华 北 农 学 报 ( ): - 生 物 安 全 性 白 藜 芦 醇 合 成 酶 表 达 载 体 的 构 建 及 水 稻 遗 传 转 化, 李 海 青, 柳 絮, 王 庆 国,, 姚 方 印, 刘 炜 (. 山 东 省 农 业 科 学 院 高 新 技 术 研 究 中 心, 山 东 省 作 物 遗 传 改 良 与 生 物 技 术 重 点 实 验 室, 山 东 济 南 ;. 农 业 部 黄 淮 海 作 物 遗 传 改 良 与 生 物 技 术 重 点 开 放 实 验 室, 山 东 济 南 ;. 山 东 师 范 大 学 生 命 科 学 学 院, 山 东 济 南 ) 摘 要 : 白 藜 芦 醇 是 植 物 遭 受 胁 迫 时 自 身 分 泌 的 一 种 可 抵 御 病 菌 感 染 的 抗 菌 素, 对 真 菌 具 有 一 定 的 抑 制 作 用 而 白 藜 芦 醇 合 成 酶 在 白 藜 芦 醇 合 成 途 径 中 具 有 关 键 性 的 作 用 水 稻 稻 瘟 病 作 为 一 种 由 真 菌 引 起 的 严 重 病 害, 具 有 高 发 性 毁 灭 性 的 特 点, 对 水 稻 品 质 及 生 产 危 害 极 大 本 研 究 从 花 生 中 分 离 到 白 藜 芦 醇 合 酶 基 因, 通 过 基 因 工 程 的 方 法 构 建 入 经 改 造 的 以 玉 米 泛 素 为 启 动 子 以 生 物 安 全 性 的 基 因 为 选 择 标 记 的 植 物 双 元 表 达 载 体 - 中, 经 农 杆 菌 介 导 对 黄 淮 稻 区 主 栽 品 种 圣 稻 进 行 遗 传 转 化, 经 抗 性 鉴 定 及 分 子 筛 选, 证 明 白 藜 芦 醇 合 成 酶 基 因 已 整 合 入 水 稻 基 因 组, 并 获 得 转 基 因 株 系 目 前 转 基 因 植 株 已 移 栽 至 大 田, 为 进 一 步 进 行 基 因 功 能 鉴 定 及 田 间 抗 病 水 稻 新 品 种 培 育 提 供 了 候 选 材 料 关 键 词 : 白 藜 芦 醇 ; 白 藜 芦 醇 合 成 酶 基 因 ; 水 稻 稻 瘟 病 ; 启 动 子 ; 基 因 ; ; 抗 病 水 稻 新 品 种 培 育 中 图 分 类 号 : 文 献 标 识 码 : 文 章 编 号 : - ( ) - - -,, -, -,, (. -,,,, ;.,,, ;.,, ) :., -, -.,, -., -. - -. - -,.,. : ( ); ; ; ( ); ; ; 植 物 中 白 藜 芦 醇 ( ) 又 称 芪 三 酚, 是 一 种 含 有 芪 类 结 构 的 非 黄 酮 类 多 酚 化 合 物, 广 泛 存 在 于 种 收 稿 日 期 : - - 基 金 项 目 : 国 家 转 基 因 植 物 新 品 种 培 育 重 大 专 项 ( - ) 作 者 简 介 : 李 海 青 ( -), 女, 山 东 聊 城 人, 在 读 硕 士, 主 要 从 事 转 基 因 作 物 育 种 研 究 通 讯 作 者 : 刘 炜 ( -), 女, 山 东 济 南 人, 副 研 究 员, 博 士, 主 要 从 事 作 物 分 子 育 种 研 究
