Order: 010-59822688 Toll-free: 800-990-6057 /400-810-6057 TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD 版本号 : FP160112 SuperReal PreMix Color (SYBR Green) SuperReal 彩色荧光定量预混试剂 (SYBR Green) 目录号 :FP215 产品内容 产品组成 FP215-01 FP215-02 FP215-03 20 μl 125 rxn 20 μl 500 rxn 20 μl 5000 rxn 2 SuperReal 彩色预混试剂 ( 含有 SYBR Green I 及蓝色指示剂 ) 2 SuperReal Color PreMix 1.25 ml 4 1.25 ml 10 4 1.25 ml (with SYBR Green I & blue dye) 50 ROX 对照染料 50 ROX Reference Dye 250 μl 1 ml 10 1 ml 40 样本稀释液 ( 黄色 ) 40 Dilution Buffer (yellow) 1.25 ml 1.25 ml 10 1.25 ml 无 RNA 酶双蒸水 RNase-Free ddh 2 O 2 1 ml 5 1 ml 10 5 1 ml 储存条件收到本产品后, 请立即置于 -20 避光保存 从 -20 取出使用时, 将冻存的 2 SuperReal Color PreMix 和 50 ROX Reference Dye 融解, 然后轻轻颠倒混匀, 待溶液完全均一后再行使用 如解冻后没有使用, 须彻底混匀后重新冷冻 ( 在解冻过程中盐会出现分层现象, 未混匀进行冷冻, 盐晶体的析出将会对酶造成损害 ) 如需一段时间内经常取用, 可在 2~8 条件下储存 3 个月 避免反复多次冻融 产品简介本产品是采用 SYBR Green I 嵌合荧光法进行 Real Time PCR 的专用试剂 产品中预先混有 Real Time PCR 反应所需最适浓度的 SYBR Green I, 是一种 2 浓度的 PreMix 产品额外添加了指示剂, 利于大量样品的加样, 减少误操作概率 SuperReal Color PreMix 采用了独特的双组分热启动 DNA 聚合酶 ( 化学修饰的 HotStar Taq DNA 聚合酶和抗体修饰的 Anti Taq DNA 聚合酶 ), 配合精心优化 buffer 体系, 具有高扩增效率, 高扩增特异性和宽广的可信范围的特点 本升级版试剂在经过成分调整后, 扩增特异性上的优势更为突出 本产品仅供科研使用 请勿用于医药 临床治疗 食品及化妆品等用途
试剂盒特点 1. SuperReal Color PreMix 采用了独特的双组分热启动 DNA 聚合酶 ( 化学修饰的 HotStar Taq DNA 聚合酶和抗体修饰的 Anti Taq DNA 聚合酶 ), 从而构成酶活自动调节系统, 配合精心优化 buffer 体系, 具有高扩增效率, 高扩增特异性和宽广的可信范围的特点 2. 本产品 Buffer 体系平衡了 K + + 和 NH 4 的比例, 还特别添加了独创的 H-Bond 因子, 能协同调整反应体系中的氢键作用力, 使引物模板退火条件更加严谨, 反应的专一性增强, 重复性更好 3. SuperReal Color PreMix 中预混有 SYBR Green I,PCR 反应液配制时, 只需加入模板 引物 无 RNA 酶超纯水便可进行 Real Time PCR 反应, 操作简单方便 4. 本产品附带 ROX Reference Dye, 用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差, 方便客户针对不同型号荧光定量 PCR 仪时选择对应浓度使用 5. 