说明书 Pierce 直接 IP( 免疫沉淀 ) 试剂盒 26148 2121.6 货号描述 26148 Pierce 直接 IP 试剂盒, 包含足够进行 50 次免疫沉淀反应的试剂 ( 每次使用 10 μl 树脂固相化抗体 ) 试剂盒组分 : 加强型 AminoLink 偶联树脂,2 ml 固相树脂以 50% 的浆液形式提供 ( 例如,100 μl 50% 的浆液含有 50 μl 固相树脂 ) 20 交联缓冲液,25 ml, 使用时稀释至 :0.01M Na 3 PO 4,0.15M NaCl;pH 7.2 氰基硼氢化钠溶液 (5 M),0.5 ml 淬灭缓冲液,50 ml,1m Tris-HCl 洗涤缓冲液,60 ml,1m NaCl IP 裂解 / 洗涤缓冲液,2 50 ml,0.025m Tris,0.15M NaCl,0.001M EDTA,1% NP-40, 5% 甘油,pH 7.4 100 条件缓冲液,5 ml, 中性 ph 缓冲液 20 Tris- 缓冲盐溶液,25 ml, 使用时稀释至 0.025M Tris,0.15M NaCl;pH 7.2 洗脱缓冲液,50 ml,ph 2.8, 含有伯胺非还原型泳道标记上样缓冲液,(5 ), 5 ml,0.3m Tris-HCl,5% SDS,50% 甘油, 泳道标记示踪染料 ;ph 6.8 Pierce 离心柱 - 带螺帽,100 个柱子, 包含相应配件微量离心收集管,2 ml, 100 个微量离心样品管,1.5 ml, 50 个 Pierce 对照用琼脂糖树脂 (4% 琼脂糖珠交联 ),2 ml 固相树脂以 50% 的浆液形式提供 ( 例如,100 μl 50% 的浆液含有 50 μl 固相树脂 ) 储存 : 收到试剂盒后将其储存于 4 C 将 DSS 于 4 C 干燥保存 常温运输 产品简介 Thermo Scientific Pierce 直接 IP 试剂盒通过将纯化的抗体直接固定于琼脂糖介质, 从而使抗原高效 快捷地发生免疫沉淀反应 固定化抗体提供了更快速 更简捷的免疫沉淀方法, 同时固定化的抗体可以重复使用, 且纯化的抗原可避免抗体的干扰 该试剂盒通过简单的固定化操作, 可用少于 10 μg 抗体完成免疫沉淀反应 当抗体与 Thermo Scientific Pierce AminoLink 偶联树脂结合后, 将抗原样品与固定化的抗体共同孵育形成免疫复合物 洗涤免疫复合物去除未结合的杂质, 然后用低 ph 的洗脱缓冲液将与抗体结合的抗原洗脱 与传统方法相比, 直接 IP 试剂盒使用胺基活化的介质, 不包含蛋白 A 或蛋白 G, 也不需要交联剂做共价固定 因此, 该方法可以结合任何含有伯胺的分子, 而不要求与蛋白 A 或蛋白 G 强烈结合的特定抗体种类或亚型 试剂盒包含获得高抗原产量的优化缓冲液, 以及最大程度减少处理和混合时间的高效离心柱和收集管
重要产品信息 抗体溶液中的伯胺 ( 如,Tris, 甘氨酸 ), 会竞争性地结合树脂上的位点 在交联反应之前, 使用 Thermo Scientific Zaba 脱盐离心柱或 Slide-A-Lyzer 透析卡去除伯胺 明胶或抗体溶液中的载体蛋白会竞争性的结合树脂上的位点 用 Thermo Scientific Pierce 抗 体纯化试剂盒 ( 货号 :44600) 去除明胶和载体蛋白, 或者使用蛋白 A / G 进行纯化 ( 货号 : 20423) 及透析 在室温下进行抗体交联 在 4 下进行细胞裂解和抗原 IP 树脂的所有离心步骤需在低速 ( 如 1000 g) 30-60 秒条件下操作 离心速度大于 5000 g 可能会导致树脂聚集, 难以重悬 离心柱离心过程中, 使用 2 ml 收集管时流穿液体的体积应不超过 600 μl, 使用 1.5 ml 的收 集管时则应不超过 300 μl 体积超出可能导致柱内产生回压及洗涤和洗脱不完全 IP 裂解 / 洗涤缓冲液已进行过代表性细胞类型的检测, 包括但不限于下列细胞系 : HeLa, JURKAT,A431,A549,MOPC,NIH 