期 李 海 青 等 : 生 物 安 全 性 白 藜 芦 醇 合 成 酶 表 达 载 体 的 构 建 及 水 稻 遗 传 转 化 子 植 物 中 作 为 植 物 处 于 恶 劣 环 境 下 或 遭 到 病 原 体 侵 害 时, 植 物 自 身 分 泌 的 一 种 可 抵 御 病 菌 感 染 的 抗 菌 素, 在 增 强 植 物 抵 抗 病 原 体 的 能 力, 及 对 多 种 真 菌 [, ] 性 病 害 进 行 抑 制 方 面 具 有 重 要 作 用 作 为 芪 类 次 生 代 谢 物, 主 要 是 通 过 苯 丙 氨 酸 代 谢 途 径 合 成 的, 其 中 最 关 键 的 调 节 酶 即 为 芪 合 酶 (, ) 白 藜 芦 醇 合 成 酶 ( -, ) 作 为 芪 合 酶 中 的 一 类, 主 要 存 在 于 花 生 葡 萄 以 及 虎 杖 中, 作 为 合 成 代 谢 途 径 中 最 后 一 个 起 作 用 的 关 键 酶, 也 是 合 成 途 径 中 唯 一 必 需 的 合 成 酶, 对 植 物 体 内 合 成 及 代 谢 具 有 重 要 的 调 控 作 用 虽 然 大 部 分 植 物 体 内 均 含 有 的 合 成 底 物, 但 因 缺 少 而 很 难 合 成 来 抵 制 外 界 的 生 物 胁 迫 水 稻 稻 瘟 病 ( ) 是 一 种 真 菌 性 病 害, 其 分 布 广 泛 发 病 频 率 高 致 病 性 分 化 严 重 危 害 极 大 世 纪 年 代 以 来, 我 国 稻 瘟 病 年 发 生 面 积 平 均 在 万 公 顷 左 右, 损 失 稻 谷 在 数 亿 公 斤, 严 重 影 响 了 粮 食 产 量 和 农 业 生 产 由 于 这 种 病 菌 具 有 生 理 小 种 多 且 复 杂 等 特 点, 故 稻 瘟 病 防 治 工 作 开 展 起 来 比 较 困 难 目 前 控 制 稻 瘟 病 害 的 方 法 主 要 是 使 用 杀 菌 剂 和 利 用 抗 病 品 种 但 化 学 农 药 等 杀 菌 剂 的 使 用 具 有 产 生 选 择 压 力 失 效 快 易 造 成 污 染 等 缺 点, 极 大 危 害 人 类 的 健 康, 不 利 于 农 业 生 产 及 可 持 续 发 展 植 物 基 因 工 程 的 发 展 为 稻 瘟 病 病 害 的 防 治 及 作 物 抗 病 育 种 工 作 开 辟 了 一 条 崭 新 而 有 效 的 途 径 利 用 基 因 工 程 技 术 可 向 现 有 栽 培 品 种 中 导 入 外 源 抗 病 基 因 而 不 受 目 标 植 物 种 属 限 制, 拓 展 了 可 利 用 基 因 的 来 源, 是 稻 瘟 病 防 治 及 抗 病 育 种 最 为 经 济 有 效 的 措 施 本 研 究 通 过 同 源 克 隆 的 方 法, 在 花 生 根 中 克 隆 到 基 因, 并 将 其 构 建 入 以 启 动 子 驱 动 表 达 以 生 物 安 全 性 的 基 因 为 选 择 标 记 的 植 物 双 元 表 达 载 体 中, 经 农 杆 菌 介 导 法 对 黄 淮 稻 区 主 栽 品 种 圣 稻 的 成 熟 胚 进 行 遗 传 转 化, 以 期 获 得 在 转 化 植 株 中 能 够 合 成 的 水 稻 材 料, 提 高 其 对 外 界 胁 迫, 尤 其 是 对 真 菌 性 稻 瘟 病 害 的 抵 抗 力, 为 进 一 步 鉴 定 基 因 功 能 及 选 育 抗 稻 瘟 病 水 稻 新 品 种 提 供 候 选 材 料 材 料 和 方 法. 试 验 材 料 选 用 花 生 品 种 鲁 花, 在 人 工 气 候 室 培 养, 光 周 期 为 ( )/ ( ), 定 期 浇 水 至 萌 发 分 别 提 取 花 生 根 ( ) 茎 ( ) 叶 ( ) 花 及 种 子 的, 保 存 于 -, 用 于 之 后 反 转 录 及 相 关 试 验 基 因 特 异 性 引 物 - : - - -, - : - -, 由 上 海 生 工 生 物 工 程 技 术 服 务 有 限 公 司 合 成. 