研究报告 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 019, 35(7):100-107 低温萘降解菌的筛选 鉴定及降解条件优化 郭亚男张馨予胥梦王继华 ( 哈尔滨师范大学生命科学与技术学院, 哈尔滨 15005) 摘要 : 研究采用富集培养法从黑龙江省大庆油田地区污染土壤中筛选能以萘为唯一碳源和能源的低温菌株, 采用气相色谱 - 质谱法 (GC-MS) 研究降解菌在萘 - 无机盐培养基中对萘的降解情况, 通过单因素试验与正交试验测定降解菌的培养条件并进行优化, 同时分析降解阶段其主控因素 结果表明 : 筛选出 株在低温条件下高效降解萘的菌株, 编号为 和 在低温条件下 和 可以快速降解萘, 在对照组非生物因素影响基础上, 萘 (300 mg/l) 的降解率在 4 d 内达到 94.43% 和 95.47%, 在耐受能力和降解速度方面具明显优势 ; 经形态观察 生理生化特性和 16S rdna 基因序列鉴定两株降解菌皆属于假单胞菌属 (Pseudomonas); 均在萘 - 无机盐培养基 ( 萘浓度 300 mg/l), 培养温度 15, 初始 ph 6.0, 培养转数 180 r/min, 培养时间 7 d 的条件下生长最佳 株降解菌的生长与 5 种环境因素均有显著关系 关键词 : 低温 ; 萘 ; 生物降解 ; 假单胞菌属 DOI :10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.019-036 Screening,Identification of Naphthalene Degrading Bacteria at Low Temperature and Optimization of Their Degradation Conditions GUO Ya-nan ZHANG Xin-yu XU Meng WANG Ji-hua (College of Life Science and Technology,Harbin Normal University,Harbin 15005) Abstract: The enrichment culture method was used to screen low temperature strains using naphthalene as the sole carbon source and energy source from the contaminated soil in Daqing Oilfield,Heilongjiang Province. The gas chromatography-mass spectrometry(gc-ms) was employed to study the degradation of naphthalene by degrading bacteria in naphthalene-inorganic salt medium. The single-factor test and orthogonal test were applied to determine and optimize the culture conditions of the degrading bacteria,and the main controlling factors in the degradation stage were analyzed. The results showed that strains efficiently degrading naphthalene under low temperature condition were screened and named as and. and rapidly degraded naphthalene under low temperature conditions. On the basis of the nonbiological factors of the control group,the degradation rate of naphthalene(300 mg/l)reached 94.43% and 95.47% in 4 days,indicating that they had obvious advantages in tolerance and degradation rate. The strains were identified as Pseudomonas by morphological observation, physiological and biochemical characteristics and 16S rdna gene. The strains and grew best in naphthalene-inorganic