添加颜色指示剂, 令加样更加简便, 有效降低误操作概率 试剂盒原理本产品采用了独特的双组分热启动 DNA 聚合酶进行 PCR 扩增, 通过检测反应进程中 SYBR Green I 的荧光强度, 达到检测 PCR 产物扩增量的目的 本产品中双热启动酶构成了独特的酶活自动调节系统 酶活自动调节系统是由化学修饰的 HotStar Taq DNA 聚合酶和抗体修饰的 Anti Taq DNA 聚合酶组成 其中 HotStar Taq DNA 聚合酶占绝大部分比例, 其聚合酶活性的激活是严格依赖于 95 高温的一个缓释过程, 而 Anti Taq DNA 聚合酶则在 95 高温下完全激活 经过 95 条件下孵育 15 min 激活大部分 HotStarTaq DNA 聚合酶, 进入 PCR 循环后, 每经过一轮 95 条件下变性, 即可重新激活一部分 HotStar Taq DNA 聚合酶 HotStar Taq DNA 聚合酶独特的酶活缓释机制使其可以与 Anti Taq DNA 聚合酶构成独特的酶活自动调节系统 PCR 反应初期, 完全激活的 Anti Taq DNA 聚合酶可以协同已经激活的 HotStar Taq DNA 聚合酶达到最佳酶活状态, 而在整个 PCR 反应过程中, 每一轮新释放的 HotStart Taq DNA 聚合酶活力刚好可以弥补因热变性所导致的部分酶活损失 因此,SuperReal Color PreMix 在整个 PCR 反应过程始终保持最佳的 DNA 聚合酶活力, 配合精心优化 Buffer 体系, 从而可以获得高扩增效率, 高扩增特异性和更加广泛性的模板适应性 注意事项 1. PCR 反应液中各颜色指示剂的终浓度应为 1, 请根据模板的添加量计算 Dilution Buffer 的用量 2. PCR 反应的预变性条件必须设定为 95 15 min, 用以充分激活热启动酶 3. 本产品中含有荧光染料 SYBR Green I, 保存本产品或配制 PCR 反应液时应避免强光照射 4. 如果试剂没有混匀, 其反应性能会有所下降 使用时请上下颠倒轻轻混匀, 请不要使用涡旋仪进行混匀, 尽量避免出现泡沫, 并经瞬时离心后使用 5. 引物终浓度为 0.3 μm 可以在大多数体系中获得良好的扩增结果 如果需要进一步优化, 可以在 0.2-0.5 μm 范围内调整引物浓度 6. 20 μl 反应体系中, 基因组 DNA 或 cdna 模板的使用量一般小于 100 ng, 逆转录产物作为模板时, 使用量应不超过 PCR 体系终体积的 20% 2
操作方法 <1> 建立 Real-Time PCR 反应体系 : 请注意将 2 SuperReal Color PreMix 和 50 ROX Reference Dye 避光保存 1. 解冻 2 SuperReal Color PreMix ( 如果保存在 -20 ),50 ROX Reference Dye, 模板, 引物 40 Dilution Buffer 和 RNase-Free ddh 2 O, 并将所有试剂在室温下平衡并彻底混 匀 2. 建议置于冰上进行 Real Time PCR 反应液的配制 40 Dilution Buffer 为黄色,2 SuperReal Color PreMix 为蓝色 如需稀释模板, 则最 终反应体系应为绿色 ; 否则应为蓝色 如颜色不符, 请检查体系中是否正确加入相关组 分 反应体系 : 组成成分 50 μl 体系 25 μl 体系 20 μl 体系终浓度 2 SuperReal Color PreMix 25 μl 12.5 μl 10 μl 1 正向引物 (10 μm) 1.5 μl 0.75 μl 0.6 μl 0.3 μm* 反向引物 (10 μm) 1.5 μl 0.75 μl 0.6 μl 0.3 μm* cdna 模板 ( 含 Dilution Buffer) - - - -ng-pg 50 ROX Reference Dye** - - - - RNase-free ddh 2 O 至 50 μl 至 25 μl 至 20 μl - * 引物终浓度为 0.3 μm 可以在大多数体系中获得良好的扩增结果 扩增效率不高时, 可增加 PCR 反 应体系中的引物浓度 ; 发生非特异扩增时, 可适当减少 PCR 反应体系中的引物浓度 需要进一步优化引 物浓度的, 可以在 