花 生 总 的 提 取 以 及 第 一 链 的 合 成 利 用 植 物 总 提 取 试 剂 盒 ( 济 南 凯 琪 生 物 技 术 有 限 公 司, : ) 提 取 花 生 的 总 将 经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 以 及 紫 外 分 光 光 度 计 检 测 后 的 进 行 反 转 录, 合 成 单 链 用 于 反 转 录 的 试 剂 盒 为 - (, : ) 单 链 合 成 的 步 骤 为 : 第 一 步, ( μ / ) μ, μ, μ, μ, 将 这 μ 的 反 应 体 系 置 于, 变 性, 然 后 冰 上 急 冷 用 于 退 火 ; 第 二 步, 向 变 性 退 火 后 的 反 应 液 中 加 入 μ,. μ, μ,. μ 使 反 应 总 体 系 为 μ 之 后, 进 行 反 转 录. 花 生 基 因 的 分 离 以 花 生 总 反 转 录 后 的 单 链 为 模 板, 以 基 因 特 异 性 引 物 - 和 - 进 行 扩 增 体 系 及 反 应 程 序 参 照 文 献 扩 增 产 物 经 % 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 并 回 收 后, 与 - 连 接 获 得 - ( 图 ), 经 转 化 大 肠 杆 菌 α 感 受 态 细 胞, 挑 取 部 分 菌 落 经 菌 液 鉴 定 Ⅲ 单 酶 切 鉴 定 及 核 苷 酸 序 列 同 源 性 比 对 以 及 进 化 树 分 析 参 照 文 献 图 重 组 质 粒 - 图 谱. -. 植 物 双 元 表 达 载 体 - - 的 构 建 本 研 究 所 应 用 的 植 物 双 元 表 达 载 体 为 山 东 农 业 大 学 温 孚 江 教 授 馈 赠 的 经 改 造 的 载
华 北 农 学 报 卷 体, 改 造 后 该 载 体 由 玉 米 泛 素 启 动 子 驱 动, 以 生 物 安 全 性 的 基 因 作 为 选 择 标 记, 改 造 后 载 体 命 名 为 - 中 间 载 体 - 中 目 的 基 因 两 端 与 - 载 体 两 端 没 有 适 合 的 酶 切 位 点, 故 采 用 了 先 酶 切 后 补 平 的 策 略, 先 酶 切 下 载 体 中 基 因 片 段 的 一 端, 经 连 接 酶 将 切 口 处 的 粘 性 末 端 补 平, 产 生 平 末 端, 进 一 步 可 运 用 和 将 目 的 基 因 与 - 载 体 双 酶 切 并 连 接, 获 得 重 组 质 粒 - - 挑 取 部 分 菌 落 进 行 菌 液, 结 合 单 酶 切 鉴 定, 获 得 阳 性 重 组 质 粒 并 测 序 ( 图 ) 后 以 溶 解 获 得 水 稻 叶 片 基 因 组 以 之 为 模 板, 分 别 以 - 和 - 为 引 物 进 行 扩 增, 检 测 是 否 能 够 获 得 和 目 的 基 因 大 小 一 致 的 条 带 并 将 检 测 结 果 与 经 除 草 剂 初 步 筛 选 的 结 果 进 行 对 比, 确 定 阳 性 转 基 因 植 株 结 果 与 分 析. 