salt medium (Naphthalene concentration 300 mg/l),culture temperature 15,initial ph 6.0,culture rotation 180 r/min,and culture time 7 d. The growth of the bacteria was significantly related to 5 environmental factors. Key words: low temperature ;naphthalene ;biodegradation ;Pseudomonas 多环芳烃 (Polycyclic aromatic hydrocarbons,pa- Hs) 是一种具有两个或多个苯环的有机污染物, 在 环境中广泛存在 [1] 主要来源于森林火灾 火山喷 发或化石燃料的不完全燃烧 [-3] 由于 PAHs 具有低 收稿日期 :019-04-5 基金项目 : 国家重大专项项目 水体污染控制与治理 (017ZX070-00-06) 作者简介 : 郭亚男, 女, 硕士研究生, 研究方向 : 微生物遗传 ;E-mail :59199794@qq.com 通讯作者 : 王继华, 女, 博士, 教授, 研究方向 : 微生物遗传和环境生态 ;E-mail :wangjihua333@hotmail.com
019,35(7) 郭亚男等 : 低温萘降解菌的筛选 鉴定及降解条件优化 101 溶解度, 高疏水性, 高辛醇 - 水分配系数 (K OW ) 和降解的顽固性等特性, 使其在环境中积累到高水平, 在我国东北污灌区 天津地区等部分地区土壤中均有检出 [4-6] 迄今已发现 00 多种 PAHs, 美国环境保护署列举出 16 种优先修复的 PAHs, 萘为其中一种, 萘因具有挥发性使它更容易与受体接触, 导致患溶血性贫血 皮肤病 视网膜炎及细胞癌变等疾病 [7-9] 土壤中的萘可被植物吸收, 进入食物链, 对人类健康和生态系统构成严重威胁 [10] 微生物修复是一种治理环境污染的有效方法, 与其他方法相比, 经济 高效且无二次污染 [11-13] 只要正确的利用微生物群体, 它们便利用土壤中的萘作为碳源和能源进行生长, 且细菌的运动能够为生物修复提供一种更快速 更均匀地降解萘的手段 [14-16] 根据文献调研,PAHs 污染北方较南方严重, 冬季 PAHs 的排放量大约是夏季的 1.6 倍 [17] 国内城市土壤中的 PAHs 主要来源于高温燃烧源和石油源所构成的混合型污染 [18] 我国北方年平均气温低于 15, 在此温度下许多最佳生长温度在 0 及以上的萘降解菌无法发挥其降解能力, 而在 15 或以下恰恰是低温微生物的最适生长温度 因此, 筛选对萘具有强降解能力的低温微生物是十分必要的 而北方土壤内的土著菌已长期适应了寒冷环境, 因此筛选萘的低温降解菌, 选择北方地区石油污染较严重的地区作为降解菌株的源土壤 大庆市, 别称油城, 是一座以石油 石化为支柱产业的著名工业城市 但是在开采过程中无法避免石油泄漏问题, 由此产生萘污染的环境问题日益严重 并且该区域的日平均气温低于 15, 持续 6-9 个月 因此, 研究从黑龙江省大庆油田地区污染土壤筛选能以萘为唯一碳源和能源的降解菌, 研究降解菌在萘 - 无机盐培养基中对萘的降解情况 ; 得到高效降解菌对其进行鉴定 ; 对高效降解菌的生长条件进行优化 ; 同时分析降解阶段其主控因素 旨为在低温条件下利用微生物修复技术治理 PAHs 污染提供优良菌株资源 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品采集土样取自黑龙江省大庆市红岗区图强西街油田石油污染土壤表层 (0-10 cm), 地理 坐标为 : 纬度 46.517, 经度 14.945595 采用五点采样法取样后带回实验室, 过 0 mm 筛, 保存于 4 冰箱 1.1. 主要培养基 LB 液体培养基 : 蛋白胨 10 g, 酵母膏 5 g, 氯化钠 10 g, 蒸馏水 1 000 ml,ph 7.0, 1 10 5 Pa 灭菌 0 min LB 固体培养基 : 蛋白胨 10 g, 酵母膏 5 g, 氯化钠 10 g, 琼脂 15-0 g, 蒸馏水 1 000 ml,ph 7.0,1 10 5 Pa 灭菌 0 min 牛肉膏蛋白胨培养基 : 牛肉膏 3 g, 蛋白胨 10 g, 氯化钠 5 g, 琼脂 15-0 g, 蒸馏水 1 000 ml,ph 7.0-7.,1 10 5 Pa 灭菌 0 min 柠檬酸盐实验培养基 :NH 4 H PO 4 1 g,k HPO 4 1 g,nacl 5 g,mgso 4 0. g, 柠檬酸钠 g, 琼脂 15-0 g, 蒸馏水 1 000 ml,1% 溴香酚蓝乙醇溶液,10 ml,1 10 5 Pa 灭菌 0 min 无机盐培养基: (NH 4 ) SO 4 0.5 g,na HPO 4 H O 3.5 g,mgcl 6H O 0.1 g,ca(no 3 ) 4H O 0.05 g,kh PO 4 1 g, 蒸馏水 1 000 ml,1 10 5 Pa 灭菌 0 min 萘 - 无机盐培养基 : 将萘溶解于正己烷溶液, 待正己烷完全挥发, 萘晶体析出后, 加入预先灭菌的无机盐培养基均匀混合 1. 