2015年臺灣國際科學展覽會

2015 年 臺 灣 國 際 科 學 展 覽 會 優 勝 作 品 專 輯 作 品 編 號 080003 參 展 科 別 生 物 化 學 作 品 名 稱 CYP11A1 導 致 非 類 固 醇 生 成 細 胞 的 粒 線 體 形 變 CYP11A1 Changes Mitochondrial Morphology in Nonsteroidogenic Cells 得 獎 獎 項 大 會 獎 : 一 等 獎 美 國 ISEF 正 選 代 表 : 美 國 第 66 屆 國 際 科 技 展 覽 會 英 特 爾 傑 出 青 年 女 性 科 學 家 獎 就 讀 學 校 臺 北 市 立 第 一 女 子 高 級 中 學 指 導 教 師 鍾 邦 柱 許 一 懿 作 者 姓 名 李 瓖 芸 關 鍵 字 CYP11A1 粒 線 體 形 變

作 者 簡 介 我 是 李 瓖 芸, 就 讀 北 一 女 中 數 理 資 優 班 高 三, 從 高 一 寒 假 開 始 在 中 研 院 分 生 所 做 專 題 研 究 在 這 一 年 半 的 研 究 過 程 中, 我 學 習 到 各 種 分 生 實 驗 技 術, 也 培 養 了 科 學 家 的 邏 輯 思 維 與 研 究 精 神 泡 實 驗 室 的 生 活 雖 然 有 時 很 辛 苦, 但 更 多 時 候 是 有 趣 的, 當 終 於 有 成 果 時, 那 種 成 就 感 也 令 人 興 奮 一 路 走 來, 真 的 很 感 謝 鍾 老 師 簡 瑜 學 姐 和 一 懿 老 師 的 支 持 與 幫 助! i

摘 要 一 般 認 為 粒 線 體 形 變 與 神 經 細 胞 的 細 胞 凋 亡 有 關, 但 其 實 粒 線 體 形 變 也 發 生 在 類 固 醇 生 成 細 胞, 如 卵 巢 與 腎 上 腺 皮 質 的 分 化 過 程 中, 且 伴 隨 著 類 固 醇 製 造 酵 素 CYP11A1 的 大 量 表 現 因 此, 我 們 提 出 以 下 的 假 說 : 第 一,CYP11A1 會 使 粒 線 體 發 生 形 變 ; 第 二, 粒 線 體 形 變 參 與 類 固 醇 賀 爾 蒙 的 製 造 ; 第 三, 粒 線 體 形 變 能 導 致 細 胞 某 種 程 度 上 的 分 化 : 由 不 適 合 製 造 類 固 醇 轉 變 為 適 合, 並 降 低 其 代 謝 率 我 們 觀 察 CYP11A1 內 生 與 否 的 細 胞 株 的 粒 線 體 外 形 及 其 內 褶 膜, 發 現 內 生 CYP11A1 的 細 胞 具 有 球 形 粒 線 體 與 拱 狀 內 褶 膜 接 著 我 以 CYP11A1 表 現 質 體 轉 染 COS-1 細 胞, 觀 察 其 粒 線 體 並 測 量 其 ATP 產 率, 證 實 了 外 送 CYP11A1 能 使 粒 線 體 發 生 形 變, 同 時 改 變 細 胞 的 代 謝 率 這 個 發 現 對 粒 線 體 形 變 的 研 究 具 有 突 破 性 的 影 響 1

Abstract It has been known that the change of mitochondrial morphology is related to apoptosis in some cells such as neuron. However, previous research shows that mitochondrial shapes are changed and that cristal structures are remodeled during the differentiation of steroidogenic cells in ovary and adrenal cortex, accompanied by abundant expression of steroidogenic enzyme, CYP11A1. Therefore, we propose the following hypotheses: 1. CYP11A1 changes mitochondrial morphology (in both steroidogenic and nonsteroidogenic cells). 2. The changes of mitochondrial morphology play a part in the production of steroid hormone. 3. The changes of mitochondrial morphology can, to some extent, lead to cell differentiation. Nonsteroidogenic cells become competent to produce steroid and have lower metabolic rate when being transfected with exogenous CYP11A1. We found that Y1 cells with endogenous CYP11A1 contain spherical mitochondria with arched cristae, while cells without endogenous CYP11A1 such as NIH-3T3 and COS-1 have elongated mitochondria with lamellar cristae. By transfecting COS-1 cells with CYP11A1-expressing plasmids, observing mitochondrial morphology, and measuring ATP production rate, I confirmed that CYP11A1 changes mitochondrial morphology in nonsteroidogenic cells and regulates the ATP synthesis. This discovery is an important breakthrough and may have a profound influence on the research of mitochondrial morphology. 2

CYP11A1 導 致 非 類 固 醇 生 成 細 胞 的 粒 線 體 形 變 壹 前 言 一 粒 線 體 形 變 粒 線 體 (mitochondria) 是 細 胞 的 能 量 工 廠, 負 責 製 造 ATP 粒 線 體 是 動 態 的 胞 器, 藉 由 不 斷 地 融 合 (fusion; 由 MFN1 MFN2 OPA1 等 調 控 ) 和 分 裂 (fission; 由 FIS1 DRP1 等 調 控 ) 控 制 其 形 狀 大 小 和 數 量, 其 他 相 關 調 控 因 子 如 圖 1 在 一 般 狀 態 下, 融 合 和 分 裂 的 速 度 會 保 持 平 衡, 使 粒 線 體 維 持 長 條 形 (elongated; 圖 2) 但 在 某 些 細 胞 中, 粒 線 體 形 狀 可 能 發 生 轉 變 分 裂 的 速 度 若 比 融 合 快, 則 粒 線 體 的 長 度 會 縮 短 而 呈 現 球 形 (spherical; 圖 3.4) 本 研 究 中, 定 義 粒 線 體 長 寬 比 大 於 3:1 者 為 長 條 形 小 於 2:1 者 為 球 形, 而 介 於 兩 者 之 間 為 橢 圓 形 (oval) 圖 1 粒 線 體 融 合 及 分 裂 的 調 控 因 子 ( 取 自 EMBO Rep. 2010 Sep;11(9):678-84.) 圖 2 長 條 形 粒 線 體 與 板 層 狀 內 褶 膜 圖 3 球 形 粒 線 體 與 管 囊 狀 內 褶 膜 圖 4 拱 形 內 褶 膜 3

