LC-MS/MS 法测定人血浆中布洛芬对映体浓度及其药动学研究 黄明, 张全英 * *, 宗顺麟 ( 苏州大学附属第二医院临床药理实验室, 江苏苏州 215004) 摘要 : 采用 LC-MS/MS 法测定人血浆中 S-(+)- 布洛芬 (S-IBP) 和 R-(-)- 布洛芬 (R-IBP) 的浓度, 并应用于健康受试者体内药物动力学研究 以萘普生为内标, 采用 Daicel 公司 Chiralpak AD-3R (4.6 mm 150 mm,3.0 μm) 色谱柱, 流动相为乙腈 -0.01% 甲酸水溶液 (40:60), 流速为 750 μl min -1, 每个样品的分析时间为 23.0 min, 样品经电喷雾离子源负离子化后, 通过三重四极杆串联质谱仪, 在多反应监测模式下测定 S-IBP 和 R-IBP (m/z 205.1 161.0) 和内标萘普生 (m/z 229.1 185.0) 的浓度 血浆样品前处理采用甲醇沉淀蛋白 S-IBP 和 R-IBP 的血浆浓度在 0.05 ~ 30.00 μg ml -1 内线性良好, 定量下限为 0.05 μg ml -1 S-IBP 批内 批间精密度 (RSD) 均在 2.2% ~ 4.2% 以内, 相对偏差 (RE) 在 -12.0% ~ 13.0% 以内 R-IBP 批内 批间精密度 (RSD) 均在 2.0% ~ 8.2% 以内, 相对偏差 (RE) 在 -11.5% ~ 10.6% 以内 S-IBP 和 R-IBP 血浆样品室温 (25 ) 放置 6 h, 反复冻融 (-30 )3 次及冰冻 (-30 ) 保存 47 天的情况下均稳定 该分析方法简便 特异性高 灵敏度高, 可用于受试者空腹口服布洛芬缓释胶囊 300 mg 后血浆样品中布洛芬对映体 S-IBP 和 R-IBP 的药动学研究 关键词 : 布洛芬 ; 手性对映体 ; 高效液相 - 串联质谱 ; 药动学中图分类号 :R917 收稿日期 :2017-03-09; 修回日期 :2017-04-26. * 通讯作者 Tel:0512-67783687, E-mail: sdfeyyq@163.com 1 / 12
Determination of ibuprofen enantiomers in human plasma by LC-MS/MS and its application to pharmacokinetics study HUANG Ming, ZHANG Quan-ying*, ZONG Shun-lin (Clinical Pharmacology Laboratory, The Second Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215004, China) Abstract: The study aims to establish an LC-MS/MS method for the determination of S-(+)-ibuprofen (S-IBP) and R-(-)-ibuprofen (R-IBP), which was used subsequently to investigate the pharmacokinetics of ibuprofen enantiomers in healthy Chinese volunteers. Naproxen was used as internal standard. The separation was achieved on a Chiralpak AD-3R column (4.6 mm 150 mm,3.0 μm) with a mobile phase consisting of acetonitrile/0.01% formic acid aqueous solution (40:60) at a flow rate of 750 μl min -1 within 23.0 min. Naproxen and the internal standard were measured by a triple - quadrupole mass spectrometer in negative electron electronic spray ion (ESI) mode using multiple reaction monitoring (MRM). The extracted ions monitored following MRM transitions were m/z 205.1 161.0 for ibuprofen enantiomers and m/z 229.1 185.0 for the internal standard naproxen. Plasma samples were pretreated by methanol precipitation. The