方法 1..1 低温降解菌驯化 分离及筛选方法微生物的驯化过程是通过人为措施使得微生物逐步适应某种环境, 最后获得具有较高耐受力和活力的菌株 萘对菌体有一定的毒害作用, 最大污染物浓度驯化法使得能够适应该污染物浓度的菌株存活下来, 并随着驯化的进行渐渐适应该环境而进行生长繁殖 取 5 g 土样装入含有 00 ml 萘 - 无机盐培养基 ( 萘浓度 00 mg/l) 的锥形瓶中,10,10 r/min 振荡培养,7 d 后观察培养液变化 按体积 10% 的接种量转接到新鲜萘 - 无机盐培养基中, 萘浓度增加至 400 mg/l, 此后, 萘的质量浓度按 600 800 1 000 mg/l 逐步提升 吸取 5 代培养液采用稀释涂布法分离纯化, 选择菌落生长较好的菌株在萘 - 无机盐固体培养基上划线复筛,-80 甘油保存 1.. 萘降解率的测定 1...1 菌悬液的制备将所得菌株接入 LB 液体培养基中,10 10 r/min 振荡培养, 选择对数期菌株离心收集细菌 (10 000 r/min,6 min), 用无菌水
10 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 019,Vol.35,No.7 重复冲洗 3 次, 用无机盐培养基将菌悬液调节至所需菌浓度 1... 菌株对萘的降解将所得菌株接入 00 ml 的萘 - 无机盐液体培养基 ( 萘浓度为 300 mg/l) 中, 在 10 10 r/min 下振荡培养,3 个重复, 设立不接菌液为对照组 4 h 取样一次 取样吸取 5 ml 样品加入装有 g 氯化钠和 5 ml 正己烷溶液的离心管中, 用旋涡混合器混匀 min, 离心 (5 000 r/min,5 min), 转移上清液正己烷层至玻璃小瓶中 再用 5 ml 正己烷重复上述萃取过程后, 合并上清液用无水 Na SO 4 脱水,30 旋转蒸发, 氮吹 1 ml 以下, 正己烷定容至 1 ml, 待测 Agilent 7890/5975C-GC/MSD 检测程序设定 : 进样口温度 80, 分流进样, 载气 : 氦气 ( 高纯 ), 流量 1 μl/min( 恒流 ), 进样量 :1.0 μl, 色谱柱 DB5-MS(15 m 0.5 mm,0.1 μm), 升温程序 : 80, 保持 min ; 以 0 /min 升至 180, 保持 5 min ; 再以 10 /min 速率升至 40, 保持 5 min 质谱条件 : 离子源温度 离子化能量 接口温度 四极杆温度分别为 30 70 ev 80 和 150, 溶剂延迟 5 min, 离子检测 (SIM) 模式 1...3 萘的标准曲线萘储备液按照梯度稀释, 分别稀释配制成浓度为 0 mg/l 40 mg/l 60 mg/l 80 mg/l 和 100 mg/l 的溶液 用气相色谱 - 质谱法测定萘各浓度时对应的峰面积, 以萘各梯度标准液浓度为 X, 对应的峰面积为 Y, 制作萘标准线 Y=613.9X-7146.4, 标准曲线 R =0.999 1..3 低温降解菌的鉴定 1..3.1 形态学观察及生理生化特征所得菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基中,10 培养 7 d, 在光学显微镜下观察细胞形态 菌体大小 生理生化实验结果参照鉴定手册 [19] 1..3. 16S rdna 基因序列测定与系统进化关系的分析利用细菌基因组提取试剂盒 (HaiGene,B0135) 提取细菌 DNA, 并利用引物 8F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 和 149R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') 对细菌 16S rdna 基因进行 PCR 扩增 50 μl 扩增体系为 :DNA 模板 μl,super Taq DNA Polymerase 0.5 μl,10 Hi PCR Buffer 5.0 μl dntp Mixture 4.0 μl,pcr Forward Primer(10 μmol/l) 和 PCR Reverse Primer(10 μmol/l) 各 PCR Reverse Primer(10 μmol/l),ddh O Up to 50 μl PCR 扩增程序为 :94 5 min ;94 30 s ;51 1 min 30 s,7 min 30 s,30 个循环 ; 7 