3T3 和 U2OS 通常情况下,10 6 的 HeLa 细胞可以产生约 10 mg 的细胞团块, 按照 ~3 μg/μl 的配比使用 IP 裂解 / 洗涤缓冲液 ( 即 100 μl IP 裂解 / 洗涤缓冲液可以裂解 ~300 μg 细胞团块 ) 为了获得最佳结果, 可添加 Thermo Scientific Halt 蛋白酶 ( 货号 :78429) 和磷酸酶 ( 货号 : 78420) 抑制剂混合物, 以尽量减少细胞裂解液中蛋白质的降解和去磷酸化 IP 裂解 / 洗涤缓冲液可兼容 Thermo Scientific Pierce BCA 蛋白定量分析试剂盒 ( 货号 :23225) 设置合理的对照对于鉴定相关的相互作用至关重要 试剂盒提供的 Pierce 对照用琼脂糖树 脂是用作 Pierce 蛋白 A / G 琼脂糖树脂的相似载体材料, 可以作为阴性对照 Pierce 离心柱包含有离心柱, 螺旋盖, 底盖, 带有 Luer-Lok 接头的螺旋帽, 大的垫片和一个大垫片工具 标准的 IP 不需要大的垫片 当等比例扩大体积 ( 例如, 树脂 > 200 μl) 时, 可以插入大的垫片以方便洗涤 带有 Luer-Lok 接头的螺旋帽有可翻盖的顶部, 可以在洗涤步骤中使用 储存过程中可用螺旋盖密封离心柱 ( 见补充信息部分 ) 其他所需材料 微量离心收集管,2 ml
Pierce 直接 IP 试剂盒的操作流程 A. 将抗体与 AminoLink 偶联树脂交联 注 : 以下操作方案适用于在不含有伯胺 ( 如,Tris, 甘氨酸 ) 和载体蛋白 ( 详见重要产品信息部分 ) 的缓冲液中交联 2-10 μg 亲和纯化的抗体 此方案可根据需要按比例放大 ; 详见补充信息部分关于抗体和树脂的建议用量 1. 将 AminoLink 偶联树脂和试剂平衡至室温 2. 用超纯水稀释 20 交联缓冲液, 每个 IP 反应需 2 ml 1 交联缓冲液 3. 轻旋 AminoLink 偶联树脂的瓶子, 以获得均一的悬浮液 使用大口径或截短枪头将 20 μl 树脂浆液加入 Pierce 离心柱中 将柱子置于一个微量离心管中,1000 g 离心 1 分钟, 弃掉流穿液体 4. 用 200 μl 1 交联缓冲液洗涤树脂两次, 离心并且弃掉流穿液体 5. 在纸巾上轻拍离心柱的底部以去除剩余的液体, 插入底盖 6. 准备 2-10 μg 亲和纯化的抗体做交联反应 用超纯水和 20 交联缓冲液 ( 终浓度为 1 交联缓冲液 ) 将抗体稀释至 200 μl 体积 例如,20 μl 抗体, 添加 10 μl 20 交联缓冲液和 170 μl 的超纯水 可以直接将超纯水 20 交联缓冲液和亲和纯化的抗体添加到含有树脂的离心柱中 7. 在通风橱中, 向每 200 μl 的反应体系中加入 3 μl 的氰基硼氢化钠溶液 注 : 氰基硼氢化钠有剧毒 须戴上手套小心操作 8. 盖上螺旋盖, 在室温条件下于旋转器或混匀器上孵育 90-120 分钟, 确保浆液在孵育过程中处于悬浮状态 9. 卸下并保留底塞, 拧松螺旋帽 将离心柱放置与收集管中并离心 保存流穿液体以验证抗体结合效率 10. 取下螺旋盖, 加入 200 μl 1 交联缓冲液, 离心并弃掉流穿液体 重复上述操作一次 11. 向离心柱中加入 200 μl 的淬火缓冲液, 离心并弃掉流穿液体 12. 在纸巾上轻拍离心柱的底部以去除剩余的液体, 插入底盖 向树脂中加入 200 μl 淬灭缓冲液 13. 在通风橱中, 向离心柱中加入 3 μl 氰基硼氢化钠溶液并盖上螺旋帽 轻轻摇动或上下颠倒混匀, 孵育 15 分钟 14. 卸下底塞, 拧松螺旋帽 将离心柱放回收集管中, 离心并弃掉流穿液体 15. 取下螺旋帽, 用 200 μl 1 交联缓冲液洗涤树脂两次, 每次洗涤之后均需离心