0.2~0.5 μm 范围内调整 下 : 如需稀释模板, 应先将 cdna 模板与 40 Dilution Buffer 按一定比例混合成稀释模板 稀释比例如 20 μl 反应体系中 cdna 用量与 40 Dilution Buffer 含量对应表 : 20 μl PCR 体系中稀释模板的添加量稀释模板中 Dilution Buffer 的浓度 100 μl 稀释模板中所需 40 Dilution Buffer 的量 100 μl 稀释模板中所需 cdna 的量 1 μl 2 μl 2.5 μl 3 μl 4 μl 5 μl 6 μl 20 10 8 6.7 5 4 3.3 50 μl 25 μl 20 μl 16.7 μl 12.5 μl 10 μl 8.4 μl 50 μl 75 μl 80 μl 83.3 μl 87.5 μl 90 μl 91.6 μl 3
50 μl 反应体系中 cdna 用量与 40 Dilution Buffer 含量对应表 : 50 μl PCR 体系中稀释模板添加量 稀释模板中所需 Dilution Buffer 的浓度 100 μl 稀释模板中所需 40 Dilution Buffer 的量 100 μl 稀释模板中所需 cdna 的量 2 μl 2.5 μl 3 μl 4 μl 5 μl 6 μl 8 μl 25 20 16.7 12.5 10 8.3 6.25 62.5 μl 50 μl 41.7 μl 31.3 μl 25 μl 20.8 μl 15.6 μl 37.5 μl 50 μl 58.3 μl 68.7 μl 75 μl 79.2 μl 84.4 μl ** 几种常见仪器的最适 ROX Reference Dye 浓度见下表 : 仪器 终浓度 ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/StepOne 等 5 ( 例如 :5 μl ROX/50 μl 体系 ) ABI 7500 7500 Fast; Stratagene Mx3000P Mx3005P 和 Mx4000 等 1 ( 例如 :1 μl ROX/50 μl 体系 ) Roche 仪器,Bio-Rad 仪器,Eppendorf 仪器等 无需添加 <2> 进行 Real time PCR 反应 建议采用两步法 PCR 反应程序进行反应 当出现模板浓度过低引起非特异扩增, 引物 Tm 值较低导致的扩增效率低下或扩增曲线重现性不佳等现象时, 建议尝试进行三步法 PCR 扩增反应 两步法反应程序 : 阶段 循环 温度 时间 内容 荧光信号采集 预变性 1 95 15 min 预变性 否 PCR 反应 40 95 10 sec 变性否 60-66 1 20-32 sec* 退火 / 延伸是 熔解曲线分析 (Melting/Dissociation Curve Stage) 三步法反应程序 : 阶段 循环 温度 时间 内容 荧光信号采集 预变性 1 95 15 min 预变性 否 95 10 sec 变性 否 PCR 反应 40 50-60 2 20 sec 退火 否 72 20-32 sec* 延伸 是 熔解曲线分析 (Melting/Dissociation Curve Stage) 4
1 请先使用 60 32 sec (20 sec, 30 sec, 31sec.) 进行扩增 如果需要进一步优化, 可以尝试在 60-66 范围内进行 2 通常引物退火温度比引物的解链温度 (Tm) 低 5, 如果引物碱基数较少, 可以适当提高退火温度, 这样可以使 PCR 的特异性增加 ; 如果碱基数较多, 那么可以适当减低退火温度 * 使用不同型号仪器进行时间设定时, 请按照仪器使用说明书要求进行实验操作, 几种常见仪器的 时间设定见下表 : 使用时 Roche LightCycler/ LightCycler 480 请设定在 20 sec 使用 ABI 7500 Fast/7900HT/7900HT Fast/ViiA 7/StepOne/StepOnePlus 时请设定在 30 sec 使用 ABI 7000 和 7300 时请设定在 31 sec 使用 ABI 7500 时请设定在 32 sec 3. 