內 褶 膜 (mitochondrial cristae) 是 粒 線 體 內 膜 向 基 質 內 褶 形 成 的 一 種 結 構 在 不 同 種 類 的 細 胞 中, 內 褶 膜 的 數 目 形 態 和 排 列 方 式 可 能 有 較 大 差 別, 其 中 主 要 有 兩 種 形 態, 分 別 稱 為 板 層 狀 (lamellar; 圖 2 及 圖 5 左 ) 與 管 囊 狀 (tubular-vesicular; 圖 3 及 圖 5 右 ) 另 外 本 研 究 中 亦 有 觀 察 到 拱 形 (arched; 圖 4) 內 褶 膜 圖 5 粒 線 體 內 褶 膜 的 立 體 結 構 ( 取 自 網 路 :http://www.netterimages.com/image/12983.htm) 關 於 粒 線 體 形 變 在 生 理 病 理 上 意 義 的 研 究 至 今 發 展 約 莫 十 年 已 有 許 多 研 究 發 現, 粒 線 體 的 功 能 不 再 只 局 限 於 產 生 ATP 提 供 能 量 等 細 胞 代 謝 的 範 疇 ; 此 胞 器 的 形 狀 大 小 與 數 量 的 改 變 對 於 細 胞 凋 亡 自 噬 等 現 象 亦 有 調 控 作 用 亦 有 論 文 指 出, 代 謝 極 為 活 躍 的 神 經 元 高 度 依 賴 粒 線 體 的 融 合 裂 變 與 傳 輸, 其 粒 線 體 的 形 變 現 象 與 神 經 退 化 性 疾 病 有 關, 例 如 帕 金 氏 症 與 阿 茲 海 默 症 皆 攸 關 於 粒 線 體 的 形 變, 若 能 適 當 調 節 其 粒 線 體 的 融 合 與 分 裂 作 用 便 可 以 改 善 其 症 狀 但 粒 線 體 形 變 對 於 細 胞 發 育 分 化 及 類 固 醇 荷 爾 蒙 的 關 係 的 研 究 甚 少, 因 此 我 們 將 深 入 探 討 其 重 要 性 二 CYP11A1 CYP11A1(P450 cholesterol side-chain cleavage enzyme) 是 一 種 位 於 粒 線 體 內 膜 的 酵 素, 負 責 催 化 膽 固 醇 (cholesterol) 轉 換 為 孕 烯 醇 酮 (pregnenolone), 是 類 固 醇 荷 爾 蒙 生 成 代 謝 過 程 的 第 一 步 ( 詳 見 第 三 點 類 固 醇 荷 爾 蒙 ) CYP11A1 主 要 表 現 在 腎 上 腺 皮 質 層 與 卵 巢 中 的 黃 體 及 卵 囊 膜 細 胞 還 有 睪 丸 的 萊 氏 細 胞 4

圖 6 與 膽 固 醇 結 合 的 人 類 CYP11A1 ( 取 自 維 基 百 科 :http://en.wikipedia.org/wiki/p450_scc) 圖 7 CYP11A1 催 化 的 反 應 ( 取 自 維 基 百 科 :http://en.wikipedia.org/wiki/p450_scc) CYP11A1 作 用 時 需 要 來 自 電 子 傳 遞 鏈 的 電 子 ( 圖 7), 由 鐵 氧 還 蛋 白 (adrenodoxin) 與 鐵 氧 還 蛋 白 還 原 酶 (adrenodoxin reductase) 從 NADPH 傳 遞 給 CYP11A1, 因 此 細 胞 必 須 同 時 具 有 這 三 種 蛋 白 質 的 表 現,CYP11A1 才 具 有 作 用 活 性 我 們 從 Dr. Walter L. Miller 的 實 驗 室 取 得 F2 及 VE 質 體 :F2 質 體 帶 有 CYP11A1 鐵 氧 還 蛋 白 與 鐵 氧 還 蛋 白 還 原 酶, 並 以 實 驗 證 實 具 有 最 大 活 性 的 排 列 順 序 排 列 ( 圖 8) VE 質 體 則 是 將 F2 質 體 上 的 CYP11A1 突 變 掉 纈 胺 酸 成 為 穀 胺 酸 而 來, 其 CYP11A1 不 具 有 活 性, 可 作 為 F2 的 對 照 組 圖 8 F2 及 VE 質 體 ( 資 料 來 源 : 參 考 文 獻 ( 六 )) 5

三 類 固 醇 荷 爾 蒙 類 固 醇 荷 爾 蒙 是 人 體 生 理 所 需 的 微 量 激 素, 可 分 為 雄 激 素 (androgens) 雌 激 素 (estrogens) 孕 激 素 (progestogens) 皮 質 類 固 醇 (corticosteroids) 等 四 類, 由 膽 固 醇 (cholesterol) 經 不 同 酵 素 不 同 途 徑 製 造 而 來 ( 圖 9), 由 內 分 泌 器 官 如 腎 上 腺 (adrenal gland) 及 性 腺 (gonads) 分 泌, 再 經 由 血 液 傳 送 全 身, 調 節 體 內 的 糖 分 鹽 分 水 分 礦 物 質 等 重 要 元 素 及 許 多 生 理 反 應 其 分 泌 量 受 下 視 丘 腦 下 垂 體 控 制, 過 多 或 過 少 都 將 引 起 生 物 體 的 病 症 圖 9 人 類 類 固 醇 賀 爾 蒙 製 造 途 徑 ( 取 自 維 基 百 科 :http://en.wikipedia.org/wiki/steroid) 6