calibration curve of S-IBP and R-IBP in human plasma was linear over the concentration rang of (0.05 ~ 30.00) μg ml -1. The lower limit of quantitation was 0.05 μg ml -1. The intra- and inter R-run precisions of S-IBP at three quality control levels were within 2.2% ~ 4.2%, the relative deviation of the assay was within -12.0% ~ 13.0%. The intra- and inter R-run precisions of R-IBP at three quality 2 / 12
control levels were within 2.0% ~ 8.2%, the relative deviation of the assay was within -11.5% ~ 10.6%. The plasma samples were stable at room temperature (25 C) for 6 h, at -30 C for 47 days and during three freeze-thaw cycles. The method was proved to be convenient, accurate and sensitive. The method was proved to be suitable for the pharmacokinetics of ibuprofen enantiomers in healthy Chinese volunteers after a single oral dose of 300 mg ibuprofen extended-release capsule. Key words: ibuprofen; chiral enantiomer; LC-MS/MS; pharmacokinetics 布洛芬 (ibuprofen, IBP) 为非甾体抗炎药, 主要通过抑制前列腺素或其他炎 症介质合成而发挥抗炎 解热 镇痛作用 目前, 布洛芬主要以消旋体给药, 其 左右旋体在体内的药理活性存在显著的差异, 其中右旋布洛芬 (S-IBP) 在抑制前 列腺素生成上优于左旋布洛芬 (R-IBP) 布洛芬以消旋体给药后, 部分左旋布洛芬 可通过形成辅酶 A 硫脂单向地转化为右旋布洛芬 [1, 2], 所以有必要研究布洛芬对映 体各自的药动学参数 [3-6] 目前, 国内外血浆中布洛芬对映体浓度的测定方法主要包括 LC-UV 法和 LC-MS/MS [7-10] 血浆样品前处理方法有 :1 液液萃取法 [3-4, 7-10] : 样品经提取 吹 干 复溶等步骤后测定, 操作繁琐 2 固相萃取法 [5, 9] :SPE 柱成本相对较高 3 蛋白沉淀法 [6] : 此方法应用犬血浆样品测定 本研究首次采用甲醇沉淀蛋白前处理方法, 使用液质联用仪测定人血浆中布 洛芬对映体浓度,S-IBP 和 R-IBP 定量下限均为 0.05 μg ml -1, 并将此方法应用于布 洛芬缓释胶囊中国健康受试者人体药动学研究 3 / 12
材料与方法仪器液质联用仪 :API4000 三重串联四极杆质谱仪,AB Sciex 公司 ; Agilent1200 液相色谱仪,Agilent 公司 ; 数据处理系统为 Analyst 1.4.2,AB Sciex 公司 分析天平 :XS 105DU 型 (Max 2 =41 g,d 2 =0.01 mg),mettler Toledo 公司 对照品和试剂 S-IBP 对照品 ( 批号 101203-201201, 中国食品药品检定研 究院, 含量为 99.9%) R-IBP 对照品 ( 批号 1175-070A2,TLC Pharmachem, 含量为 99.6%) 萘普生对照品( 批号 100198-201205, 中国食品药品检定研究院, 含量为 99.6%); 乙腈和甲醇 (HPLC 级,Merck KGaA); 甲酸 (AR 级, 上海凌峰化学试剂有限公司 ); 水 ( 灭菌注射用水, 石家庄四药有限公司 ) 空白血浆来自健康志愿者 试验药物 布洛芬缓释胶囊 ( 中美天津史克制药有限公司生产 商品名芬 必得, 产品批号 13030887, 含量 99.3%, 规格 300 mg/ 粒 ) 色谱条件 色谱柱为 Daicel 公司 Chiralpak AD-3R (4.6 mm 150 mm,3.0 μm), 保护柱为 Chiralpak AD-3R (4.0 mm 10 mm,3.0 μm); 流动相为乙腈 -0.01% 甲酸水溶液 (40:60); 