10 min 经筛选后的菌株送至哈尔滨瑞博兴科生物技术有限公司完成 16S rdna 测序工作 通过 MEGA 7.0 软件 Alignment 中的 CLUSTAL W 对目的序列和参考序列进行比对, 根据比对结果选择 Bootstrap test of phylogeny 并用 Neighbor-joining 构建系统发育树 1..4 降解菌生长曲线的测定将所得菌株接入 00 ml 的 LB 液体培养基中,10 10 r/min 振荡培养,4 h 取样 1 次,3 个重复, 设立不接菌液为对照组 () 用 UV759CRT 紫外分光光度计测吸光值 (OD 600 ) 表示菌株的生长量 1..5 降解菌培养条件的优化萘 - 无机盐液体培养基作为基础培养基, 对萘浓度 培养温度 初始 ph 培养转数进行单因素试验, 测量菌液 OD 600 在单因素试验基础上, 添加时间因素, 按正交试验 L 18 (3 5 ) 五因素三水平共 18 组试验对菌株摇瓶培养条件进行优化, 每组 3 个重复 1..6 数据处理利用 IBM SPSS Statistics 0.0 统计软件对实验结果进行统计学分析 结果.1 低温萘降解菌的筛选从黑龙江省大庆油田附近污染土壤中, 采用污染物浓度驯化法进行菌株的驯化 在驯化后期以萘为唯一碳源 (1 000 mg/l) 富集体系中初筛, 富集过程初始溶液为无色, 从 d 开始有显色变化, 变为橙色, 颜色逐渐加深 富集体系结束后将富集液采用稀释涂布法涂 LB 培养基平板, 选择菌落生长较好的菌株在萘 - 无机盐固体培养基中复筛, 最终得到 5 株以萘为唯一碳源生长的低温菌株. 低温萘降解菌降解能力的结果与分析对 5 株低温萘降解菌在萘 - 无机盐液体培养基 ( 萘浓度 300 mg/l) 中培养 10 d, 萘的降解情况测定如图 1 所示 1 号菌对萘污染物的毒性适应能力较强, 呈匀速上升趋势, 具有较好的降解能力 号菌初期能较快降解萘,7 h 之后降解速率下降, 降
103 郭亚男等 低温萘降解菌的筛选 鉴定及降解条件优化 019,35(7) 表1 解率增长缓慢 3 号和 4 号菌各阶段降解趋势基本 和 降解菌的形态及生理生化特征 保持一致 相对于其他菌株具有更强的降解能力 形态 / 生理生化特征 降解速度从培养初期即开始上升 第 1 天至 3 天上 菌落颜色 肉黄 白 圆形 边缘整齐 圆形 边缘整齐 表面 表面湿润 微微隆 湿润 隆起 边缘透明 升得最快 3 d 后上升的速度减缓 与培养初期相 比 4 d 内在添加 3 号菌和 4 号菌的处理中 在对照 菌落形态 起 无褶皱 无褶皱 组非生物因素影响基础上 萘的降解率达 94.43% 和 革兰氏染色 阴性 阴性 95.47% 在耐受能力和降解速度方面具明显优势 5 芽孢 - - 号菌相比较于其他菌株适应能力较慢 但经过一定 时间后 降解率持续增加 根据不同菌株在低温条 荚膜 鞭毛 柠檬酸盐 蓝 蓝 接触酶 3 号和 4 号菌作为下一步研究对象进行研究 并将 3 氧化酶 号 4 号菌命名为 和 淀粉水解 - - 件下对萘的适应能力以及自身生长状况 最终选择 Degradation rate/% 100 80 注 和 - 分别表示反应呈阳性和阴性 1 3 4 5 h 细胞数量急剧增加 处于对数生长期 60 h 后 随着培养基中各种物质的消耗 细菌细胞密度变化 不大 细菌进入稳定期 其中 生物量略高于 60.5 40 菌株 和 培养条件单因素优化 结果 0 0 见图 4 和 最优单因素培养条件均为 萘 4 6 8 10 t/d 图1.3 菌株和培养条件优化 不同低温萘降解菌降解能力测定 低温萘降解菌的鉴定 采用形态观察及生理特性对 和 菌株 初步鉴定 结果见表 1 菌株 和 系统发育树结果如图 所示 无机盐培养基 萘浓度 300 mg/l ph 7.0 培养温 度 10 培养转数 10 r/min 根据单因素试验结果 选择合适的因素和水平 表 按正交试验 L18 35 对菌株 摇 瓶培养条件进行优化 所得数据应用 SPSS 0.0 进 行方差分析 菌株 结果见表 3 各因素各水平 之间差异显著 说明各个因素之间具有交互作用 5 个因素对菌株 生长影响的强弱顺序为 培养时 根据 16S rdna 序列同源性比对 和 皆与 间 培养转数 培养温度 初始 ph 萘浓度 水 假单胞菌属 Pseudomonas sp. 同源性最近 序列 平之间差异显著 进行多重比较 结合单因素统计 相似性均高达 99% 综合菌株的形态观察 生理 量表 未给出 可得 的最佳摇瓶培养条件组 生化特性及 16S rdna 序列比对分析 可确定 合为 A3B3C1D3E3 即萘浓度 300 mg/l 培养温度 和 均属于假单胞菌属 和 所测序列 15 初始 ph 6.0 培养转数 180 r/min 培养时间 7 d 提交到 GenBank 数据库 获 得 序 列 登 录 号 分 别 为 在 此 条 件 下 萘 的 去 除 率 达 到 99.1% 菌 株 结 MK08705 和 MK08706 果见表 4 同理 5 个因素对菌株 生长影响的.4 低温萘降解菌的生长曲线 强弱顺序为 培养转数 培养温度 培养时间 初 菌株 和 的生长曲线见图 3 株菌均 始 ph 萘浓度 的最佳摇瓶培养条件组合为 适宜在 LB 液体培养基中生长 从接种到 A3B3C1D3E3 即萘浓度 300 mg/l 培养温度 15 第 8 小时细菌生长缓慢 延滞期较短 从 8 h 到 60 初始 ph 6.0 培养转数 180 r/min 在此条件下 萘
