All-in-One TM qpcr Primer Manual and Validation Report Catalog number: HQP006940 GeneCopoeia, Inc.; 广州复能基因有限公司 地址 : 广州高新技术产业开发区广州科学城掬泉路 3 号广州国际企业孵化器 D 区 8 楼定购热线 :4006 020 200 技术支持 :020-32068595 传真 :020-32052877 网址 :www.genecopoeia.com.cn;www.fulengen.com E-Mail: sales@fulengen.com;support@fulengen.com 邮编 :510663 For Research Use Only
Primer Manual and Validation Report I. 概述 II. III. IV. 产品信息 推荐的配套使用试剂 产品使用流程 V. 产品应用 VI. All-in-One qpcr Primer 验证报告 I. 概述 All-in-One qpcr Primer 是采用本公司独特的算法设计, 以单链 cdna 为模板, 经 qpcr 实验验证并优化的 qpcr 引物, 配合含 SYBR Green 的 qpcr 试剂使用 ( 特别针对本公司的 All-in-One qpcr Mix), 主要应用于检测 mrna 水平上基因的表达量差异 II. 产品信息 PCR Gene Package Package Catalog# Primer ID Accession# size symbol Conc. size HQP006940 Hs-QRP-20169 NM_002046.3 152bp GAPDH 2 μm 200 rxn HQT000001 Positive Control cdna Mix 10 Mix 3 rxn 储存条件 :-20 保存, 避免反复冻融 III. 推荐的配套使用试剂 Additional products used or recommended Catalog numbers C0210C (100 synthesis reactions) First strand cdna Synthesis Kit C0210A (50 synthesis reactions) C0210B (20 synthesis reactions) D0101A (200 qpcr reactions) All-in-One qpcr Mix D0101M (600 qpcr reactions) D0101L (1200 qpcr reactions) 2
IV. 产品使用流程 1. 客户收到本产品时, 需在离心机上 12000rpm 离心 30sec, 使其液体完全流到离心管底部 ; 如每次引物的使用量不是很多, 建议客户对收到的产品进行分装并于 -20 保存, 避免反复冻融 ; 2. 本产品为特异基因检测的上游引物和下游引物混合液, 已用灭菌 ddh 2 O 稀释到使用浓度 2μM( 即为 10 Primer 包装 ), 使用时客户仅需参考其 PCR 反应体系的大小, 吸取一定量的本产品, 使其终浓度达整个反应体系的 1 量 ( 即终浓度为 0.2μM) 即可 3. 使用时客户仅需参考其 PCR 反应体系的大小, 吸取一定量的该产品引物, 使其终浓度为 0.2μM 即可 ; 该产品需推荐配合 All-in-One qpcr Mix 使用, 具体使用方法敬请参考 All-in-One qpcr Primer 验证报告 中 Page 7 的 qpcr 检测 部分 ; 4. 产品中附有公司进行产品验证的 Positive cdna Mix 模板, 客户如需要, 可参考 qpcr Primer 验证报告 中 Page7 的 qpcr 检测 部分对本产品进行质检 ; 5. 本产品需配合含 SYBR Green 的 qpcr 试剂使用, 不一定适合探针法检测 6. 本产品中配有的 Positive Control cdna Mix 是利用 First strand cdna Synthesis Kit 进行合成的 cdna 产物 配合 All-in-One qpcr Mix 可用于对 qpcr Primer 进行验证 V. 