流速 750 μl min -1 ; 分析时间 23.0 min,0~8.0 min A 通道 ( 排 废 ),8.0~23.0 min B 通道 ( 质谱系统 ); 进样量 20 μl; 柱温 25 质谱条件 电喷雾离子源 (ESI), 负离子电离模式 ; 雾化气 50 psi(1psi 6.9 kpa); 加热辅助气 50 psi, 离子源温度 550 ; 采用多反应监测 (MRM);S-IBP 和 R-IBP 监测离子对均为 m/z205.1 161.0, 去簇电压 (DP) 为 60 V, 射入电压 (EP) 为 10 V, 碰撞能量 (CE) 为 11 V, 碰撞室的射出电压 (CXP) 为 6 V; 内标萘普生监测离子对为 m/z229.1 185.0, 去簇电压 (DP) 为 40 V, 射入电压 (EP) 为 10 V, 碰撞能量 (CE) 为 9 V, 碰撞室的射出电压 (CXP) 为 6 V 4 / 12
储备液和工作液配制 S-IBP 和 R-IBP 标准曲线储备液和工作液 : 称量 S-IBP 和 R-IBP 各 10.00 mg 于 10 ml 量瓶用甲醇定容, 混匀得 1.000 mg ml -1 S-IBP 和 R-IBP 标准曲线储备液, 用甲醇稀释至浓度为 1.000 3.000 10.00 30.00 100.0 300.0 和 600.0 μg ml -1 的标准曲线系列工作液 将 1.000 mg ml -1 S-IBP 和 R-IBP 储备液, 用甲醇稀释至浓度为 2.400 48.00 和 480.0 μg ml -1 的质控系列工作液 内标萘普生储备液及工作液 : 称取萘普生对照品 10.00 mg 于 10 ml 量瓶用甲醇 定容, 混匀得 1.000 mg ml -1 内标储备液, 并用甲醇稀释 5.000 μg ml -1 内标萘普 生工作液 标准曲线和质控血浆样品制备和处理 取空白血浆 200 μl 置 1.5 ml 离心 管中, 加入 S-IBP 和 R-IBP 标准曲线或质控工作液 10 μl 和内标萘普生工作液 50 μl, 混匀后加入甲醇 600 μl 沉淀血浆蛋白, 涡旋 1 min, 于 23 755 g 4 离心 10 min 离心后取上清液 400 μl 置进样瓶中, 加入水相 400 μl, 涡旋混匀后, 置于自动进样器中进样测定 S-IBP 和 R-IBP 浓度 方法学验证 特异性实验 分别取 S-IBP 和 R-IBP 对照溶液 萘普生对照溶液 空白血 浆按 标准曲线和质控血浆样品制备和处理 项方法处理样品 ; 空白血浆 200 μl 和 S-IBP 和 R-IBP 对照品溶液 ( 均 30.00 μg ml -1 )10 μl 混匀后按 标准曲线和质控血浆样品制备和处理 项方法操作样品 ; 受试者口服布洛芬缓释胶囊 300 mg 后 2.0 h 的血浆按 受试者血浆样品处理 项方法操作样品, 进样检测 标准曲线和定量下限 取空白血浆 200 μl, 分别加入 S-IBP 和 R-IBP 标准 曲线系列工作液 10 μl, 制备血浆中 S-IBP 和 R-IBP 浓度均为 0.05000 0.1500 0.5000 1.500 5.000 15.00 和 30.00 μg ml -1 的标准曲线系列血浆样品, 按 标 5 / 12
准曲线和质控血浆样品制备和处理 项方法处理, 进样检测, 以 S-IBP 或 R-IBP 浓度为横坐标,S-IBP 或 R-IBP 峰面积与内标萘普生峰面积的比值为纵坐标, 权 重系数为 1/C 2, 进行线性回归 精密度与准确度 取空白血浆 200 μl, 分别加入 S-IBP 和 R-IBP 质控系列 工作液 10 μl (2.400 48.00 和 480.0 μg ml -1 ), 制备血浆中 S-IBP 和 R-IBP 浓度分别均为 0.1200 2.400 和 24.00 μg ml -1 的质控系列血浆样品, 每个浓度 6 样品, 按 标准曲线和质控血浆样品制备和处理 项方法处理, 测定 3 批, 根据每批随行标准曲线, 计算样品的实测浓度, 用 Excel 软件中单因素方差分析计算 S-IBP 和 R-IBP 批间和批内精密度, 同时计算相对偏差 提取回收率 按精密度与准确度实验方法制备含 S-IBP 和 R-IBP 分别为 0.1200 2.400 和 24.00 μg ml -1 的血浆样品, 每个浓度 6 个样品, 按 标准曲线和质控血浆样品制备和处理 项方法处理, 以其进样测定得到的峰面积除以空白血浆经蛋白沉淀后直接加入低 中 高 S-IBP 和 R-IBP 质控系列工作液及内标萘普生工作液后检测得到的峰面积, 计算血浆中 S-IBP R-IBP 和内标萘普生的提取回收率 基质效应 取 6 个不同来源的空白血浆 200 μl 至 1.5 ml 离心管中, 分别 加入甲醇 600 μl, 涡旋 1 min,4 离心 (23 755 g)10 min, 取上清液 700 μl 作血浆基质 ; 另取纯化水 200 μl 至 1.5 ml 离心管中, 同法处理得到对照基质 分别取对照基质和血浆基质 700 μl, 加入 S-IBP 和 R-IBP 质控系列工作液 10 μl 和内标萘普生工作液 50 μl 混匀, 吸取该溶液 200 μl 至进样瓶中, 加入水相 800 μl, 混匀 上述样品每个浓度 6 份并按 色谱条件 和 质谱条件 项检测, 获得 S-IBP R-IBP 和内标萘普生峰面积, 以每一浓度样品两种基质的峰面积比值 6 / 12