貳 研 究 動 機 目 前 關 於 粒 線 體 形 變 的 研 究 大 多 是 以 神 經 心 臟 和 肌 肉 細 胞 為 材 料, 發 現 粒 線 體 形 變 常 意 味 著 細 胞 即 將 凋 亡, 因 而 衍 生 相 關 疾 病 之 前 本 實 驗 室 發 現 ( 參 考 文 獻 ( 二 )) 在 小 鼠 懷 孕 期 間 卵 巢 黃 體 的 成 熟 過 程 中 伴 隨 著 粒 線 體 形 變 ( 由 濾 泡 顆 粒 細 胞 的 長 條 形 板 層 狀 內 褶 膜 ( 圖 10 右 上 ), 變 為 黃 體 細 胞 的 球 形 管 囊 狀 內 褶 膜 ( 圖 10 左 上 )), 而 且 在 分 化 過 程 中, 參 與 黃 體 製 造 助 孕 酮 過 程 的 一 個 酵 素 CYP11A1 表 現 量 也 會 增 加 ( 圖 11), 而 且 它 不 正 常 的 表 現 量 也 會 對 粒 線 體 形 變 產 生 影 響 : 在 CYP11A1 過 量 表 現 的 基 因 轉 殖 小 鼠, 濾 泡 細 胞 分 化 為 黃 體 細 胞 時, 粒 線 體 形 變 不 完 全, 呈 現 長 條 形 的 外 形 與 管 囊 狀 內 褶 膜 ( 圖 10 左 下 ),CYP11A1 下 游 產 物 助 孕 酮 的 產 量 也 減 少 圖 10 小 鼠 懷 孕 期 間 黃 體 (LC) 與 顆 粒 細 胞 (GC) 的 粒 線 體 圖 11 小 鼠 卵 巢 IHC 染 色 圖 圖 中 顏 色 越 深 處 表 現 越 大 量 的 CYP11A1 ( 取 自 Biology of reproduction, 89(4), 91. 2013) 這 引 發 了 我 們 好 奇, 粒 線 體 的 形 變 是 不 是 由 CYP11A1 調 控 的? 如 果 讓 非 類 固 醇 生 成 細 胞 表 現 CYP11A1, 粒 線 體 會 不 會 因 此 形 變? 粒 線 體 形 變 會 不 會 影 響 細 胞 的 代 謝? 7

參 研 究 目 的 一 觀 察 : 比 較 具 備 CYP11A1 表 現 與 否 的 細 胞 株 的 粒 線 體 形 態 二 提 出 假 設 :CYP11A1 是 否 會 使 粒 線 體 發 生 形 變 三 設 計 實 驗 : 轉 染 CYP11A1 表 現 質 體 至 細 胞 中 並 觀 察 是 否 會 使 粒 線 體 發 生 形 變 四 了 解 粒 線 體 形 變 與 細 胞 代 謝 的 關 係 : 測 量 轉 染 前 後 細 胞 的 ATP 產 率 肆 研 究 設 備 與 器 材 一 基 本 器 材 : 微 量 滴 管 吸 量 分 注 器 Tip 實 驗 手 套 實 驗 衣 50 c.c. 離 心 管 15 c.c. 離 心 管 1.5 c.c. 微 量 離 心 管 試 管 架 桌 上 型 離 心 機 去 離 子 蒸 餾 水 (ddh2o) 酒 精 PBS 緩 衝 溶 液 電 子 天 平 恆 溫 水 浴 槽 二 細 胞 培 養 : 10-cm 培 養 皿 玻 璃 滴 管 10c.c. 滴 管 細 胞 培 養 箱 無 菌 操 作 台 水 浴 槽 複 式 顯 微 鏡 DMEM/F12 培 養 液 (DMEM/F12 + P/S + 10% FBS) DMEM 培 養 液 (DMEM + P/S + 10% FBS) Y1 cell NIH-3T3 cell COS1 cell Trypsin-EDTA 液 態 氮 三 製 備 穿 透 式 電 子 顯 微 鏡 樣 本 : 6 well 培 養 皿 Embedding film 4 冷 房 緩 衝 溶 液 (0.1M cacodylate buffer, ph 7.2/ 4% sucrose) 固 定 液 (2.5% glutaraldehyde/ 0.1M cacodylate buffer, ph7.2) 固 定 液 (1% OsO4/ 0.1M cacodylate buffer, ph7.2) 染 色 液 1% uranyl acetate 酒 精 spurr 烘 箱 8

四 製 備 CYP11A1 表 現 質 體 : ( 一 )CYP11A1 基 因 片 段 pegfp-n1 載 體 圖 12 pegfp-n1 載 體 的 基 因 圖 譜 取 自 https://www.addgene.org/18870/ ( 二 ) 聚 合 酶 鏈 鎖 反 應 (PCR):PCR buffer dntp 引 子 PCR 儀 器 ( 三 ) 膠 體 電 泳 :Agarose 50X TAE buffer 錐 形 瓶 微 波 爐 製 膠 模 型 6x DNA Loading Dye 10x Taq buffer 1K DNA Ladder marker 電 泳 槽 EtBr UV 箱 ( 四 ) 限 制 酶 (XhoI EcroRI) 10X digest buffer ( 五 )T4 DNA ligase 10X ligase buffer ( 六 ) 細 菌 轉 型 養 菌 :HIT competent cell LB 培 養 基 LB agar 養 菌 盤 養 菌 管 錐 形 瓶 抗 生 素 Kanamycin 及 Ampicillin 三 角 玻 棒 酒 精 燈 37 暖 房 震 盪 器 ( 七 ) 質 體 純 化 : 高 速 離 心 機 Qiagen kit ( 八 ) 細 胞 轉 染 :Trans-LTI Transfection Reagent Opti-MEM 9