产品应用 All-in-One qpcr Primer 为应用于 qpcr 反应的引物, 主要用来检测 mrna 水平上基因的表达量差 异 : 如 shrna 干扰后对基因表达量下降程度的检测 VI. All-in-One qpcr Primer 验证报告 A 材料和方法 1. 验证实验仪器 iq5 Real Time PCR Detection System: Bio-Rad 2. 验证的实验材料及试剂 First Strand cdna Synthesis Kit ( Catalog Nos. C0210A) All-in-One qpcr Mix ( Catalog Nos. D0101A) 验证模板 : 人源十个不同的组织所制备的 cdna 3
B 验证流程 RNA 抽提 1. 样品处理取一定量的十个不同的人源组织标本至冷冻的研钵中, 加入液氮研磨至细粉, 最后转移至有 1ml TRIzol 的离心管中, 反复振荡约 5min ( 如为细胞样品, 则取约 10 6 ~10 7 左右的细胞数至 1ml TRIzol 中, 反复吹打至裂解 ) 2. 相分离室温放置 10min 左右后, 每 1ml TRIzol 中加入氯仿为 200μl, 盖上盖子, 剧烈振荡约 1min, 室温静置 2~5min, 然后 12000g 冷冻离心 15min(6 ), 小心取出样品, 通过观察可以发现样品分三层, 其中最上层含有 RNA 样品 3. RNA 沉淀 小心吸取上清液约 450μl( 每 1ml TRIzol 的吸取量 ) 至含有 600μl 冷冻异丙醇的新 离心管中, 混匀,-20 放置约 10min,12000g 冷冻离心 10min(6 ) 4. RNA 洗涤 去上清, 加入 500μl 冷冻的 75% 乙醇, 弹起沉淀后 12000g 冷冻离心 5min(6 ), 去上清, 再稍离, 吸去上清液 5. RNA 溶解 风干约 5~10min( 注意不能风太干, 只需要沉淀泛白即可 ), 加入 DEPC 水约 30μl 贴上标签后 -80 保存 6.RNA 浓度测定 吸取 1μl 抽提的 RNA 用 DEPC 水稀释 10 倍后, 在 Nanodrop 上测定 RNA 浓度, 以 DEPC 水做空白对照, 同时记录 RNA 浓度及其 A 260/OD280 7.RNA 电泳检测 7.1. 变性胶制备取 1g Agarose + 75ml 去离子水煮沸, 冷却至 70 左右加入 10ml 10 Mops 和 15ml 甲醛及 EB 倒胶至宽口梳子的胶板上, 盖上盖子 7.2. 电泳缓冲液配制 (1 Mops) 4
取 50ml 10 Mops, 用去离子水稀释至 500ml, 倒入电泳槽中, 再在电泳缓冲液中 添加 EB. 7.3.RNA 样品处理 取 RNA 样品 3μl, 补充 DEPC 水至 18μl,65 变性 10min 后立即冷却, 加入 2μl 10 RNA loading buffer 即可电泳 7.4.RNA 电泳 先把 RNA 胶放入电泳槽中,100V 作用电泳约 5min, 再在点样孔中点入处理过的 RNA 样品,100V 左右电泳至溴酚蓝至胶的 1/3 处, 取胶拍照 8.RNA 检测结果 8.1. 十个不同组织的 RNA 电泳图 ( 取各 3μl RNA 样品 ): 各泳道所对应的样品信息见下表 8.2 8.2 RNA 电泳的各泳道所对应的样品及其样品浓度和 A260/OD280 泳道 组织 Conc.(ng/μl) A 260/OD280 1 脑 2385 1.9 2 肺 2430 1.94 3 肝 2521 1.91 4 肾 6444 1.94 5 乳腺 2785 1.87 6 睾丸 2972 1.9 7 胎盘 3515 1.91 8 脾 3344 1.91 9 心脏 3394 1.91 10 胰腺 3101 1.91 5