盖上反应管, 轻柔混匀 可短暂离心, 确保所有组分均在管底 4. 将反应体系置于荧光定量 PCR 仪中, 开始反应 以使用 ABI 7500 Real Time PCR 扩增仪为例, 进行扩增效率优化时, 可以按照下表中所 示优化方案 1 或优化方案 2 的反应条件进行反应 : 基本反应程序 优化方案 1 优化方案 2 ( 增加两步法延伸时间进行优化 ) ( 使用三步法进行 PCR 反应 ) 循环 温度 时间 时间 温度 时间 1 95 15 min 15 min 95 15 min 40 95 10 sec 10 sec 95 10 sec 60 32 sec 32-60 sec 55 30 sec NA 72 32 sec 以使用 ABI 7500 Real Time PCR 扩增仪为例, 进行特异性优化的参考方案 : 基本反应程序 特异性优化方案 ( 提高两步法退火温度 ) 循环 温度 时间 温度 时间 1 95 15 min 95 15 min 40 95 10 sec 95 10 sec 60 32 sec 60-64 32 sec 5
进行 RT-qPCR 反应时的操作建议 进行 RT-PCR 反应时, 有两种 cdna 第一链合成试剂盒可以选择, 分别是 FastQuant cdna 第一链合成试剂盒 (KR106) 和 TIANScript II cdna 第一链合成试剂盒 (KR107) 其中 FastQuant cdna 第一链合成试剂盒是专为两步法 RT-PCR 第一步实验配制的, 具有高灵敏度 的 RT-PCR 反应系统, 可以从极低量的总 RNA 或 poly (A) + RNA 合成第一链 cdna 该试剂盒 中使用的逆转录酶 Quant Reverse Transcriptase 与通常使用的 Moloney 鼠白血病病毒来源的 M-MLV 和鸟成髓细胞病毒来源的 AMV 不同, 是一种使用大肠杆菌工程菌进行重组表达的全新高效逆转录酶 该酶能够高效转录多种 RNA 模板, 最大限度将 RNA 转录成 cdna 第一链 以 FastQuant RT Kit (with gdnase) (KR106) 为例, 下列操作步骤适用于模板量为 50 ng-2 μg 的总 RNA 1. 将模板 RNA 在冰上解冻 ;5 gdna Buffer FQ-RT Primer Mix 10 Fast RT Buffer RNase-Free ddh 2 O 在室温 (15-25 ) 解冻, 解冻后迅速置于冰上 使用前将每种溶液涡旋振荡混匀, 简短离心以收集残留在管壁的液体 以下操作步骤请在冰上进行 为了保证反应液配制的准确性, 进行各项反应时, 应先配制成 Mix, 然后再分装到每个反应管中 2. 按照表 1 的基因组 DNA 的去除体系配制混合液, 彻底混匀 简短离心, 并置于 42, 孵育 3 min 然后置于冰上放置 3. 按照表 2 的反转录反应体系配制混合液 4. 将反转录反应中的 Mix 加到 gdna 去除步骤的反应液中, 充分混匀 5. 42, 孵育 15 min; 95, 孵育 3 min 6. 进行 PCR 反应表 1 gdna 去除反应体系表 2 反转录反应体系 组成成分 使用量 试剂 使用量 5 gdna Buffer 2 μl 10 Fast RT Buffer 2 μl Total RNA - RT Enzyme Mix 1 μl RNase-Free ddh 2 O 补足到 10 μl FQ-RT Primer Mix 2 μl RNase-Free ddh 2 O 补足到 10 μl 本实验是应用两步法定量 RT-PCR 对人 Jurkat cell 的 Hsc mrna 进行定量检测 荧光定量 PCR 是使用 SuperReal Color PreMix (FP215) cdna. 合成是使用 FastQuant RT Kit (KR106) 进行, cdna 用量相当于 100ng-10pg 总 RNA 扩增曲线 ( 左图 ) 和熔解曲线 ( 右图 ) 显示扩增效率和特异性良好 6