伍 研 究 過 程 與 方 法 一 細 胞 培 養 : ( 一 ) 細 胞 株 種 類 : 1. Y1: 小 鼠 腎 上 腺 皮 質 癌 細 胞, 內 生 CYP11A1 2. COS1: 猴 腎 臟 細 胞, 不 內 生 CYP11A1 3. NIH-3T3: 胚 胎 纖 維 母 細 胞, 不 內 生 CYP11A1 ( 二 ) 培 養 環 境 : 恆 溫 攝 氏 37 度 二 氧 化 碳 濃 度 5% ( 三 ) 培 養 容 器 : 直 徑 10 公 分 培 養 皿 ( 四 ) 配 製 培 養 液 :DMEM/F12 + P/S + 10% FBS( 用 於 Y1) 與 DMEM + P/S + 10% FBS( 用 於 COS-1 NIH-3T3) 1. 將 DMEM/F12 或 DMEM 培 養 液 粉 末 一 包 ddh2o 890mL P/S( 抗 生 素 ) 10mL FBS( 胎 牛 血 清 ) 100 ml 加 入 已 滅 菌 的 燒 杯, 並 置 於 電 磁 加 熱 攪 拌 器 由 磁 攪 拌 子 攪 拌 2. 加 入 NaHCO3(DMEM/F12:2.4g,DMEM:3.7g), 持 續 攪 拌 3. 利 用 酸 鹼 度 計 測 酸 鹼 值, 並 以 鹽 酸 與 氫 氧 化 鈉 調 其 ph 值 至 約 7.2~7.4 4. 利 用 抽 氣 過 濾 套 組 過 濾 培 養 液 10

二 製 備 穿 透 式 電 子 顯 微 鏡 樣 本 : ( 一 ) 種 植 細 胞 : 準 備 12 洞 培 養 皿, 在 每 一 洞 放 置 塑 膠 薄 片 (Aclar embedding film) 細 胞 培 養 數 代 後, 種 植 1x10 5 細 胞 於 培 養 皿 中, 使 細 胞 密 度 達 九 成 以 上 ( 二 ) 去 除 培 養 液 後 以 緩 衝 溶 液 (0.1M cacodylate buffer, ph 7.2/ 4% sucrose/ 0.05% CaCl2) 潤 洗 細 胞 ( 三 ) 以 固 定 液 (2.5% glutaraldehyde/ 0.1M cacodylate buffer, ph7.2) 在 4 固 定 1 小 時 ( 四 ) 在 4 以 緩 衝 溶 液 潤 洗 細 胞 3 次, 每 次 5 分 鐘 ( 五 ) 以 固 定 液 (1% OsO4/ 0.1M cacodylate buffer, ph7.2) 在 4 固 定 1 小 時 ( 六 ) 在 4 以 ddh20 潤 洗 細 胞 3 次, 每 次 5 分 鐘 ( 七 ) 以 染 色 液 1% uranyl acetate 在 4 染 色 1 小 時 ( 八 ) 在 4 以 ddh20 潤 洗 細 胞 3 次, 每 次 5 分 鐘 ( 九 ) 在 室 溫 以 酒 精 脫 水 : 依 序 浸 泡 在 50%(7 分 鐘 ) 70%(7 分 鐘 ) 90%(7 分 鐘 ) 酒 精 各 一 次 及 100% 無 水 酒 精 (5 分 鐘 ) 三 次 ( 十 ) 在 室 溫 以 酒 精 /spurr( 樹 脂 ) 混 合 溶 液 滲 透 細 胞 樣 本 : 依 序 浸 泡 在 酒 精 :spurr=1:1(30 分 鐘 ) 1:2(40 分 鐘 ) 各 一 次 及 純 spurr(1 小 時 ) 三 次 ( 十 一 ) 置 於 70 烘 箱 中 包 埋 20 小 時 11

三 CYP11A1 表 現 質 體 製 備 與 確 認 : ( 一 ) 利 用 聚 合 酶 鏈 鎖 反 應 (PCR) 技 術, 以 設 計 好 的 不 同 引 子 分 別 取 得 表 現 CYP11A1 的 全 長 DNA 片 段, 及 不 包 含 粒 線 體 標 的 序 列 的 CYP11A1 DNA 片 段 引 子 上 包 含 限 制 酶 EcoR1 與 Xho1 能 作 用 的 切 點 序 列 1. 聚 合 酶 鏈 鎖 反 應 : 取 1.5mL 微 量 離 心 管 加 入 下 表 所 列 溶 液 並 混 合 均 勻 將 其 置 於 PCR 儀 器,PCR 反 應 條 件 為 :enzyme activation 95 10 分 鐘 ;95 30 秒 (denature) 55 1 分 鐘 (anneal) 72 1 分 30 秒 (extend) 共 30 個 循 環 ;72 5 分 鐘 4 暫 停 2X PCR buffer 2mM dntp 10μM Forward Primer 10μM Reverse Primer DNA KODFX ddh2o 1X 25μL 10μL 1.5μL 1.5μL 1μL 1μL 10μL 50μL 2. 純 化 PCR 產 物 (PCR purification) : 使 用 QIAquick PCR purification kit 加 入 PCR 產 物 體 積 五 倍 的 PB( 酸 性 試 劑 ), 混 合 均 勻 若 呈 現 橙 色 或 紫 色, 加 10μL 3M 硫 酸 鈉 將 液 體 移 至 離 心 管 中, 並 且 高 速 離 心 一 分 鐘, 將 下 方 離 心 液 倒 出 接 著 加 750μL PE( 酒 精 ), 混 合 均 勻 在 高 速 離 心 一 分 鐘, 將 下 方 離 心 液 倒 出 將 離 心 管 置 於 1.5 ml 微 量 離 心 管 上 方, 並 加 50μL EB( 復 溶 劑 ) 或 去 離 子 純 水, 高 速 離 心 一 分 鐘 3. 測 定 DNA 濃 度 : 樣 品 在 260 nm 及 280 nm 吸 光 值 之 比 較, 以 判 定 DNA 的 純 度 及 濃 度 ( 二 ) 利 用 限 制 酶 EcoRI XhoI 切 割 CYP11A1( 插 入 段 ) 及 pegfp-n1 載 體 DNA: 12

