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Custom gene qrt-pcr Quantitation Kit For the detection and quantification of mrnas using real-time RT-PCR detection instruments User Manual Version 1406

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介绍 产品简介 本产品为客户提供了便捷, 准确的基因定量检测试剂, 此反应体系经精心优化, 检测特异性强, 扩增效率高, 为您提供相关基因研究提供了强有力的工具 相对定量的计算基础 基因表达的相对定量是由实验中得到的阈值循环数 (Ct) 计算而来 阈值循环数是指在这一个循环时,ΔRn 出现具有统计学意义的增长并且第一次被检测到 这样, 在 PCR 反应时, 含有更高初始模板浓度的样品就会比低模板浓度的样品更早到达检测阈值, 并得到一个更小的阈值循环数 一次理想的定量实验中,PCR 反应的每个循环中, 产物都会成倍增长 因此阈值循环数每相差 1 个单位就等于 2 倍的初始模板浓度的差距 例如, 如果 Ct 值增加了 1 个单位, 那么初始模板浓度就减少一倍 ; 如果 Ct 值减少一个单位, 那么就说明初始模板浓度增加了一倍 因此这种属性被应用于计算目标基因和内参基因之间表达的相对定量值 更多信息请参照手册中数据分析部分 3

组分和保存 客户定制基因定量检测试剂盒包括以下组分, 按照所述条件短期贮存, 长期贮存请全部置于 20, 保质期 3 个月, 如果需要将 dntp 探针等试剂分装成小份避免试剂反复冻融, 如反复冻融扩增效果和保质期将会根据冻融次数缩短 Reagent Amount Storage 50rxns 100rxns 200rxns 500 rxns RT buffer(5 ) 200μl 400μl 0.8mL 2 1 ml 4 dntp (10mM) 40μl 80μl 160μl 400μl -20 MMLV Reverse Transcriptase(200U//µl) 10μl 20μl 40μl 100μl -20 Random N6 (100uM) 250μl 500μl 1mL 2.5mL 4 Gene specific RT primer(10µm) 10μl 20μl 40μl 100μl 4 Gene specific primer Set(10µM) 20μl 40μl 80μl 200μl 4 Gene specific probe(10µm) 1 20μl 40μl 80μl 200μl 4 ROX reference dye(50 ) 2 20μl/100uL 40μl/200uL 80μl/400uL 200μl/1mL 4 Real-time PCR Master Mix(2 ) 3 0.5mL 1 ml 2 1 ml 5 1 ml 4 rtaq DNA polymerase (5U/µl) 10μl 20μl 40μl 100μl -20 RNase free H 2 O 1.5 ml 1.5 ml 2 1.5 ml 5 1.5 ml 4 Sterilized H 2 O 1.0 ml 1.0 ml 2 1.0m l 5 1.0ml 4 1 Gene specific probe(10µm) 为探针法试剂盒专有的 TaqMan 探针,5 标记 FAM 荧光基团,3 标记 BHQ1 荧光基团, 其原理是利用 Taq 酶的 3 5 外切酶活性, 在 PCR 过程中水解探针, 从而产生和目的片段同步增长的荧光信号, 请务必将探针避光保存 ; 2 ROX Reference Dye 是用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差, 需要使用低浓度 ROX Reference Dye 校正的仪器有 Applied Biosystems 7000/7300/7500/7500 Fast/7900 Real- Time PCR System, 需要使用高浓度 ROX Reference Dye 校正的仪器有 Applied Biosystems Step OnePlus Real-Time PCR System, 其他品牌仪器不需要 ROX 校准,ROX Reference Dye 需要避光保存 ; 3 吉玛的专用的荧光定量 PCR 缓冲混合液, 预混了反应所需的试剂, 其中染料法试剂盒的 Master Mix 含有 SYBR Green I 荧光染料, 需要避光保存, 而探针法试剂盒的 Master Mix 不含荧光染料, 所以不需要避光保存 用户需要提供的材料 良好光学性能的 PCR 管及 96 孔板 为了消除在荧光检测的步骤中由于 PCR 管或是 PCR96 孔板所带来的误差, 我们推荐您使用与 ABI PRISM 7000/7300/7500/7900, MX3000p/ 4000p 等仪器配套的 PCR 管及 96 孔板 RNA 酶抑制剂 (RNasin) 4

