天净沙系列CAT#:130407-1 低温运输,-20 保存 克必隆 ets cdna 文库构建试剂盒 ets cdna Library Construction Kit 使用手册 V1.0 北京天恩泽基因科技有限公司 北京市海淀区上地信息路 26 号北京市留学人员海淀创业园中关村创业大厦 506 网址 :www.tiandz.com; 电话 :400-6765278; 电邮 :order@tiandz.com
产品及特点 传统的 Template Switch(TS) 技术, 也称 SMART 技术, 是指一种高效合 成全长 cdna 的技术, 它利用 MMLV 逆转录酶的末端转移酶及模板自动转换 功能, 合成全长 cdna 本公司 ets 技术是在 TS 基础上对 TS 引物进行了重大改进 优化, 极大降低了背景, 具有更强的专一性 本试剂盒是基于 ets 技术的 cdna 文库构建试剂盒, 它具有下列特点 : 1. 高效合成全长 cdna 文库, 不需要 Adaptor 的连接 2. 灵敏度高, 最低只需纳克级总 RNA 3. 一管式操作 ( 快捷 ) 或者两管式操作 ( 保真性高 ) 均可 4. 得到全长的 cdna 文库, 也不需要 Adaptor 的连接 规格及成分 成份编号规格 本产品 130407 1 套 使用手册 1 份 运输及保存低温运输,-20 保存, 有效期一年 使用方法 A. 第一链 cdna 合成 1. 在 0.5-ml 离心管中混匀以下试剂 : 1 3 μl RNA 样本 1 μl ets Oligonucleotide 1 μl ets 3 PCR Primer 如果总体积 <5 μl 时, 用水补齐至 5 μl 2. 混匀试剂并瞬时离心 3. 72 孵育 2 min 冰上冷却 2 min 4. 瞬时短暂离心 5. 向每管反应中加入以下试剂 : 2.0 μl 5 First-Strand Buffer 1.0 μl DTT (20 mm) 1.0 μl dntp Mix (10 mm) 1.0 μl ets MMLV Reverse Transcriptase 10.0 μl 总体积 6. 使用枪轻柔地混匀试剂, 并瞬时离心 7. 42 C 孵育 1 hr 所得 cdna 可通过 PCR 法 ( 步骤 B) 或引物延伸合成
法 ( 步骤 C) 合成 ds cdna 采用步骤 C 的话, 需要先向反应管中加入 1 μ L 氢氧化钠,68 孵育 30 min, 然后再进入步骤 C B. PCR 法扩增合成 cdna 1. 在一个新的 0.5-ml 离心管中混匀以下试剂 : 2 μl First-Strand cdna (from A 节第 7 步 ) 80 μl H 2 O 10 μl 10 PCR Buffer 2 μl 50 dntp Mix 2 μl 5' PCR Primer 2 μl ets 3' PCR Primer 2 μl 50 Polymerase Mix 100 μl 总体积 2. 使用枪轻柔地混匀试剂, 并瞬时离心 3. 如果需要可以向管中加 2 滴矿物油, 盖上管盖, 置于预热 (95 ) 的 PCR 仪器中 4. 以下程序选择一种进行扩增 : 体系 A 95 1 min x cycles*: 体系 B 95 20 sec x cycles*: 95 15 sec 95 5 sec 68 6 min 68 6 min * 根据 RNA 样品的情况选择下表中最优循环数 : 总 RNA(μg) Poly A + RNA(μg) 建议循环数 1.0-2.0 0.5-1.0 18-20 0.5-1.0 0.25-0.5 20-22 0.25-0.5 0.125-0.25 22-24 0.05-0.25 0.025-0.125 24-26 5. 取 5μL 产物在 1.1% 琼脂糖 /EtBr 胶上进行检测 6. 然后进入步骤 D C. 引物延伸法扩增 ds cdna
1. 混匀以下试剂 : 11 μl First-Strand cdna (from A 节第 8 步 ) 71 μl Deionized H 2 O 10 μl 10 PCR Buffer 2 μl dntp Mix 2 μl 5' PCR Primer 2 μl ets 3' PCR Primer 2 μl 50 Polymerase Mix 100 μl 总体积 2. 使用枪轻柔地混匀试剂, 并瞬时离心 3. 如果需要可以加 2 滴矿物油, 盖上管盖后置于预热 (95 ) 的 PCR 仪器中 4. 以下程序选择一种进行扩增 : 体系 A 体系 B 72 C 10 min 72 C 10 min 95 C 1 min 95 C 20 sec 3 cycles: 3 cycles: 95 C 15 sec 95 C 5 sec 68 C 8 min 68 C 8 min 5. 取 5μL 产物在 1.1% 琼脂糖 /EtBr 胶上进行检测 D. 蛋白酶 K 消化 1. 向 0.5-ml 无菌管加入用 PCR 法或引物延伸法得到的 50 μl 扩增后的 ds cdna(2 3 μg) 和 2 μl 蛋白酶 K (20 μg/μl) 将剩余 ds cdna 置于 20 保存 2. 混匀试剂并瞬时离心 3. 45 孵育 20 min, 瞬时离心 4. 加入 50 μl Deionized H 2 O 5. 再加入 100 μl 酚 : 氯仿 : 异戊醇, 轻柔地连续颠倒 1 2 min 6. 14,000 rpm 离心 5 min 7. 将最上层液体 ( 上清液 ) 转移到 0.5-ml 干净的管 8. 加入 100 μl 酚 : 氯仿 : 异戊醇, 轻柔地连续颠倒 1 2 min