取 1.5mL 微 量 離 心, 加 入 下 表 所 列 溶 液 並 混 合 均 勻 接 著 至 於 37 恆 溫 水 浴 槽 作 用 20 分 鐘 4μg pegfp-n1( 依 照 測 得 濃 度 加 適 當 體 積 ) XhoI 5μL EcoRI 5μL 10X digestion buffer 10μL ddh2o( 依 載 體 溶 液 體 積 調 整, 使 總 體 積 為 100μL) 100μL ( 三 ) 利 用 膠 體 電 泳 分 離 pegfp-n1 載 體 的 大 小 片 段, 僅 保 留 將 與 插 入 段 接 合 的 片 段 再 利 用 QIAquick Gel Extraction 萃 取 DNA ( 四 ) 利 用 接 合 酶 接 合 CYP11A1 與 pegfp-n1 的 DNA 片 段 : 載 體 與 插 入 段 的 莫 耳 數 比 例 為 1:3, 載 體 DNA 總 量 為 100 ng, 並 取 0.6mL 微 量 離 心 管 加 入 下 表 所 列 溶 液 並 混 合 均 勻 置 於 4 反 應 過 夜 此 步 驟 所 得 為 環 狀 的 質 體 DNA pegfp-n1 insert 10X ligation buffer T4 DNA ligase ddh2o 20μL 8.4μL 4μL 2μL 5.6μL 40μL ( 五 ) 利 用 non-heatshock 轉 型 (Transformation) 細 胞, 將 質 體 DNA 引 入 勝 任 細 胞 (competent cell), 以 達 大 量 複 製 DNA 的 目 的 : 在 DNA 混 合 液 中 加 入 卡 納 黴 素 (kanamycin) 以 及 HIT mixture 接 著 將 接 合 溶 液 均 勻 抹 平 在 LB agar plate 上, 置 於 37 烘 箱 培 養 16~18 小 時 以 微 量 滴 管 挑 單 一 菌 落, 在 離 心 管 震 盪 培 養 16~18 小 時 以 小 量 培 養, 接 著 在 錐 形 瓶 中 震 盪 培 養 16~18 小 時 以 大 量 培 養 ( 六 ) 質 體 純 化 (Plasmid DNA midi-preparation): 將 菌 液 倒 入 離 心 瓶 中, 並 使 用 天 平 使 每 一 離 心 瓶 重 量 相 等 以 6000g 離 心 10 分 鐘 後, 倒 掉 上 清 液, 加 13

入 8c.c. RES buffer, 上 下 沖 洗 使 之 混 合 均 勻 加 8c.c. LYS buffer, 緩 緩 上 下 搖 晃 靜 置 5 分 鐘 將 濾 管 架 在 試 管 架 上, 並 以 加 12c.c. EQU buffer 潤 濕 管 壁 加 8c.c. NEV buffer, 慢 慢 上 下 搖 晃 10~15 次, 應 出 現 棉 絮 狀 物 質 把 液 體 倒 入 濾 管, 加 8c.c. Wash buffer, 移 至 50c.c. 離 心 管 上 加 5c.c.ELV buffer 與 3.5mL 異 丙 醇, 震 盪 均 勻, 靜 置 2 分 鐘 將 液 體 倒 入 特 製 過 濾 針 筒 中, 慢 慢 把 液 體 壓 出, 加 2c.c.70% 酒 精, 重 複 3 次 加 0.2c.c. ddh2o, 將 液 體 壓 入 1.5c.c. 離 心 管 測 DNA 濃 度 ( 七 ) 取 一 部 分 質 體 樣 本 再 次 以 限 制 酶 切 割 跑 膠, 以 確 認 製 作 出 的 質 體 是 否 正 確 圖 13 CYP11A1 表 現 質 體 製 備 與 確 認 過 程 示 意 圖 14