方法 1. 基因特异性逆转录引物的稀释 试剂盒中提供的基因特异性逆转录引物是 10μM 的贮存液, 针对本试剂盒, 使用时稀释 10 倍成 1μM 逆转录引物工作液 在一次标准的基因特异性逆转录中, 逆转录引物的终浓度为 60nM 此用量针对本试剂盒提供的 MMLV 酶, 如果逆转录酶为客户自购, 以说明书为准 为了节省逆转录试剂和获得更稳定的结果, 我们建议可以将数个目标基因逆转录引物 (eg. 12μl) 和内参逆转录引物 (eg. GAPHD RT 引物 12μl) 混合, 一起稀释 10 倍成 1μM 逆转录引物工作液, 一次逆转录反应同时得到目标基因和内参基因定量 PCR cdna 模板, 获得和分开逆转录同样的效果 经试验测试, 对于同一样品, 内参基因定量 RT-PCR 无批间差异, 结果稳定 本试剂盒提供了 2 种逆转录体系, 可以根据要求选择其中 1 种 2.1 随机引物 N6 逆转录反应体系的制备 A. 在无 RNase 的离心管中混合下列试剂进行预变性 : Component Final Con. Vol/1 rxns Random N6 (100uM) 25nM 5μl RNA Sample 1 1-3μg 2μl 1 RNA 模板量可以根据实验的需要从 1μg 到 3μg 或者更多 B. 加热 70 5min 后, 马上放于冰盒上 ; C. 按照下表提供的 20μl 逆转录反应体系混合其他试剂 Component Final Con. Vol/1 rxns 5 MMLV RT Buffer 1 4μl dntp(10mm) 0.375 mm 0.75μl RNasin(40U/μl) 0.5U/μl 0.25μl MMLV Reverse Transcriptase(200U/μl) 1 40 U 0.2μl RNase Free H2O To 13μl 1 在逆转录反应之前须将除了逆转录酶外的各种试剂混匀, 可用手指轻弹装试剂的管子, 逆转录 mix 可用移液器吸打几次, 千万不要用振荡器 D. 运行逆转录程序 : 37 60 分钟,85 5 分钟,4 保存 5 逆转录反应 85 5 分钟结束后立即将 cdna 产物取出, 快速置冰上冷却, 后续所有步骤都在冰上进行, 不要将 cdna 产物随便从冰上移走

2.2 基因特异性逆转录反应体系的制备 A. 在无 RNase 的离心管中混合下列试剂进行预变性 : Component Final Con. Vol/1 rxns Gene specific RT primer (1uM) 60nM 1.2μl RNA Sample 1 1-3μg 2μl 1 RNA 模板量可以根据实验的需要从 1μg 到 3μg 或者更多 B. 加热 70 5min 后, 马上放于冰盒上 ; C. 按照下表提供的 20μl 逆转录反应体系混合其他试剂 Component Final Con. Vol/1 rxns 5 MMLV RT Buffer 1 4μl dntp(10mm) 0.375 mm 0.75μl RNasin(40U/μl) 1 0.5U/μl 0.25μl MMLV Reverse Transcriptase(200U/μl) 2 40 U 0.2μl RNase Free H2O To 16.8μl 1 RNasin 为非必需试剂, 请客户自备 ; 2 在逆转录反应之前须将除了逆转录酶外的各种试剂混匀, 可用手指轻弹装试剂的管子, 逆转录 mix 可用移液器吸打几次, 千万不要用振荡器 D. 运行 mrna 逆转录程序 : 42 45 分钟,85 5 分钟,4 保存 逆转录反应 85 5 分钟结束后立即将 cdna 产物取出, 快速置冰上冷却, 后续所有步骤都在冰上进行, 不要将 cdna 产物随便从冰上移走 3.mRNA 逆转录产物的操作将 cdna 产物取 2μl 作为荧光定量 PCR 反应的模板, 如果逆转录引物工作液是多种基因逆转录引物的混合液, 此 cdna 产物可作为其荧光定量 PCR 反应共同模板 cdna 暂时不用, 可将其存放于 -20, 三天内可保持稳定, 长期保存请冻存于 -80 6