计算基质效应 受试者血浆样品处理 取受试者血浆样品 200 μl 置 1.5 ml 离心管中, 加 入甲醇 10 μl 和内标萘普生工作液 50 μl, 混匀后加入甲醇 600 μl 沉淀血浆蛋白, 涡旋 1 min, 于 23 755 g 4 离心 10 min 离心后取上清液 400 μl 置进样瓶中, 加入水相 400 μl, 涡旋混匀后, 置于自动进样器中进样测定 S-IBP 和 R-IBP 浓度 人体药动学研究方案 临床试验方案经苏州大学附属第二医院伦理委员 会批准 12 名男性健康受试者均签署知情同意书, 年龄在 (23±3) 岁, 试验开始两周前至试验期间未服用其他任何药物, 体重指数均在 19~24 内, 心电图正常, 肝 肾功能正常, 均符合受试者入选标准 12 名受试者空腹口服布洛芬缓释胶囊 ( 芬必得,300 mg/ 粒 )1 粒,250 ml 温开水送服, 于服药前和服药后 0.50 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 8.0 10 12 15 和 24 h 由肘静脉取血 4 ml 所有血液样品置肝素化采血管中, 离心 ( 2 304 g,4,5 min), 分离上层血浆, 于 -30 冰箱中保存, 待测 结果 1 方法学验证 1.1 特异性结果显示,S-IBP 和 R-IBP 的保留时间分别为 16.60 和 15.02 min, 内标萘普生的保留时间为 11.75 min, 内源性物质不干扰 S-IBP 和 R-IBP 和内标萘普生的测定, 见图 1 XIC of -MRM (2 pairs): 205.100/161.00... 5.0e4 16.64 Max. 6.1e4 cps. 0.0 XIC of -MRM (2 pairs): 229.100/185.0... Max. 1270.0 cps. 1000 8.01 13.41 14.85 21.33 0 XIC of -MRM (2 pairs): 205.100/161.00... 8.1e4 15.10 7 / 12 Max. 8.1e4 cps. 0.0 XIC of -MRM (2 pairs): 229.100/185.0... Max. 1010.0 cps. 1000 0 8.01 14.78 15.82 21.99 XIC of -MRM (2 pairs): 205.100/161.0... Max. 1345.0 cps. 1000 8.268.97 15.82 17.96 0 XIC of -MRM (2 pairs): 229.100/185.00... Max. 1.5e5 cps. 1.0e5 0.0 A B C 11.80
XIC of -MRM (2 pairs): 205.100/161.0... 1000 8.31 10.05 15.67 Max. 1290.0 cps. 0 XIC of -MRM (2 pairs): 229.100/185.0... Max. 1535.0 cps. 1000 0 8.01 9.07 16.60 22.23 XIC of -MRM (2 pairs): 205.100/161.0... Max. 5245.0 cps. 14.85 5000 16.52 8.34 9.53 0 XIC of -MRM (2 pairs): 229.100/185.00... Max. 1.2e5 cps. 1.00e5 0.00 11.70 XIC of -MRM (2 pairs): 205.100/161.00... 7.7e4 15.05 16.61 Max. 7.7e4 cps. 0.0 XIC of -MRM (2 pairs): 229.100/185.00... Max. 9.2e4 cps. D E F 9.2e4 0.0 11.75 XIC of -MRM (2 pairs): 205.100/161.00... 