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 104 019,Vol.35,No.7 Pseudomonas trivialis strain BIHB 747 DQ536517.1 88 Pseudomonas poae strain BIHB 730 64 100 Pseudomonas antarctica CMS 35 Pseudomonas veronii INA06 0 Pseudomonas migulae Pseudomonas tolaasii 49 40 100 Pseudomonas corrugata Pseudomonas lini strain CFBP 5737 99 Pseudomonas frederiksb ergensis strain OS11 97 Pseudomonas sp. PS-7(014) 97 99 Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca ISSDS-59 100 Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca NCIB 10068 Pseudomonas taetrolens 图 基于 16S rdna 基因序列同源性的 和 系统发育树 表3.0 OD600 1.5 1.0 0.5 0.0 4 48 7 96 10 t/h 图3 降解菌株生长曲线 正交试验的方差分析 源 III 型平方和 df 均方 F Sig. 校正模型 0.468a 1 0.039 33.01 截距 4.855 1 4.855 4106.77 萘浓度 0.05 0.01 10.37 培养温度 0.08 0.041 34.635 初始 ph 0.046 0.03 19.397 培养转数 0.157 0.078 66.198 培养时间 0.159 0.080 67.453 重复 5 0.073 0.930 误差 0.048 41 0.001 总计 5.371 54 校正的总计 0.517 53 的去除率达到 99.8% 表4 正交试验的方差分析 源 III 型平方和 df 均方 F Sig. 校正模型 0.658a 1 0.055 7.370 截距 4.486 1 4.486 38.194 萘浓度 A 温度 B ph C 转速 D 培养时间 E 萘浓度 0.059 0.09 14.611 1 150 mg/l 5 6 90 r/min d 培养温度 0.163 0.081 40.639 00 mg/l 10 7 10 r/min 3d 培养 ph 0.091 0.046.795 3 300 mg/l 15 8 180 r/min 7d 培养转数 0.49 0.15 6.33 培养时间 0.096 0.048 3.93 重复组 5 0.005 0.017 0.984 误差 0.08 41 0.00 总计 5.7 54 校正的总计 0.741 53 表 水平 3 正交试验环境因素和水平的设计 因素 讨论 微生物修复技术已成为人们选择去除环境中萘 的首要办法和手段 筛选出能够降解萘的菌株是该
019,35(7) 郭亚男等 : 低温萘降解菌的筛选 鉴定及降解条件优化 105 OD 600 0.5 0.4 0.3 0. OD 600 0.30 0.5 0.0 0.15 0.10 0.1 0.05 0.0 50 100 150 00 300 c/ mg L -1 0.00 5 6 7 8 9 ph 0.35 0.30 0.35 0.30 0.5 0.5 OD 600 0.0 0.15 OD 600 0.0 0.15 0.10 0.10 0.05 0.05 0.00 0.00 0 5 10 15 0 0 90 10 150 180 Temperature/ Rotational Speed/ r min -1 图 4 不同培养条件对菌株 生长的影响 技术的关键环节 [0] 大量研究表明多个菌属的细菌 可对多数有机物进行降解, 尤其是假单胞菌属, 如 [1] 孟建宇等从乌梁素海水中筛选出一株假单胞菌, 在 10 d 内可降解质量浓度为 3.5 g/l 的萘 但是目前研究多数萘的降解菌最适生长温度通常为 5-37, 低温萘降解菌的研究却鲜见报道 