4. 定量 PCR 反应 mix 制备 1. 确保 2 Master Mix( 如果保存在 -20 ) 50 ROX Reference Dye 引物 模板完全 溶解, 所有的试剂都在管底或板孔底部, 建议客户在使用前混匀并低速离心 2. 建议置于冰上进行 Real Time PCR 反应液的配制 : 表一 染料法定量 PCR 20μl 反应体系 Component Final Con. Vol /1 rxns 2 Real-time PCR Master Mix (SYBR) 1 10μl Gene specific Primer set(10μm) 1 0.2μM 0.4μl ROX reference dye(50 ) 3 1 or 5 0.4μl or 2μl Taq DNA polymerase(5u/μl) 1 U 0.2μl RT product 2μl Sterilized H 2 O To 20μl 表二 探针法定量 PCR 20μl 反应体系 Component Final Con. Vol /1 rxns 2 Real-time PCR Master Mix (FAM) 1 10μl Gene specific Primer set (10μM) 1 0.2μM 0.4μl Gene specific Probe (10μM) 2 0.10μM-0.20μM 0.2 μl-0.40ul ROX reference dye(50 ) 3 1 or 5 0.4μl or 2μl Taq DNA polymerase(5u/μl) 1 U 0.2μl RT product 2μl Sterilized H 2 O To 20μl 1 引物终浓度为 0.2 μm 可以在大多数体系中获得良好的扩增结果 可以在 0.1-0.5μM 范围内调整 : 扩增效率不高时, 可增加 PCR 反应体系中的引物浓度 ; 发生非特异扩增时, 可适当减少 PCR 反应体系中的引物浓度 ; 2 探针体系会因序列不同浓度有所调整, 表中给出的是通用的范围, 每个试剂盒都经过吉玛公司精心的验证, 具体条件可以质检报告所述条件为参考 ; 3 ROX Reference Dye 是用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差,Applied Biosystems 7000/7300/ 7500/7500 Fast/7900 Real-Time PCR System 配套 ROX 终浓度 1 (0.4μl ),Applied Biosystems Step OnePlus Real-Time PCR System 配套 ROX 终浓度为 5 (2μl ), 其他品牌仪器不需要 ROX 校准 5. 实时定量 PCR 反应程序 阶段循环温度时间荧光信号采集 预变性 1 95 3 min PCR 反应 40 95 12 seconds 62 40 seconds 采集 染料法荧光基团选择 SYBR, 探针法荧光基团选择 FAM, 淬灭基团选择 NONE; 需要 ROX 校准的仪器选择 ROX 作为校准染料 7

数据分析 1. 设置一个校正样品 在做相对定量之前, 首先必须确定校正样品, 通常校正样品可以是正常的或是没经过实验处理的样品 2. 选择合适基因作为标准化内参 相对 Ct 法定量, 标准化基因通常为管家基因或者一些经过表达谱分析验证过的基因 可以用目标基因的 Ct 值减去标准化基因的 Ct 值得到校正样品和其他样品的 Ct 我们推荐任何一个样品的标准化基因的 Ct 值不能大于或等于 30, 如果该基因的 Ct 值确实稳定在 30 或以上, 您可以考虑增加用于逆转录的初始总 RNA 的量 计算目标基因相对于标准化基因的表达比率 每个样品对应每个基因至少要做 2-3 个复孔 第一步设计基因相对定量实验 校正样品 1 2 3 样品 1 1 2 3 样品 3 1 2 3 第二步进行荧光定量 PCR 反应来得到每个反应的目标基因和标准化基因的 Ct 值 校正样品 样品 1 样品 2 GAPDH P53 GAPDH P53 GAPDH P53 Ct 1 24.60 26.21 23.63 30.40 22.66 24.21 Ct 2 24.31 26.15 23.40 30.35 22.56 24.60 Ct 3 24.72 26.35 23.52 30.41 22.48 24.66 注意复孔间的 Ct 值差异不要大于 0.5, 否则我们推荐重复实验 第三步计算样品和校正样品三复孔的平均值 校正样品样品 1 样品 2 GAPDH P53 GAPDH P53 GAPDH P53 Average Ct 24.54 26.24 23.51 30.39 24.49 22.56 8

第四步目标基因的平均 Ct 值减去 GAPDH 的 Ct 平均值, 计算各个样品的 Ct 值 Sample 1 Ct= Ct ( P53 ) - Ct ( GAPDH) = 30.39-23.51 = 6.88 校正样品 样品 1 样品 2 GAPDH P53 GAPDH P53 GAPDH P53 Average Ct 24.54 26.24 23.51 30.39 24.49 22.56 ΔCt - 1.70-6.88-1.93 第五步样品的 ΔCt 值减去校正样品的 ΔCT 值, 计算得到各个样品的 ΔΔCT 值 ΔΔCt (sample1) = ΔCt (sample1) ΔCt (calibrator1) = 6.88-1.70 = 5.18 校正样品 样品 1 样品 2 GAPDH P53 GAPDH P53 GAPDH P53 Average Ct 24.54 26.24 23.51 30.39 24.49 22.56 ΔCt - 1.70-6.88-1.93 ΔΔCt - 0.00-5.18-0.23 Relative Expression Ratio (sample1) = 2 ΔΔCt (sample1) = 2 5.18 = 0.027 第六步计算相对表达比率 校正样品样品 1 样品 2 GAPDH P53 GAPDH P53 GAPDH P53 Average Ct 24.54 26.24 23.51 30.39 24.49 22.56 ΔCt - 1.70-6.88-1.93 ΔΔCt - 0.00-5.18-0.23 2 ΔΔCt - 1.00-0.027-0.85 9

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