16. 用 150 μl 洗涤缓冲液洗涤树脂六次, 每次洗涤之后均需离心 17. 或者继续进行免疫沉淀 ; 或者储存树脂, 进行到下一个步骤 18. 用 200 μl 1 交联缓冲液洗涤树脂两次, 每次洗涤之后离心 19. 在纸巾上轻拍离心柱的底部以去除剩余的液体, 插入底盖 加入 200 μl 1 交联缓冲液, 盖上螺旋盖, 于 4 储存 如需长期存储, 添加叠氮化钠至终浓度为 0.02% B. 哺乳动物细胞裂解方案 I: 裂解单层细胞 ( 贴壁 ) 培养物 1. 小心去除细胞中的培养基 2. 用 PBS 清洗细胞一次 3. 将冰上预冷的 IP 裂解 / 洗涤缓冲液加入细胞中 ( 表 1) 冰上孵育 5 分钟并定期混匀 表 1. 不同标准的细胞培养皿 / 板中 IP 裂解 / 洗涤缓冲液的建议添加量 培养皿 / 板的尺寸或表面积 IP 裂解 / 洗涤缓冲液体积 100 100 mm 500-1000 µl 100 60 mm 250-500 µl 6- 孔板 200-400μL 每孔 24- 孔板 100-200μL 每孔 4. 将细胞裂解液转移到微量离心管中, 13000 g 离心 10 分钟以沉淀细胞碎片 5. 将上清转移到一个新的微量离心管中用于进行蛋白浓度测定和后续分析 方案 II: 裂解悬浮细胞培养物 1. 将细胞悬浮液在 1000 g 下离心 5 分钟以沉淀细胞 弃掉上清 2. 将细胞团块用 PBS 重悬洗涤一次 1000 g 离心 5 分钟再次沉淀细胞 3. 将冰上预冷的 IP 裂解 / 洗涤缓冲液加到细胞团块中 每 50 mg 湿重细胞团块加入 500 μl IP 裂解 / 洗涤缓冲液 ( 即 10:1 体积 / 质量 ) 如果裂解大量细胞, 可首先添加 10% 终体积的 IP 裂解 / 洗涤缓冲液到细胞团块中, 用移液管 / 移液器上下吹打细胞团块以混匀, 然后再向细胞悬浮液中添加剩余的 IP 裂解 / 洗涤缓冲液 4. 将细胞裂解液在冰上孵育 5 分钟并定期混匀 13000 g 离心 10 分钟去除细胞碎片 5. 将上清转移到一个新的微量离心管中用于进行蛋白浓度测定和后续分析 C. 使用对照琼脂糖树脂预处理细胞裂解液 1. 对于 1 mg 的细胞裂解液, 添加 80 μl 对照用琼脂糖树脂浆液 (40 μl 固相树脂 ) 到离心柱中 2. 将柱子离心去除贮存储缓冲液
3. 将 100 μl 0.1M Na 3 PO 4,0.15M NaCl; ph 7.2 缓冲液加入离心柱中, 离心并弃掉的流穿液体 4. 将 1 mg 的细胞裂解液加入含有树脂的离心柱中, 并在 4 下孵育 30 分钟至 1 小时, 同时温和地翻转柱子以混匀 5. 1000 g 离心柱子 1 分钟, 弃掉含有树脂的离心柱, 保留流穿液体, 以备加入到固定的抗体中 D. 抗原免疫沉淀的通用操作流程注 : 样品用量和孵育时间取决于每个特定的抗体 - 抗原体系, 并且可能需要优化方案使产量最大化 1. 卸下底盖, 拧松螺旋帽并将含有抗体交联树脂离心柱置于收集管中, 离心以去除贮存缓冲液 弃掉流穿液体 2. 去掉螺旋盖, 将离心柱放回收集管中 用 200 μl 预冷的 IP 裂解 / 洗涤缓冲液洗涤树脂两次 每次洗涤之后弃掉流穿液体 3. 在纸巾上轻拍离心柱的底部以去除剩余的液体, 插入底盖 4. 用 IP 裂解 / 洗涤缓冲液稀释细胞抽提物 离心柱中建议的样品体积为 300-600 μl 每个 IP 反应总蛋白建议量是 500 1000 μg, 可使用 Pierce BCA 蛋白定量试剂盒测定 5. 将样品加入含有抗体 - 交联树脂的离心柱中 盖上螺旋盖温和地上下翻转混匀或在摇床上震荡孵育 1-2 小时或 4 过夜 6. 卸下底盖, 拧松螺旋帽并将离心柱置于收集管中 将柱子离心并保留流穿液体 在确定 IP 反应成功之前不要丢弃该液体 7. 拧下螺旋帽, 将柱子置于一个新的收集管中, 加入 200 μl 的 IP 裂解 / 洗涤缓冲液并离心 注 : 如需无去垢剂洗涤, 则有另一款洗涤缓冲液 (20 TBS 缓冲液 ) 提供 使用前请将该缓冲液稀释至 1 8. 用 200 μl IP 裂解 / 洗涤缓冲液洗涤树脂三次, 并且每次洗涤后均需离心 9. 用 100 μl 1 条件缓冲液洗涤树脂一次 E. 抗原洗脱注 : 为了中和低 ph 值的洗脱缓冲液 ( 例如, 为了进行下游的酶法或功能测定 ), 向收集管中加入 5 μl 1M Tris,pH9.5, 然后通过离心即可中和 ph 值 或者, 直接使用中性 ph 值的洗脱缓冲液 ( 如 : 温和洗脱缓冲液, 货号 :21027) 1. 将离心柱置于一个新的收集管中, 加 10 μl 洗脱缓冲液并离心