花 生 中 基 因 的 克 隆 及 酶 切 鉴 定 以 花 生 总 反 转 录 合 成 的 第 一 链 为 模 板, 以 基 因 特 异 性 的 - 和 - 为 引 物 进 行 扩 增, 产 物 经 % 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳, 得 到 一 条 大 小 为 的 条 带 ( 图 ), 与 预 期 大 小 一 致 产 物 经 回 收 并 测 序, 证 明 为 基 因 的 图 重 组 质 粒 - - 图 谱. - -. 农 杆 菌 介 导 的 转 化 及 转 基 因 植 株 的 获 得 用 热 激 法 将 重 组 质 粒 - - 转 入 农 杆 菌 感 受 态 中, 经 培 养 获 得 菌 落, 经 菌 液 获 得 阳 性 克 隆 阳 性 克 隆 划 线 后, 挑 取 单 克 隆 进 一 步 培 养 获 得 菌 液 本 研 究 所 用 水 稻 转 化 品 种 为 黄 淮 稻 区 主 栽 品 种 圣 稻, 水 稻 成 熟 胚 遗 传 转 化 参 照 王 薇 的 方 法 进 行 诱 导 出 的 水 稻 成 熟 胚 愈 伤 组 织 与 阳 性 农 杆 菌 菌 液 经 共 培 养 后, 用 / 浓 度 的 进 行 次 抗 性 筛 选, 经 诱 导 分 化, 获 得 部 分 转 基 因 组 培 苗. 转 基 因 植 株 的 初 步 筛 选 及 鉴 定 转 基 因 组 培 苗 经 炼 苗 后, 将 根 部 和 茎 叶 分 化 得 较 好 的 苗 从 试 管 中 挑 出, 移 栽 至 土 中 生 长, 待 幼 苗 长 至 叶 期 时, 在 转 化 植 株 的 叶 片 上 涂 抹 / 的 除 草 剂 ( 有 效 成 分 ), 后 观 察 涂 抹 处 叶 片 是 否 黄 化, 统 计 抗 性 株 及 敏 感 株 的 数 目, 对 阳 性 转 化 植 株 进 行 初 步 鉴 定 对 检 测 结 果 初 步 显 示 为 阳 性 的 植 株, 进 一 步 进 行 分 子 检 测, 方 法 为 : 用 简 易 法 抽 提 水 稻 叶 片, 即 以 抽 提 液 ( 含 / -, /, / ) 对 叶 片 进 行 抽 提, 抽 提 液 经 异 丙 醇 沉 淀, % 的 乙 醇 洗 涤, 最. 分 子 量 ;. 基 因 的 产 物. ;.. 图 花 生 中 基 因 的 扩 增 结 果. - 将 基 因 与 - 载 体 连 接 获 得 -, 经 Ⅲ 进 行 单 酶 切 鉴 定, 获 得 约 为 的 单 一 条 带 ( 图 ), 与 预 期 产 物 大 小 一 致, 证 明 中 间 载 体 构 建 成 功. 分 子 量 ;. 酶 切 产 物. ;.. 图 质 粒 - 的 酶 切 鉴 定. -. 植 物 双 元 表 达 载 体 - - 的 构 建 及 鉴 定 本 研 究 中 所 应 用 的 植 物 双 元 表 达 载 体 -, 经 改 造 添 加 了 玉 米 泛 素 启 动 子, 同 时 载 体 的 下 游 插 入 了 由 组 成 型 启 动 子 驱 动 的
期 李 海 青 等 : 生 物 安 全 性 白 藜 芦 醇 合 成 酶 表 达 载 体 的 构 建 及 水 稻 遗 传 转 化 基 因, 以 其 作 为 生 物 安 全 的 选 择 标 记 经 改 造 后 的 载 体 重 命 名 为 - 中 间 载 体 - 经 酶 切 开 补 平 后, 进 一 步 以 和 对 基 因 片 段 与 双 元 表 达 载 体 双 酶 切, 经 连 接 获 得 - - 对 重 组 质 粒 用 进 行 单 酶 切 鉴 定, 经 电 泳 获 得 的 左 右 的 条 带 ( 图 ), 与 预 期 大 小 相 符 合. 