本研究对筛选出的低温萘降解菌测定其降解效率时发现, 在未加菌液的对照组中, 萘的浓度也有所降低, 在控制其他环境因素 ( 萘浓度 温度 ph 和转数 ) 一致的情况下, 可能是由于在降解过程中体系不是完全的密闭以及在取样过程中的挥发所造成的 ; 同时在降解过程中可能存在光化学降解,Bertilsson [] 对淡水中多环芳烃的光化学降解及其对细菌生长的影响 - 水化学的影响进行研究, 结果发现 : 在实验期间, 观察到存在光化学诱导所致的萘消耗, 因此萘可能会发生光降解, 此实验萘的光降解速率实验结果与本实验对照组中可能由于光降解产生的降解结果类似 综合这两方面, 可能是本实验对照组降解率略高的原因 有关多环芳烃降解菌降解效率的研究, 多数在 实验中没有加入空白组对照, 这可能也是日后研究需要关注的地方 在低温条件下 和 可以快速降解萘, 在对照组非生物因素影响基础上, 萘 (300 mg/l) 的降解率在 4 d 内达到 94.43% 和 95.47%, 在耐受能力和降解速度方面具明显优势 为低温条件下利用微生物修复技术治理 PAHs 污染提供了优良菌株资源, 同时降解动态研究曲线也为菌株投入实际应用提供了时间参比 东北地区是我国重要的老工业基地之一, 能源消耗较大, 各类燃料的燃烧效率较低, 且气候寒冷, 取暖期漫长, 常温菌无法发挥降解作用, 由此产生的萘污染以及自然过程和人为过程导致土壤酸化问题日益严重 [3-5] 在过去的 0 年中国土壤 ph 平均下降 0.5 个单位 [6] 污染和酸化已成为土壤生态系统的两大威胁 本研究富集筛选出的菌株 能在低温 (0-15 ) 偏酸 (ph 6.0) 和萘质量浓度为 50-300 mg/l 的条件中正常生长 因此, 菌具有较好的研究价值和应用前景 正交试验设计 (Orthogonal experimental design)
106 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 019,Vol.35,No.7 是研究多因素多水平的一种设计方法 正交试验设 [7] 计多用于培养条件的优化, 如 Qingmiao 等采用正交试验对 E 降解菌降解条件进行优化, 针对低温萘降解菌培养条件的优化, 目前尚未见相关研究报道 本研究在低温萘降解菌单因素试验结果的基础上, 利用正交试验设计对萘 - 无机盐培养基中萘浓度 培养温度 初始 ph 培养转数 培养时间 5 个因素进行优化, 所得数据应用 SPSS 0.0 进行方差分析 正交试验结果与单因素试验结果存在差异, 因各因素之间存在着交互作用, 正交试验结果更具有说服力, 利用正交设计筛选组合结果可靠, 方法可行 同时降解菌株的生长与五因素均有显著关系, 利用正交试验分析影响萘降解的主控因素, 在实际土壤萘污染治理过程中, 依据环境因素, 合理选择菌株并优化调控手段实现土壤萘污染高效修复 4 结论 (1) 从黑龙江省大庆油田地区污染土壤筛选出 株在低温条件下高效降解萘的菌株, 编号为 和 在对照组非生物因素影响基础上, 萘 (300 mg/l) 的降解率在 4 d 内达到 94.43% 和 95.47%, 显示出在低温条件下较强降解萘的能力 () 菌株 和 经形态观察 生理生化特性和 16S rdna 基因序列鉴定皆属于假单胞菌属 (Pseudomonas) (3) 菌株 和 的最佳培养条件均为 : 萘 - 无机盐培养基 ( 萘浓度 300 mg/l), 培养温度 15, 初始 ph 6.0, 培养转数 180 r/min, 培养时间 7 d, 去除率分别达到 99.1% 和 99.8% (4) 菌株的生长与五因素均有显著关系 在实际土壤萘污染治理过程中, 依据菌株降解最适条件, 优化调控手段实现土壤萘污染高效修复 参考文献 [1]Neelam M, Supriya K, Surajit D. Marine bacterial biofilms in bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons(pahs)under terrestrial condition in a soil microcosm[j]. Pedosphere, 017, 7 (3):548-558. []Chibwe L, Davie-Martin CL, Michael DA, et al. Identification of polar transformation products and high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons(pahs)in contaminated soil following bioremediation[j]. Science of The Total Environment, 017, 599 :1099-1107. [3]Amanda