9. 14,000 rpm 离心 5 min 10. 将最上层液体 ( 上清液 ) 转移到 0.5-ml 干净的管 11. 加入 10 μl 3 M 醋酸钠, 1.3 μl 糖原 (20 μg/μl) 和 260 μl 室温 95% 乙醇, 立即进行 14,000 rpm 室温离心 20 min 12. 小心去除上清液 13. 100 μl 80% 乙醇清洗 14. 空气干燥 (~10 min) 来挥发残留的乙醇 15. 加入 79 μl Deionized H 2 O 重悬 DNA E. SfiI 酶切 1. 在 0.5-ml 离心管中混匀以下试剂 : 79 μl cdna ( 上节第 15 步 ) 10 μl 10 Sfi Buffer 10 μl SfiI Enzyme 1 μl 100 BSA 100 μl 总体积 2. 混匀并在 50 孵育 2 hr 3. 加入 2 μl 1% 二甲苯腈蓝, 混匀 F. cdna 分选 1. 标记 16 个 1.5-ml 离心管, 按顺序摆放在管架中 2. 准备 Tiandz-400 纯化柱 : a. 室温放置纯化柱 1 hr 然后颠倒数次混匀胶质 b. 赶走纯化柱中的气泡, 使用 1000-μl 移液器轻柔地重悬胶质 去除底盖让液体滴落 c. 将纯化柱放置在环形支架上 d. 借助重力将柱中存储液排干 ( 胶质的顶端应该处于柱外表面 1.0-ml 标记处 ) e. 流速 ~1 滴 /40 60 sec, 每滴体积 ~40 μl 3. 当存储液排干后, 加入 700 μl 柱纯化缓冲液并将其排干
4. 向胶质中央加入 ~100 μl SfiI 消化后的 cdna 和二甲苯腈蓝混合液 ( 来于上节第 3 步 ) 5. 当样本被胶质完全吸收后再进行下一步骤 6. 向胶质中央加入 100 μl 缓冲液清洗纯化柱 7. 排干缓冲液, 胶质表面不能有液体残留 当无液体滴落时, 再进行下一步骤 8. 将步骤 1 中离心管放置在纯化柱下方, 使标记 1 的管对准纯化柱下方液体出口处 9. 加入 600 μl 缓冲液后立即使用管 1 16 分别收集连续的 1 滴液体 ( 每管 ~35 μl) 10. 从 16 管中各取 3 μl 在 1.1% agarose/etbr gel 上 150 V. 电泳 10 min 检测分析 将最能代表实验样本 cdna 大小范围的头 3-4 滴所对应管中的样本合并到一管 11. 向管中加入以下试剂 : 1/10 vol. Sodium Acetate (3 M; ph 4.8) 1.3 μl Glycogen (20 mg/ml) 2.5 vol. 95% ethanol ( 20 C) 12. 前后轻柔地摇晃管使试剂混匀 13. 20 或干冰 / 乙醇中放置 1 hr 14. 14,000 rpm 室温离心 20 min 15. 小心吸掉液体 16. 短暂瞬时离心 17. 小心洗掉液体, 然后空气干燥 ~10 min 18. 加入 7 μl Deionized H 2 O 重悬 DNA 颗粒 G. cdna 连接载体 1. 标记 3 个 0.5-ml 离心管, 并向管中分别加入下表中所列试剂 混匀并瞬时离心 成分 1 st ligation(μl) 2 nd ligation(μl) 3 rd ligation(μl) cdna(from F.18) 0.5 1.0 1.5
Vector(500ng/ul) 1.0 1.0 1.0 10 ligation Buffer 0.5 0.5 0.5 ATP (10 mm) 0.5 0.5 0.5 T4 DNA Ligase 0.5 0.5 0.5 Deionized H 2 O 2.0 1.5 1.0 总体积 5.0 5.0 5.0 2. 16 孵育过夜 3. 直接进行转化 4. 3 个连接体系可获得 1 2 10e6 个单克隆 未扩增的文库在 4 可保存 2 weeks 5. 如果文库 <1 2 10e6 克隆, 可将剩余的 cdna 进行连接载体 使用表中 cdna 和载体比例重复连接反应能够收获最好的结果 ; 也可以根据 cdna 的使用量来扩大体系来做连接 再进行包装反应和滴度测定实验 6. 为了提高文库的稳定性, 首先将步骤 G.4 中包装反应物合并, 然后对文库进行扩增 扩增后的文库 4 C 可放置 6 7 months, 或在 70 (in 7% DMSO) 可放置 1 年 关联产品克必隆 ets 核心试剂盒 ( 产品编号 :130412)