分 子 量 ;. 酶 切 产 物. ;.. 图 质 粒 - - 的 酶 切 鉴 定. - -. 农 杆 菌 介 导 的 水 稻 转 化 用 热 激 法 将 上 述 构 建 成 功 的 重 组 质 粒 - - 转 入 农 杆 菌 菌 株 中, 阳 性 农 杆 菌 经 菌 液 进 行 鉴 定, 结 果 如 图 将 鉴 定 为 阳 性 的 农 杆 菌 单 菌 落 进 行 液 体 培 养 获 得 菌 液, 以 之 侵 染 水 稻 成 熟 胚 愈 伤 组 织, 经 共 转 化 后, 进 一 步 继 代 及 抗 性 筛 选, 获 得 株 转 化 植 株. 野 生 型 植 株 ;. 非 转 基 因 植 株 ;. 转 基 因 阳 性 植 株. -, ;. -, ;.,. 图 对 转 基 因 植 株 的 初 步 筛 选. 同 时, 对 可 能 的 阳 性 转 基 因 植 株 进 行 分 子 鉴 定, 即 提 取 株 转 化 植 株 的 基 因 组, 以 基 因 特 异 性 的 - 和 - 为 引 物 进 行 扩 增 结 果 显 示, 株 转 化 植 株 中 前 个 株 系 均 获 得 了 与 阳 性 对 照 大 小 一 致 的 约 为 的 条 带, 确 定 为 转 基 因 阳 性 株 系 ( 图 ), 转 化 效 率 为. % 该 结 果 与 抗 性 筛 选 的 结 果 相 一 致 目 前 阳 性 转 化 植 株 已 移 栽 至 大 田, 基 因 功 能 鉴 定 及 田 间 抗 病 性 检 测 正 在 进 行 中. 分 子 量 ; ~. 样 品 菌 液 产 物 ; +. 阳 性 对 照 ; -. 阴 性 对 照. ; -. ; +. ; -.. 图 经 基 因 转 化 的 农 杆 菌 菌 液 鉴 定 结 果.. 花 生 转 基 因 阳 性 植 株 的 鉴 定 待 转 化 植 株 生 长 至 六 叶 期, 即 用 涂 抹 转 化 植 株 的 叶 片, 进 行 除 草 剂 抗 性 筛 选, 后 观 察 所 涂 抹 部 位 是 否 黄 化 结 果 显 示, 野 生 型 以 及 假 阳 性 转 化 植 株 叶 片 经 涂 抹 后, 涂 抹 部 位 逐 渐 黄 化 干 枯 甚 至 死 亡 ; 而 阳 性 转 化 植 株 叶 片 的 涂 抹 处 颜 色 并 未 发 生 明 显 变 化 ( 图 ). 分 子 量 ; ~. 转 化 植 株 的 产 物 ; +. 阳 性 对 照 ; -. 阴 性 对 照. ; -. ; +. ; -.. 讨 论 图 基 因 转 化 植 株 的 分 子 鉴 定 结 果. 在 抗 氧 化 抗 炎 症 心 血 管 及 肿 瘤 等 疾 病 的 预 防 以 及 人 类 健 康 保 健 方 面 的 作 用 及 功 能 为 大 众 所 知 近 年 来, 随 着 人 们 对 食 品 保 健 功 能 要 求 的 提 高, 对 的 研 究 逐 渐 增 多, 其 在 植 物 抗 逆 及 作 为 一 种 重 要 的 植 保 素 在 植 物 抗 病 中 的 作 用 越 来 越 受 到 研 究 者 的 重 视 尤 其 是 在 合 成 途 径 中 的 关 键 作 用, 不 少 研 究 者 就 将 转 入 到 不 含 芪 合 酶 的 植 物 中, 使 植 物 可 一 定 程 度 的 弥 补 自 身 芪 合 酶 的 缺 失, 从 而 使 合 成 途 径 能 够 进 行, 在 一 定 程 度 上 增 强 了