四 脂 質 體 轉 染 法 : 轉 染 前 使 細 胞 在 10 cm 培 養 皿 長 到 約 五 至 七 成 滿, 並 更 換 成 不 含 抗 生 素 的 培 養 液 將 下 表 所 列 溶 液 依 序 加 入 1.5 ml 微 量 離 心 管, 輕 輕 用 微 量 滴 管 混 合 均 勻 靜 置 於 室 溫 25 分 鐘 最 後, 將 混 合 液 加 入 COS-1 細 胞 的 培 養 液 中, 輕 輕 搖 晃 混 合 均 勻, 使 其 作 用 隔 夜 後 更 換 回 原 培 養 液 並 再 隔 一 天 才 開 始 做 實 驗 以 讓 細 胞 恢 復 穩 定 Opti-MEM 1.5mL DNA 15μg TransIT-LTI Reagent 45μL 五 施 加 膽 固 醇 : 在 轉 染 F2 及 VE 質 體 的 實 驗 中, 另 區 分 是 否 施 加 膽 固 醇 兩 種 組 別 施 加 膽 固 醇 的 組 別 條 件 為 : 添 加 5μM 20α-hydroxycholesterol, 作 用 4 小 時 此 種 膽 固 醇 不 需 StAR 運 送 到 粒 線 體 內 膜, 可 以 直 接 作 為 CYP11A1 的 受 質, 使 CYP11A1 作 用 產 生 下 游 產 物 孕 烯 醇 酮 (P5) 六 測 量 ATP 產 率 : ( 一 ) 用 Trypsin-EDTA 使 細 胞 自 培 養 皿 上 脫 落, 離 心 3000rpm 5 分 鐘 收 集 細 胞 ( 二 ) 用 細 胞 計 數 盤 數 細 胞, 記 錄 細 胞 密 度 ( 三 ) 取 3x104 細 胞 置 於 1.5c.c. 離 心 管 中, 離 心 3000rpm 5 分 鐘 後 丟 棄 上 清 液 ( 四 ) 加 300μL lysis buffer 於 室 溫 作 用 5 分 鐘, 將 細 胞 裂 解, 釋 放 ATP ( 五 ) 加 300μL diluent buffer 稀 釋 ( 六 ) 離 心 10000rpm 1 分 鐘, 使 細 胞 的 其 他 成 分 沈 澱 ( 七 ) 取 出 上 清 液 置 於 新 的 離 心 管 中, 暫 時 放 在 冰 上 保 存 ( 八 ) 分 別 配 製 10-1~10-6mM 的 ATP 溶 液 作 為 標 準 樣 品 15

( 九 ) 將 實 驗 樣 本 及 標 準 樣 本 裝 入 專 用 的 黑 色 孔 盤 中, 每 孔 50μL ( 十 ) 避 光 取 適 量 luciferase 呈 色 劑 ( 能 與 ATP 結 合 並 呈 色 ), 帶 到 專 用 儀 器 操 作 區 ( 十 一 ) 儀 器 會 自 動 添 加 luciferase 並 記 錄 吸 光 值 ( 十 二 ) 取 得 吸 光 值 資 料 後, 用 excel 根 據 標 準 樣 品 的 吸 光 值 畫 出 標 準 曲 線, 便 能 推 得 實 驗 樣 品 的 ATP 濃 度 16

陸 研 究 結 果 與 討 論 實 驗 一 : 以 穿 透 式 顯 微 鏡 觀 察 內 生 及 不 內 生 CYP11A1 的 粒 線 體 形 態 : 內 生 CYP11A1 的 細 胞 具 有 球 形 粒 線 體 與 拱 形 內 褶 膜, 而 不 內 生 CYP11A1 的 細 胞 具 有 長 條 形 粒 線 體 與 板 層 狀 內 褶 膜 一 電 子 顯 微 鏡 照 片 圖 14 不 同 倍 率 下 Y1 COS1 與 NIH-3T3 細 胞 粒 線 體 形 態 的 比 較 圖 中 可 見 內 生 CYP11A1 的 Y1 細 胞 粒 線 體 呈 球 形 且 內 褶 膜 為 拱 形, 而 不 內 生 CYP11A1 的 COS1 與 NIH-3T3 細 胞 粒 線 體 都 呈 長 條 形 且 內 褶 膜 為 板 層 狀, 如 同 一 般 常 見 的 細 胞 二 結 果 整 理 表 1 不 同 細 胞 株 是 否 內 生 CYP11A1 與 其 粒 線 體 形 態 的 比 較 細 胞 株 種 類 是 否 內 生 CYP11A1 粒 線 體 外 形 粒 線 體 內 膜 形 態 Y1 內 生 且 有 活 性 球 形 拱 形 COS1 不 內 生 長 條 形 板 層 狀 NIH-3T3 不 內 生 長 條 形 板 層 狀 17

實 驗 二 : 製 作 CYP11A1 完 全 表 現 質 體 以 及 缺 乏 粒 線 體 標 的 基 因 序 列 的 CYP11A1 表 現 質 體, 轉 染 至 COS-1 細 胞 後 以 螢 光 顯 微 鏡 及 電 子 顯 微 鏡 觀 察 螢 光 顯 微 鏡 觀 察 發 現 缺 乏 粒 線 體 標 的 序 列 會 使 CYP11A1 散 布 在 整 個 細 胞 質 中, 全 長 基 因 則 能 使 CYP11A1 只 表 現 在 粒 線 體 電 子 顯 微 鏡 觀 察 結 果 顯 示, 外 送 CYP11A1 能 使 COS-1 細 胞 的 長 條 形 粒 線 體 與 板 狀 內 褶 膜 形 變 為 球 形 粒 線 體 與 管 囊 狀 內 褶 膜 一 以 螢 光 顯 微 鏡 觀 察 經 質 體 轉 染 後 的 COS-1 細 胞 : pegfp-n1 所 帶 有 的 綠 螢 光 基 因 能 使 細 胞 轉 譯 出 的 插 入 段 蛋 白 質 (CYP11A1) 發 出 綠 色 螢 光, 因 此 能 以 螢 光 顯 微 鏡 觀 察 CYP11A1 分 布 位 置 轉 染 不 帶 有 插 入 段 的 pegfp-n1 的 COS-1 細 胞 中, 幾 乎 整 顆 細 胞 都 發 出 綠 色 螢 光 ; 轉 染 pegfp-n1-cyp11a1( 全 長 ) 的 COS-1 細 胞 中, 綠 色 螢 光 的 分 布 散 佈 在 細 胞 質, 呈 現 點 狀 顆 粒 狀, 可 以 初 步 推 斷 CYP11A1 只 分 布 在 粒 線 體 中 ; 轉 染 pegfp-n1-cyp11a1( 缺 乏 粒 線 體 標 的 序 列 ) 的 COS-1 細 胞 中, 綠 色 螢 光 均 勻 分 布 於 細 胞 質 中 另 外, 轉 染 缺 乏 粒 線 體 標 的 序 列 Cyp11a1 的 細 胞 很 容 易 死 亡, 因 此 沒 有 繼 續 做 後 續 的 電 顯 觀 察 圖 15 轉 染 質 體 的 COS-1 細 胞 螢 光 顯 微 照 片 pegfp-n1 載 體 能 使 轉 譯 出 的 插 入 段 蛋 白 質 (CYP11A1) 帶 有 綠 螢 光, 因 此 能 以 螢 光 顯 微 鏡 觀 察 CYP11A1 分 布 位 置 圖 中 轉 染 pegfp-n1 的 COS-1 細 胞 中, 綠 色 螢 光 散 布 在 整 顆 細 胞 ; 轉 染 pegfp-n1- Cyp11a1 ( 全 長 ) 的 COS-1 細 胞 中, 綠 色 螢 光 的 分 布 呈 現 點 狀 顆 粒 狀 ; 轉 染 pegfp-n1- Cyp11a1 ( 缺 乏 粒 線 體 標 的 序 列 ) 的 COS-1 細 胞 中, 綠 色 螢 光 均 勻 分 布 於 細 胞 質 中, 螢 光 較 為 黯 淡 18