9.1e4 14.98 16.51 Max. 9.1e4 cps. 0.0 XIC of -MRM (2 pairs): 229.100/185.00... Max. 1.2e5 cps. 1.00e5 0.00 G 11.74 Figure 1 LC-MS/MS Chromatograms of S-IBP (S-(+)-ibuprofen) and R-IBP (R-(-)-ibuprofen). A: Standard solution of S-IBP (1.500 μg ml -1 ); B: Standard solution of R-IBP (1.500 μg ml -1 ); C: Standard solution of naproxen (1.250 μg ml -1 ); D: Blank plasma; E: Spiked plasma sample obtained by the addition of 10 μl standard solution of S-IBP and R-IBP (1.000 μg ml -1 ) to 200 μl blank plasma; F: Spiked plasma sample obtained by the addition of 10 μl standard solution of S-IBP and R-IBP (30.00 μg ml -1 ) to 200 μl blank plasma; G: Plasma obtained from a volunteer at 2.0 h after orally administration ibuprofen extended-release capsule 1.2 标准曲线和定量下限 S-IBP 回归方程为 ƒ=0.526 C+0.005 83(r=0.999 7) R-IBP 回归方程为 ƒ=0.501 C+0.005 41(r=0.998 3) 结果表明,S-IBP 和 R-IBP 在 0.05 ~ 30.00 μg ml -1 内线性关系均较好, 定量下限 LLOQ 均为 0.05 ng ml -1 1.3 精密度与准确度结果显示,S-IBP 和 R-IBP 低 中 高三浓度质控样品 批间和批内 RSD 均小于 15%,RE 均在 ±15% 范围内 1.4 提取回收率结果显示, 血浆中 S-IBP 低 中 高三个浓度的提取回收率 分别为 96.7%±4.6%(n=6) 104.1%±1.9%(n=6) 和 103.3%±4.7%(n=6); 血浆 中 R-IBP 低 中 高三个浓度的提取回收率分别为 100.3%±4.4%(n=6) 97.5%±2.6% ( n=6 ) 和 99.7%±2.0% ( n=6 ); 内标萘普生的提取回收率为 101.3%±2.8%(n=18) 1.5 基质效应结果显示, 血浆中 S-IBP 低 中 高三个浓度的基质效应分别 8 / 12
为 100.8%±2.2%(n=6) 100.6%±1.9%(n=6) 和 96.3%±3.5%(n=6); 血浆中 S-IBP 低 中 高三个浓度的基质效应分别为 101.5%±4.1%(n=6) 97.4%±3.6%(n=6) 和 96.7%±2.7%(n=6); 内标萘普生的基质效应为 98.4%±3.4%(n=18) 1.6 稳定性结果显示,S-IBP 和 R-IBP 血浆样品室温放置 (25 )6 h -30 冰冻 47 天和反复冻融 3 次情况下均稳定 ; 待测样品自动进样器放置 (4 )48 h, 血浆蛋白沉淀离心后上清液样品室温放置 (25 )6 h S-IBP 和 R-IBP 储备液在室温放置 24 h 和在冷藏 (2~8 )26 天情况下稳定 ; 内标萘普生储备液在室温放置 24 h 和在冷藏 (2~8 )26 天情况下稳定 2 人体药动学应用 12 名受试者空腹口服布洛芬后 S-IBP 和 R-IBP 的平均血药浓度 - 时间曲线见图 2, 主要药动学参数见表 1 Figure 2 Mean plasma concentration - time curves of ibuprofen enantiomers after a single oral dose of 300 mg ibuprofen extended-release capsule in 12 healthy male volunteers ( x ± s, n = 12) 9 / 12
Table 1 Main pharmacokinetic parameters of ibuprofen(ibp) enantiomers after a single oral dose of 300 mg IBP extended-release capsule ( x ± s, n = 12). NA: Not applicable Dose / mg 300 300 ( Literature [3] ) Racemic IBP S-IBP R-IBP Racemic IBP S-IBP R-IBP AUC 0-24h / μg h ml -1 104.3± 21.3 63.60 ± 12.20 40.73± 13.05 111.26± 13.90 66.39 ± 11.21 