2. 将离心柱处于收集管中, 加 50 μl 洗脱缓冲液 在室温下孵育 5 分钟 该柱子无需盖上或者混匀 注 : 减少洗脱缓冲液的用量, 可获得浓度更高的洗脱液但可能会使总体产量减少 3. 将柱子离心并收集流穿的液体 分析洗脱液确定否含有抗原 需要的话, 可进行补充洗脱 ( 即, 步骤 F1 - F3) 单独分析每一份洗脱液, 以确保抗原被完全洗脱 4. 如需保持抗体交联树脂的活性, 立即进行 F 部分的操作, 即树脂的再生和储存 F. 树脂再生和存储 1. 将 100 μl 1 交联缓冲液加入离心柱中, 离心并弃掉流穿液体 重复此操作一次 2. 插入底塞, 将 200 μl 1 交联缓冲液加入离心柱中 重新盖上螺旋帽 用实验室封口膜包裹管子底部, 防止树脂变干 对于长期储存 ( 如,> 2 周 ), 添加终浓度为 0.02% 的叠氮化钠 G. SDS-PAGE 分析的样品制备 1. 将 5 泳道标记上样缓冲液平衡至室温 通过颠倒 5-10 次轻轻混合样品缓冲液 对于还原型凝胶, 在 5 上样缓冲液中添加 1M DTT, 至终浓度为 100 mm 2. 向样品中加入 5 上样缓冲液至终浓度为 1 ( 即将 5 μl 5 样品缓冲液加入 20 μl 样品中 ) 3. 在 95-100 下孵育样品约 5 分钟 在进行 SDS-PAGE 电泳之前将样品冷却至室温 常见问题及解决方案 问题可能的原因解决方案 在洗脱的抗原中检测出抗体 抗原没有被免疫沉淀 交联步骤后的洗涤没有将未结合的抗体去除干净使用还原剂 ( 如, DTT 或 β-me) 处理抗体交联的树脂, 还原抗体并将抗体片段洗脱, 或抗体片段没有与树脂共价结合样品中抗原含量较低而无法检测抗体没有与抗原结合 交联后增加洗脱缓冲液的洗涤次数使用不含有还原剂的缓冲液通过 SDS-PAGE 凝胶或 Western blot 检测蛋白的表达量或裂解液的裂解效率使用一个近源抗体或一个识别不同抗原表位的不同抗体 IP 裂解 / 洗涤缓冲液组份干扰抗原 - 抗用 1 Tris- 缓冲盐溶液进行免疫沉淀或者洗涤体的结合操作
抗原没有被洗脱 洗脱缓冲液没有破坏抗体 - 抗原的相互作用 优化洗脱条件 ( 见我们网站上的 #27 技术提示 ) 用下列方法洗脱抗原 : 将 100 μl 1 还原型 SDS 上样缓冲液加入离心柱中, 于 100 孵育 5-10 分钟, 加热过程中保持离心柱处于收集管中, 并且不带底塞和盖子 用一个高盐 中性 PH 的洗脱缓冲液重复免疫抗原在下游实验中没抗原对低 ph 非常敏感, 在洗脱过程沉淀实验, 比如温和洗脱缓冲液 ( 货号 : 有活性中失活 21027) * 在加入 SDS 样品缓冲液并加热抗体交联树脂之后, 树脂不能被重复使用而必须丢弃 补充信息 A. 大规模抗体结合 Pierce 直接 IP 操作方案可根据需要按比例扩大 表 2 中列出了按比例放大所需的抗体和树 脂的使用量 可根据需要调整相应的结合和洗涤试剂用量 表 2. 大规模的 IP 实验中赛默飞 Pierce AminoLink 偶联树脂和抗体的用量表抗体用量 (μg) 树脂浆液用量 (µl) 反应体系体积 (µl) 25-100 100 200 50-200 200 300 100-400 400 400 B. 