JW, Nina AD, Marie EH, et al. Urinary and breast milk biomarkers to assess exposure to naphthalene in pregnant women :an investigation of personal and indoor air sources[j]. Environmental Health, 014, 13(1):30. [4]Weiming L, Dongsheng W, Feng H, et al. Exogenous IAA treatment enhances phytoremediation of soil contaminated with phenanthrene by promoting soil enzyme activity and increasing microbial biomass[j]. Environmental Science And Pollution Research, 016, 3(11):10656-10664. [5] 刘增俊, 滕应, 黄标, 等. 长江三角洲典型地区农田土壤多环芳烃分布特征与源解析 [J]. 土壤学报, 010, 47(6):1110-1111. [6] 于洋洋, 王广智, 王卓然, 等. 萘好氧降解污泥强化培养特性与降解效能研究 [J]. 环境科学与技术, 017, 40(8):18-133. [7]Monica RC, Lucia G, Simone B, et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-contaminated soils :bioaugmentation of autochthonous bacteria and toxicological assessment of the bioremediation process by means of Vicia faba L. [J]. Environmental Science and Pollution Research, 016, 3(8):7930-7941. [8]Denk P, Velasco SC, Buettner A. Resolving the chemical structures of off-odorants and potentially harmful substances in toys-example of children s swords[j]. Anal Bioanal Chem, 017, 409(): 549-558. [9] 夏文迪. 多环芳烃 (PAHs) 人体内暴露剂量与致癌风险研究 [D]. 长沙 : 中南大学, 014. [10]Liu J, Xiang Y, Zhang Z, et al. Inoculation of a phenanthrenedegrading endophytic bacterium reduces the phenanthrene level and alters the bacterial community structure in wheat[j]. Applied Microbiology and Biotechnology, 017, 101(1):5199-51. [11] 田兆雪, 刘雪华. 环境中多环芳烃污染对生物体的影响及其修复 [J]. 环境科学与技术, 018, 41(1):79-89. [1]Couling NR, Towell MG, Semple KT. Biodegradation of PAHs in soil :influence of chemical structure, concentration and multiple amendment[j]. Environmental Pollution, 010, 158 :3411-340. [13]Hesham A, Mawad AM, Mostafa YM, et al. Study of enhancement
019,35(7) 郭亚男等 : 低温萘降解菌的筛选 鉴定及降解条件优化 107 and inhibition phenomena and genes relating to degradation of petroleum polycyclic aromatic hydrocarbons in isolated bacteria[j]. Microbiology, 014, 83 :599-607. [14]Saranya K, Palanisami T, Surender S, et al. Polycyclic aromatic hydrocarbons(pahs)degradation potential, surfactant production, metal