二 以 電 子 顯 微 鏡 觀 察 經 質 體 轉 染 後 的 COS-1 細 胞 : 未 經 過 質 體 轉 染 的 COS-1 細 胞 以 及 轉 染 了 未 插 入 Cyp11a1 基 因 的 pegfp-n1 載 體 的 細 胞 中, 粒 線 體 多 數 為 長 條 形, 並 具 有 板 狀 內 褶 膜 ; 轉 染 pegfp-n1-cyp11a1( 全 長 ) 的 COS-1 細 胞 中, 大 部 分 粒 線 體 呈 現 球 形, 並 具 有 管 囊 狀 內 褶 膜 圖 16 未 轉 染 轉 染 pegfp-n1 及 pegfp-n1-cyp11a1( 全 長 ) 的 COS-1 細 胞 電 子 顯 微 鏡 照 片 外 送 CYP11A1 能 使 COS-1 細 胞 的 長 條 形 粒 線 體 與 板 狀 內 褶 膜 形 變 為 球 形 粒 線 體 與 管 囊 狀 內 褶 膜 19

三 針 對 粒 線 體 形 態 ( 球 形 粒 線 體 的 比 例 ) 進 行 統 計 : 圖 17 未 轉 染 轉 染 pegfp-n1 及 pegfp-n1-cyp11a1( 全 長 ) 的 COS-1 細 胞 中 球 形 粒 線 體 所 佔 的 比 例 圖 中 n 值 為 所 計 算 的 細 胞 數 量 由 圖 可 知, 轉 染 Cyp11a1 後 細 胞 中 的 球 形 粒 線 體 增 加 了 由 於 電 顯 切 片 的 角 度 不 同, 長 條 形 的 粒 線 體 也 可 能 切 出 圓 形 的 截 面, 因 此 未 轉 染 及 僅 轉 染 載 體 的 細 胞 仍 有 一 定 比 例 的 球 形 粒 線 體, 實 為 實 驗 無 法 避 免 的 誤 差 而 質 體 的 轉 染 成 功 率 也 尚 無 法 達 到 百 分 之 百, 因 此 轉 染 Cyp11a1 的 細 胞 球 形 粒 線 體 比 例 不 到 100% 但 整 體 而 言, 實 驗 組 與 對 照 組 之 間 仍 有 達 到 統 計 上 的 顯 著 差 異 20

實 驗 三 : 將 具 有 CYP11A1 作 用 活 性 的 F2 質 體 及 經 突 變 而 不 具 活 性 的 VE 質 體 轉 染 至 COS-1 細 胞 後 以 電 子 顯 微 鏡 觀 察 一 電 子 顯 微 鏡 照 片 圖 18 未 轉 染 及 轉 染 F2 或 VE 質 體 的 細 胞 粒 線 體 形 態 由 圖 可 見, 轉 染 F2 和 VE 的 細 胞, 粒 線 體 出 現 明 顯 的 管 囊 狀 內 褶 膜 21

二 針 對 粒 線 體 外 形 與 內 褶 膜 形 態 進 行 分 類 統 計, 並 撰 寫 程 式 分 析 資 料 圖 19 未 轉 染 及 轉 染 F2 或 VE 質 體 的 細 胞 粒 線 體 內 褶 膜 形 態 統 計 由 圖 可 見, 轉 染 F2 或 VE 質 體 均 能 使 細 胞 粒 線 體 管 囊 狀 (Tubular-vesicular) 內 褶 膜 增 加 板 層 狀 (Lamellar) 內 褶 膜 減 少, 顯 示 不 論 CYP11A1 是 否 具 有 活 性, 都 能 改 變 細 胞 的 粒 線 體 內 褶 膜 形 態 圖 20 未 轉 染 及 轉 染 F2 或 VE 質 體 的 細 胞 粒 線 體 外 形 統 計 由 圖 可 見, 轉 染 F2 或 VE 質 體 後, 細 胞 中 長 條 形 粒 線 體 的 比 例 降 低 了 22

