):307 331. [2] 刘 瑞 杰, 陈 婷, 曹 军 卫. 渗 透 压 调 节 基 因 proba 的 融 合 表 达 对 大 肠 杆 菌 耐 高 渗 胁 迫 能 力 的 影 响 [J]. 微 生 物 学 报,2005,45(1):23 26. [3] Mahin A A,Sugimoto S,Higashi C,et al. Improvement of multiple-stress tolerance and lactic acid produc- tion in Lactococcus lactis NZ9000 under conditions of thermal stress by heterologous expression of Escherichia coli dnak[j]. Applied and Environmental Microbiology,2010,76(13):4277 4285. [4] Alper H,Miyaoku K,Stephanopoulos G,. Construction of lycopene-overproducing E. coli strains by combining systematic and combinatorial gene knockout targets[j]. Nature Biotechnology,2005,23(5):612 616. [5] Alper H,Jin Y S,Moxley J F,et al. Identifying gene targets for the metabolic engineering of lycopene biosynthesis in Escherichia coli[j]. Metabolic Engineering, 2005,7(3):155 164. [6] Alper H,Stephanopoulos G,. Global transcription machinery engineering:a new approach for improving cellular phenotype[j]. Metabolic Engineering,2007,9(3): 258 267. [7] Ying Z,Ma R Q,Zhao Z L,et al. irre,an exogenous gene from Deinococcus radiodurans,improves the growth of and ethanol production by a Zymomonas mobilis strain under ethanol and acid stresses[j]. Journal of Microbiology and Biotechnology,2010,20(7):1156 1162. [8] 高 家 旺, 谢 水 波, 唐 振 平, 等. 奇 球 菌 ppri 基 因 增 强 枯 草 芽 孢 杆 菌 细 胞 抗 性 的 研 究 [J]. 南 华 大 学 学 报 : 自 然 科 学 版,2010,24(1):78 82. 责 任 编 辑 : 周 建 军