NOTE:RNA 的质量是定量 PCR 实验的保证, 请严格按照所使用的 RNA 抽提试剂盒的要求及其步骤进行 操作 抽提结束后, 敬请电泳检测 RNA 抽提质量 反转录反应 1. 融解反应所需的 First Strand cdna Synthesis Kit 中的试剂, 上下轻微颠倒混匀, 进行 短暂离心后放置冰上待用 2.RNA-Primer Mix 的配制反应 ( 所有反应液的配制都在冰上操作 ) 在预冷的 RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积 13μl 试剂组分 体积 终浓度 Total tissues RNA 1 μg RNA 量 250 μm Random primer 1 μl 10 μm H 2 O (RNase / DNase Free) 至总体积 13μl 3. RNA 变性 混匀 RNA-Primer Mix, 进行短暂离心,65 变性 10min 后立即置冰上 4. 配制反转录反应液 在 RNA-Primer Mix 反应管内加入以下试剂至总体积 25μl 试剂组分 体积 终浓度 RNA-Primer Mix 13μl 5 RT Reaction Buffer 5μl 1 25mM dntp 1μl 1mM 25U/μl RNase Inhibitor 1μl 1 U/μl 200U/μl M-MLV RTase 1μl 8 U/μl H 2 O (RNase / DNase Free) 4μl 总体积 25μl 5. 反转录反应 混匀反应 Mix, 短暂离心后 37 孵育 1 小时 6. 灭活并保存反转录产物反应结束后,85 灭活处理 5min, 把各组织 RNA 反转录产物混合, 后再用灭菌 ddh 2 O 对此 cdna Mix 稀释 5 倍, 形成 Positive cdna Mix 最后-20 保存此反转录产物 6
qpcr 检测 1. 将 2 All-in-One qpcr Mix 在室温下融解, 轻柔得上下颠倒混匀并进行短暂离心 同 时在使用过程中始终保持避光 2. 冰上进行 qpcr 反应液的配制 ( 所有检测进行复孔测试, 同时进行 NTC(No template control) 测试 ) 试剂组分体积终浓度 2 All-in-One qpcr Mix 10 μl 1 All-in-One qpcr Primer(2μM) 1 st strand cdna(5 倍稀释液 ) ddh 2 O Final Volume 2 μl 2 μl 6 μl 20 μl 0.2μM Note: 在实验中设计了 NTC(No Template Control), 其为阴性对照, 即用水来代替模板 cdna, 其它试 剂不变, 从而来质控是否体系有污染 ; 实验中如需更改反应体积, 敬请保持最适条件下各组分的比 例 ; 试剂盒中的 50 Rox Reference Dye 使用在需用 Rox 校正的仪器, 如 ABI 的定量 PCR 仪 3. 充分混匀 qpcr 反应液, 添加至 PCR 反应管中, 短暂离心, 确保所有试剂到反应管 底部 4. qpcr 反应, 使用标准的三步法进行检测 ( 以 Bio-Rad 的 iq5 进行实验的设计 ) 循环数步骤温度时间检测 1 预变性 95 10min 否 变性 95 10sec 40 退火 60 20sec 延伸 72 15sec 否 否是 反应结束后, 立即进行融解曲线分析 检测温度范围升温速率恒温时间检测 72 ~95 0.5 / 次 10 sec/ 次 30 30sec 是 否 7
Note : 以上的反应条件主要参考的为 Bio-Rad 的 iq5 定量 PCR 仪器, 如使用的为不同公司的 定量 PCR 仪, 请按照不同的仪器要求, 调整 qpcr 反应的延伸时间及其融解曲线分析的条 件 ; 各 mirna 的退火温度可能例有差别, 具体请参考测试结果部分 C. 引物验证结果 1. GAPDH(Hs-QRP-20169 primer) 推荐退火温度为 60 GAPDH Amplification curve GAPDH melting analysis curve 该产品仅限于实验科学研究用, 若有任何单位或个人将该产品用于临床诊断 治疗等其他国家专门规定的特殊用途, 本公司概不承担任何责任 GeneCopoeia Products are for Research Use Only Copyright 2009 GeneCopoeia, Inc. Trademarks: iq5 (Bio-Rad); GeneCopoeia, OmicsLink, All-in-One, (GeneCopoeia Inc.); Trizol (Invitrogen); NanoDrop (Thermo Scientific) AOqPM-0310 8