引物设计说明 进行 Real Time PCR 反应时,PCR 引物的设计非常重要 设计 PCR 扩增效率高, 反应特异性强的引物可以参考以下要求 设计引物要求如下 : 引物长度 18-30 个碱基 GC 含量 40-60% Tm 值引物软件都可以给出 Tm, 与引物长度, 碱基组成, 引物使用缓冲的离子强度也有关 上下游引物的 Tm 值要尽量接近 简单的 Tm 计算公式为 :Tm = 4 (G + C)+ 2 (A + T) 一般采用较引物 Tm 值低 5 作为 PCR 退火温度 提高退火温度可以增加 PCR 反应的特异性 引物及 PCR 扩 PCR 扩增产物长度最好在 80-200 bp 之间 增产物序列尽量避开在模板的二级结构区域设计引物 避免上下游引物 3' 端之间形成 2 个或以上的互补碱基以减少引物二聚体的形成 引物 3' 端碱基不能有多于 3 个连续的 G 或 C 引物自身不应存在互补序列, 否则引物自身会折叠成发夹状结构 避免引物 3' 末端碱基为 T 引物序列中 A T G C 要尽量均匀分布 常见问题 1. 无扩增信号或扩增曲线起峰晚或仅有引物二聚体原因解决办法 DNA 模板中存在抑制剂重新纯化模板或降低模板使用量 Mg 2+ 浓度不合适使用 2 SuperReal Color PreMix 时,PCR 反应体系中 Mg 2+ 的终浓度为 2 mm 对有些扩增体系, 可以将 Mg 2+ 终浓度提高到 5 mm 进行 Mg 2+ 终浓度优化时, 建议每次增加 0.5 mm Mg 2+ 浓度进行实验 加样错误或试剂问题检查试剂浓度和保存条件, 包括所使用的引物和模板 重复进行实验 热启动酶未能激活使用试剂时, 请确保预变性条件为 95 15 min, 用以有效激活热启动 DNA 聚合酶 PCR 条件 引物序列请确认引物未发生降解, 引物浓度及 PCR 条件, 扩增不好或浓度不当时, 通常先尝试降低退火温度, 延长退火时间和提高引物浓度, 有时也可以提高退火温度, 增加延伸时间, 降低升温速度 对于 GC 含量高的模板, 可以适当延长变性时间 如果还是扩增不好, 请重新设计引物 起始模板问题检查起始模板的浓度, 保存条件和质量 重新对模板进行线性梯度稀释, 并用新稀释模板进行实验 增加起始模板使用量 7
2. NTC 出现较高的荧光值 原因 试剂污染 PCR 反应液配制时发生污染 引物出现降解 解决办法建议使用新试剂进行实验 采取必要的防污染策略 ( 如使用带滤芯的枪头 ) 可以使用变性聚丙烯酰胺胶检测引物降解情况 3. 出现引物二聚体和 ( 或 ) 非特异扩增 原因 解决办法 Mg 2+ 浓度不合适 使用 2 SuperReal Color PreMix 的反应体系含有 Mg 2+ 的终浓 度为 2 mm 对有些扩增体系, 可以将 Mg 2+ 终浓度增加到 5 mm 建议每次增加 0.5 mm Mg 2+ 浓度进行优化 PCR 退火温度太低 建议每次增加 2 进行退火温度优化 引物设计不合适 考虑重新设计引物序列 PCR 产物太长 荧光定量 PCR 产物长度最好在 100-150 bp 之间, 而且不应该超 过 500 bp 引物出现降解 可以使用变性聚丙烯酰胺胶检测引物降解情况 计量误差 反应体积太小会导致检测精度下降 请根据定量 PCR 仪推荐的反应体积重新实验 4. 定量值重现性差 原因仪器方面的故障样品纯度不好稀释的模板放置太久引物质量下降 PCR 反应条件 引物浓度 序列等不恰当计量误差 解决办法因为仪器的不适用, 在温度管理或检测时产生重现性差 请根据相应仪器的说明书进行点检 不纯的样品会导致实验的重现性差 通过梯度稀释的模板最好现配现用 尽量避免新合成引物批次间的差异, 可以使用原来质量好的引物做为对照 扩增效率差的 PCR 较容易产生重现性差 通过变更引物的浓度或 PCR 反应条件来进行调整 扩增不好时, 一般可降低退火温度或提高引物浓度, 也可以延长延伸时间 如模板的 GC 含量较高, 可延长变性时间 仍得不到改善时, 建议重新设计引物 反应体积太小会导致检测精度下降 请根据定量 PCR 仪推荐的反应体积重新实验 8