resistance and enzymatic activity of two novel cellulose-degrading bacteria isolated from koala faeces[j]. Environmental Earth Sciences, 017, 76 :14. [15]Jesús L, Francisco MM, José AR, et al. Bacterial chemotaxis towards aromatic hydrocarbons in Pseudomonas[J]. Environmental Microbiology, 011, 13(7):1733-1744. [16]Mangwani N, Kumari S, Das S. Effect of synthetic N-acylhomoserine lactones on cell-cell interactions in marine Pseudomonas and biofilm mediated degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons[j]. Chemical Engineering Journal, 016, 30 : 17-186. [17]Zhang YX, Tao S. Seasonal variation of polycyclic aromatic hydrocarbons(pahs)emissions in China[J]. Environmental Pollution, 008, 156(3):657-663. [18] 马万里. 我国土壤和大气中多环芳烃分布特征和大尺度数值模拟 [D]. 哈尔滨 : 哈尔滨工业大学, 010. [19]Buchanan RE, Gibbens NE, Murray RG, et al. 伯杰细菌鉴定手册 [M]. 北京 : 科学出版社, 1984. [0]Rockne KJ, Strand SE. Anaerobic biodegradation of naphthalene, phenanthrene, and biphenyl by a denitrifying enrichment culture[j]. Water Research, 001, 35(1):91-99. [1] 孟建宇, 张阳, 李蘅, 等. 萘降解菌的分离 鉴定及降解特性的研究 [J]. 中国酿造, 017, 36():58-63. []Bertilsson S, Widenfalk A. Photochemical degradation of PAHs in freshwaters and their impact on bacterial growth - Influence of water chemistry[j]. Hydrobiologia, 00, 469. 1 : 3-3. [3]Wu YC, Zeng J, Zhu QH, et al. ph is the primary determinant of the bacterial community structure in agricultural soils impacted by polycyclic aromatic hydrocarbon pollution[j]. Scientific Reports, 017, 7 :40093. [4]Guo JH, Liu XJ, Zhang Y, et al. Significant acidification in major Chinese croplands[j]. Science, 010, 37 :1008-1010. [5]Ping LF, Luo YM, Zhang HB, et al. Distribution of polycyclic aromatic hydrocarbons in thirty typical soil profiles in the Yangtze River Delta region, east China[J]. Environmental Pollution, 006, 147 :358-365. [6] 周晓阳, 周世伟, 徐明岗, 等. 中国南方水稻土酸化演变特征及影响因素 [J]. 中国农业科学, 015, 48(3):4811-4817. [7]Yu QM, Wang P, Liu DB, et al. Degradation characteristics and metabolic pathway of 17β-estradiol(E)by Rhodococcus sp. DS01[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 016, 1 (6):804-813. ( 责任编辑狄艳红 )