华 北 农 学 报 卷 [ ] 植 物 的 抗 病 性 其 中, 等 将 基 因 转 入 烟 草 和 番 茄 中, 转 基 因 植 物 对 葡 萄 孢 属 ( ) 和 疫 霉 属 ( ) 病 菌 的 抗 性 大 大 提 高 ; 和 [ ] 将 花 生 中 的 基 因 转 入 苜 蓿, 发 现 转 基 因 苜 蓿 大 大 抑 制 了 茎 点 霉 属 的 真 菌 的 生 长 水 稻 稻 瘟 病 在 世 界 各 稻 区 均 有 发 生, 对 水 稻 的 生 产 造 成 极 其 严 重 的 影 响, 流 行 年 份 甚 至 颗 粒 无 [ ] 收 目 前, 最 为 有 效 且 可 行 的 防 治 稻 瘟 病 的 方 法 主 要 是 通 过 基 因 工 程 的 手 段 转 入 抗 真 菌 蛋 白 类 基 因 来 培 育 抗 病 新 品 种 目 前 已 从 植 物 中 分 离 克 隆 出 一 些 具 有 离 体 抑 制 真 菌 生 长 增 殖 能 力 的 蛋 白 质 编 码 基 因, 许 明 辉 等 将 几 丁 质 酶 和 β- 葡 聚 糖 酶 基 因 导 入 滇 型 杂 交 稻 恢 复 系, 阳 性 转 化 植 株 对 稻 瘟 这 种 真 菌 性 病 害 的 抗 性 有 了 广 泛 的 提 高 ; 等 将 拟 南 芥 中 抗 真 菌 的 硫 堇 蛋 白 类. 基 因 转 化 入 番 茄 中, 阳 性 转 基 因 植 株 也 表 现 出 了 对 番 茄 真 菌 性 病 害 枯 萎 病 的 良 好 抗 性 鉴 于 以 往 对 的 研 究 成 果 及 对 其 在 植 物 抗 病 中 作 用 的 报 道, 本 研 究 中 将 在 花 生 中 分 离 到 的 基 因 转 入 水 稻, 以 期 获 得 对 水 稻 稻 瘟 病 这 种 真 菌 性 病 害 具 有 一 定 抵 抗 及 抑 制 作 用 的 转 基 因 材 料, 对 部 分 移 入 田 间 的 材 料 感 病 情 况 的 观 察 结 果 也 显 示, 在 野 生 型 材 料 爆 发 较 大 规 模 的 稻 瘟 病 感 染 的 情 况 下, 转 基 因 材 料 感 病 较 轻, 无 明 显 病 害 症 状 出 现, 相 关 机 理 及 机 制 仍 在 进 一 步 研 究 中 在 植 物 基 因 工 程 研 究 中, 选 择 高 效 专 一 的 启 动 子 是 外 源 目 的 基 因 能 够 在 目 标 植 物 中 进 行 高 效 表 达 的 关 键 本 研 究 中 所 应 用 的 玉 米 泛 素 启 动 子 作 为 组 成 型 启 动 子, 具 有 启 动 效 率 高 甲 基 化 程 度 相 对 较 低 以 及 遗 传 性 状 稳 定 等 特 点, 因 其 在 单 子 叶 植 物 中 活 性 极 强 并 且 其 所 驱 动 的 目 的 基 因 在 单 子 叶 植 物 中 可 持 续 高 效 的 表 达 而 被 在 单 子 叶 植 物 转 化 中 广 泛 应 用 环 境 安 全 问 题 是 全 球 所 共 同 关 注 的 重 大 问 题 除 草 剂 抗 性 基 因 作 为 筛 选 标 记, 无 基 因 无 多 效 性, 同 食 物 中 的 一 样 安 全, 其 编 码 产 物 膦 丝 菌 素 乙 酰 转 移 酶 ( ), 与 已 知 毒 素 和 过 敏 原 均 无 同 源 性 且 其 具 有 热 稳 定 性 和 消 化 稳 定 性, 已 证 明 对 人 体 和 动 物 安 全 无 毒, 而 草 丁 膦 作 为 一 