實 驗 四 : 測 量 轉 染 質 體 前 後 細 胞 的 ATP 產 率 一 自 製 的 CYP11A1 完 全 表 現 質 體 與 其 對 照 組 pegfp-n1 載 體 圖 21 轉 染 載 體 或 CYP11A1 完 全 表 現 質 體 的 細 胞 ATP 產 率 由 圖 可 見, 轉 染 CYP11A1 的 細 胞,ATP 產 率 僅 為 轉 染 載 體 的 1/3, 顯 示 粒 線 體 形 變 會 降 低 細 胞 的 代 謝 率 轉 染 載 體 的 組 別 ATP 產 率 較 未 轉 染 組 低, 可 能 是 因 為 綠 螢 光 蛋 白 發 光 會 消 耗 細 胞 的 ATP 23

二 具 有 作 用 活 性 的 F2 質 體 與 其 對 照 組 VE 質 體 圖 22 轉 染 F2 或 VE 質 體 及 是 否 施 加 膽 固 醇, 細 胞 ATP 產 率 的 比 較 由 圖 可 見, 轉 染 F2 或 VE 質 體 均 使 細 胞 ATP 產 率 下 降, 顯 示 粒 線 體 形 變 會 降 低 細 胞 的 代 謝 率 施 加 膽 固 醇 的 組 別 ATP 產 率 均 較 高, 可 能 是 因 為 膽 固 醇 也 能 作 為 細 胞 的 營 養 來 源 柒 結 論 一 內 生 CYP11A1 的 細 胞 ( 如 Y1) 具 有 球 形 粒 線 體 與 拱 狀 內 褶 膜, 而 不 內 生 CYP11A1 的 細 胞 ( 如 COS1 及 NIH-3T3) 具 有 長 條 形 粒 線 體 與 板 狀 內 褶 膜 二 外 送 CYP11A1 能 使 長 條 形 粒 線 體 與 板 狀 內 褶 膜 形 變 為 球 形 粒 線 體 與 拱 狀 或 管 囊 狀 內 褶 膜, 證 實 CYP11A1 能 使 粒 線 體 發 生 形 變 此 作 用 不 論 CYP11A1 是 否 具 有 作 用 活 性 都 會 發 生 三 粒 線 體 形 變 為 球 形 拱 狀 或 管 囊 狀 內 褶 膜 後, 會 減 緩 細 胞 的 呼 吸 作 用,ATP 產 率 下 降 24

捌 未 來 展 望 本 研 究 為 粒 線 體 形 變 的 研 究 開 啟 了 新 的 局 面, 顛 覆 了 粒 線 體 形 變 代 表 細 胞 凋 亡 的 觀 念, 證 實 了 CYP11A1 會 使 粒 線 體 發 生 形 變, 而 其 原 因 可 能 是 為 了 提 高 它 製 造 類 固 醇 賀 爾 蒙 的 能 力 在 動 物 體 內, 粒 線 體 形 變 是 伴 隨 在 類 固 醇 生 成 細 胞 的 分 化 過 程 中 的 重 要 事 件, 是 細 胞 分 化 為 具 有 製 造 類 固 醇 賀 爾 蒙 能 力 的 標 誌 本 研 究 中 已 經 成 功 藉 由 轉 染 F2 質 體 至 非 類 固 醇 生 成 細 胞, 而 使 粒 線 體 形 變 並 製 造 孕 烯 醇 酮, 並 改 變 細 胞 的 代 謝 率, 某 種 程 度 上 可 以 解 釋 為 粒 線 體 形 變 造 成 的 細 胞 分 化 未 來 希 望 藉 由 動 物 類 固 醇 生 成 細 胞 的 原 代 培 養 (primary culture) 來 更 進 一 步 證 明 粒 線 體 形 變 與 細 胞 分 化 的 關 係 另 外, 關 於 CYP11A1 使 粒 線 體 形 變 的 機 制, 目 前 已 知 與 CYP11A1 本 身 的 作 用 活 性 無 關, 未 來 可 藉 由 轉 染 不 同 片 段 的 CYP11A1 質 體 來 篩 選 出 造 成 粒 線 體 形 變 的 關 鍵 蛋 白 質 構 造 玖 參 考 文 獻 一 Campello, S., Scorrano, L. (2010) Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep., 11(9):678-84. 二 Chien Yu, et al. (2013) Misregulated progesterone secretion and impaired pregnancy in Cyp11a1 transgenic mice. Biology of reproduction, 89(4), 91. 三 Hu, M.C., et al. (2002) Steroid deficiency syndromes in mice with targeted disruption of Cyp11a1. Molecular Endocrinology, 20(4):930. 四 Itoh, K., et al. (2013) Mitochondrial dynamics in neurodegeneration. Trends Cell Biology, 23(2):64-71. 25

五 Miller, W.L., et al. (2011) The molecular biology, biochemistry, and physiology of human steroidogenesis and its disorders. Endocrine Review, 32(4):579. 六 Harikrishna, J.A., Black, S.M., et al. (1993) Construction and function of fusion enzymes of the human cytochrome P450scc system. DNA and cell biology, 12(5):371-9. 七 Huang, M.C., Miller, W.L. (2001) Creation and activity of COS-1 cells stably expressing the F2 fusion of the human cholesterol side-chain cleavage enzyme system. Endocrinology, 142(6):2569-76. 26

評 語 080003- 評 語 觀 察 CYP11A1 與 粒 線 體 發 生 形 變 的 關 係, 發 現 內 生 CYP11A1 的 細 胞 具 有 球 型 粒 線 體 與 拱 狀 內 摺 膜 也 證 實 外 選 CYP11A1 的 使 粒 線 體 發 生 形 變, 對 未 來 實 驗 提 供 可 行 的 方 向, 值 得 進 行 後 續 的 實 驗 080003- 評 語