44.89± 5.85 AUC 0- / μg h ml -1 105.3± 21.2 64.14± 12.20 41.04± 12.99 NA NA NA C max / μg ml -1 14.62 ± 3.49 8.239 ± 1.593 7.042 ± 2.274 13.94 ± 2.23 8.15 ± 1.58 5.98 ± 1.04 t max / h 5.33 ±1.07 5.67 ± 0.89 4.58 ± 0.67 5.25 ±1.07 5.25 ±1.07 4.44 ± 0.32 t 1/2 / h 2.90 ± 0.86 2.75 ± 0.61 2.78 ± 1.62 3.45 ±2.11 3.97 ± 2.11 3.34 ± 0.84 CL/F / L h -1 2.959 ± 0.607 2.435 ± 0.561 4.015 ± 1.296 3.00 ± 0.42 2.65 ± 0.52 3.72 ±0.82 讨论 本研究建立的 LC-MS/MS 测定人血浆中布洛芬对映体浓度, 定量下限为 0.05 μg ml -1 [3,5-10] [4], 低于文献报道,Shi 等采用液液萃取法, 操作繁琐 本方法可满 足布洛芬缓释胶囊的药动学研究大量样品测定 [4] 手性拆分是药物分析的热点, 也是定量测定手性药物的前提 Xiang 等采 用大赛璐多糖衍生物正相手性柱,Chiralcel OJ-H, 流动性为正己烷 - 异丙醇 - 三氟 醋酸, 不适合 LC-MS/MS 本文采用大赛璐多糖衍生物反相手性柱 Chiralpak AD-3R, 硅胶表面涂敷有直链淀粉 - 三 (3,5- 二甲苯基氨基甲酸酯 ), 与正相柱 Chiralpak AD-H 比较, 反相柱涂敷的手性聚合物与正相柱相同, 但是所用的硅胶 不同 反相柱使用水 / 有机溶剂流动相, 适合分析水溶性样品 ( 比如生物活性样品 ), 可应用于 LC-MS/MS 中 本研究对色谱和质谱条件进行了优化考察, 初期尝试使用 Daicel 公司官网推 荐的色谱条件 : 乙腈 -ph 2.0 甲酸水溶液 (50/50), 结果显示 :S-IBP 和 R-IBP 仪 器响应低, 考虑负离子监测模式下, 流动性 ph 低, 不利于负离子的形成, 故减 小甲酸水溶液中甲酸的比例 最终选择乙腈 0.01% 甲酸水溶液 (40:60) 为流动相, 10 / 12
S-IBP 和 R-IBP 的响应较高且保留时间适中 血浆样品沉淀蛋白, 离心后, 取上清液 400 μl, 并加入水相 400 μl, 是为了 将进样样品中水的比例提高至近似流动相的比例, 防止发生二次化学平衡现象, 改善峰形 12 例受试者口服布洛芬缓释胶囊胶囊 300 mg 后, 血浆中 S-IBP 和 R-IBP 主 [3] 要药动学参数 AUC C max t max t 1/2 和 CL/F 与文献基本一致 布洛芬消旋体 S-IBP 和 R-IBP 之间除 AUC C max 和 CL/F 外, 其他主要药动学参数均无统计学 差异 S-IBP 的 AUC 0-24h 均数是布洛芬消旋体的 61.0%, 是 R-IBP 的 156.2%;S-IBP 的 C max 均数是布洛芬消旋体的 56.4%, 是 R-IBP 的 C max 的 117.0% R-IBP 的清 除较 S-IBP 快 References [1] Bookstaver PB, Miller AD, Rudisill CN, et al. Intavenous ibuprofen: the first injectable product for the treatment of pain and fever [J]. J Pain Res, 2010, 25: 67-79. [2] Cattaneo D, Clementi E. Clinica1 pharmacokinetics of ibuprofen arginine [J]. Curr Clin Pharmacol, 2010, 5: 239-245. [3] Xiang J, Yu Q, Liang MZ, et al. Pharmacokinetics of ibuprofen enantiomers in healthy volunteers [J]. J Sichuan Univ(Med Sci Edi) ( 四川大学学报医学版 ), 2010, 41: 176-178. [4] Shi XB, Shan L, Guo B, et al. Determination of ibuprofen enantiomers in plasma by HPLC-chiral stationary phase [J]. Chin J Mod Appl Pharm ( 中国现 11 / 12
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