关于下述事项的更多信息, 请访问我们的网站 : 技术提示 #27: 优化免疫亲和纯化实验中的洗脱条件 技术提示 #43: 蛋白质的稳定性和储存 技术提示 #40: 重力倍数 ( g) 和离心转子速度 (RPM) 之间的单位转换 C. Pierce 离心柱 Pierce 离心柱可容纳多达 900 μl 的液体 柱子可置于 1.5 ml 的或 2 ml 微量离心管中, 或与 Luer-Lok 接头 ( 见图 1) 连用, 使用注射器处理样品 当使用注射器时, 样品大小和洗涤 量只受限于注射器的容积 对于小体积树脂, 使用小的 预先插入的垫片即可 ( 图 2A) 需要 使用超过 100 μl 的树脂时, 使用大垫片, 可以放在柱子的顶部或底部 ( 图 2B 和 2C) 当树脂 的用量介于大 小两种垫片之间时 ( 图 2B), 树脂可能可以被重复使用 要从柱子中移除垫片, 可用拉直的曲别针, 从柱子底部插入, 将垫片推出 要插入垫片, 先将其置于柱内, 然后使用垫片推入工具将其推到相应的位置 要从顶端和底部都装了垫片的柱子中移除顶端的垫片, 可用拉直的曲别针挑起顶端的垫片, 然后可用镊子将其移出
图 1. Pierce 离心柱组件图 图 2. 垫片放置的三种形式 相关的赛默飞产品 78428 Halt Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail(Halt 一次性使用磷酸酶抑制剂混 合物 )(100 ), 100 μl 24 管 78430 Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (Halt 一次性使用蛋白酶抑制剂混合物 ) (100 ), 24 100µL 28348 20X Phosphate Buffered Saline(PBS 缓冲液 ),500 ml 69705 Pierce Spin Columns Screw Cap(Pierce 离心柱 带有 Luer-Loc 接头的螺旋盖 ), 25 个 / 包 69720 Pierce Microcentrifuge Tubes(Pierce 微量离心管 ),2 ml,72 个 / 包 69715 Pierce Microcentrifuge Tubes(Pierce 微量离心管 ),1.5 ml,72 个 / 包 21027 Gentle Ag/Ab Elution Buffer( 温和抗原 / 抗体洗脱缓冲液 ),ph 值 6.6,500 ml 21004 IgG Elution Buffer( IgG 洗脱缓冲液 ), 用于常规蛋白质亲和纯化的低 -ph 洗脱缓 冲液,1L Luer-Lok 是 Becton, Dickinson and Company 公司的注册商标 自产品文件 说明书和 / 或产品包装内所附文件 ( 文件 ) 中所说明的销售之日起, 本公司担保本产品 ( 产品 ) 的运行或性能完全符合已公布的产品说明书, 并且担保产品在材料和工艺上没有缺陷 除非另外以书面形式进行明确授权, 本产品仅可用于研究目的 本产品不适合应用于 FDA 监管的领域 只有当本产品由经过适当培训的人员使用时, 此处所提供的担保才有效 除非在 文件 中另有说明, 否则本担保只限于从产品装运之日起一年 本担保不会扩展至除了本产品的原始购买方 ( 买方 ) 之外的任何一方 公司不提供其它任何明示或暗示的保证条款, 包括但不限于商业适售性 特定目的之适用性 或者非侵权证明等暗示性保证 在质保期间, 买方对于不合格产品的唯一赔偿仅限于更换不合格的产品或者退回货款 如果由于下述原因之一造成产品故障, 本公司没有义务对产品进行更换 :(i) 事故 灾难或不可抗力事件 ;(ii) 买主的错误 使用 过错或疏忽 ;(iii) 将该产品以其设计范围之外的方式使用 ; 或者 (iv) 不正确储存和操作该产品 产品说明书请在 www.thermoscientific.com/pierce 网站下载 如果需要传真的复印件, 请拨打 800-810-5118 或与当地经销商联 系 2012 Thermo Fisher Scientific Inc. 版权所有 除非另有说明, 所有商标都是 Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的财产