种 生 物 除 草 剂, 在 土 壤 中 易 被 快 速 分 解 无 残 留, 对 哺 乳 动 物 无 毒 无 害 以 往 相 关 研 究 中, 以 基 因 作 为 筛 选 标 记, 不 仅 在 一 定 程 度 上 消 除 了 人 们 对 转 基 因 植 物 中 标 记 基 因 可 能 存 在 的 潜 在 威 胁 的 顾 虑, 也 有 利 于 后 期 转 基 因 新 品 种 的 推 广 及 应 用 本 研 究 即 应 用 基 因 作 为 筛 选 标 记, 获 得 转 化 体 后 进 一 步 通 过 初 期 除 草 剂 抗 性 筛 选 结 合 分 子 鉴 定, 获 得 株 阳 性 转 基 因 植 株 且 已 移 栽 至 大 田, 在 进 一 步 检 测 转 入 基 因 对 目 标 植 物 中 含 量 的 影 响 及 植 物 本 身 抗 病 性 及 营 养 成 分 变 化 的 前 提 下, 可 为 在 农 业 生 产 中 培 育 出 新 的 抗 稻 瘟 病 水 稻 品 种 提 供 良 好 的 候 选 材 料 参 考 文 献 :,. -., : -.,.., ( ): -. 何 水 林, 郑 金 贵, 林 明, 等. 植 物 芪 类 次 生 代 谢 物 的 功 能 合 成 调 控 及 基 因 工 程 研 究 进 展. 农 业 生 物 技 术 学 报, ( ): -. 韩 晶 晶, 刘 炜, 毕 玉 平. 白 藜 芦 醇 的 研 究 进 展. 生 物 工 程 学 报, ( ): -. 邓 其 明, 周 鹏, 林 琳, 等. 水 稻 稻 瘟 病 抗 性 基 因 研 究 进 展 及 其 在 育 种 上 的 应 用. 安 徽 农 业 科 学,, ( ): -. 康 美 花, 曹 丰 生, 陈 红 萍, 等. 水 稻 稻 瘟 病 抗 性 基 因 研 究 进 展 及 其 在 育 种 上 的 应 用. 江 西 农 业 学 报,, ( ): -. 谭 炎 宁, 易 自 力, 蒋 建 雄, 等. 转 基 因 改 良 水 稻 抗 稻 瘟 病 的 策 略 及 其 进 展. 分 子 植 物 育 种,, ( ): -. 鄂 志 国, 张 丽 靖, 焦 桂 爱, 等. 稻 瘟 病 抗 性 基 因 的 鉴 定 及 利 用 进 展. 中 国 水 稻 科 学,, ( ): -. 陈 德 西, 李 仕 贵, 马 炳 田, 等. 水 稻 稻 瘟 病 育 种 研 究 进 展. 安 徽 农 业 通 报, ( ): -. 韩 晶 晶, 刘 炜, 毕 玉 平. 花 生 白 藜 芦 醇 合 成 酶 基 因 的 克 隆 及 其 在 原 核 中 的 表 达. 作 物 学 报, ( ): -. 王 薇. 抗 虫 基 因 对 早 粳 稻 的 转 化. 哈 尔 滨 : 黑 龙 江 大 学,.,,,.., : -.,. -. - -, : -. 张 民 权. 水 稻 稻 瘟 病 发 生 原 因 及 防 治 技 术. 现 代 农 业 科 技, : -. -, -, -,. β -, - - - (.) ( ).,, ( ): -.,,,. (. ) -., ( ): -. 郭 志 鸿, 王 汉 宁, 陶 玲, 等. 启 动 子 驱 动 的 花 生 芪 合 酶 基 因 表 达 载 体 的 构 建 及 玉 米 遗 传 转 化 初 报. 甘 肃 农 业 大 学 学 报, ( ): -. 刘 洪 艳, 弭 晓 菊, 崔 继 哲. 基 因 蛋 白 和 草 丁 膦 的 特 性 与 安 全 性. 生 态 学 杂 志, ( ): -.