182 研究论文 而胃癌是我国常见的消化道恶性肿瘤, 发病率有逐年 增高的趋势, 已位于我国人群高发性恶性肿瘤前三 位, 治疗失败的原因多为肿瘤的复发 侵袭和转移 [1] 长非编码 RNA(large intergenic non-coding RNA, lincrna) 调节染色体基因 DNA 的

DOI: 1.11844/cjcb.215.8.72 Chinese Journal of Cell Biology 215, 37(8): 181 186 陈登宇 徐志本 郑庆委 下调lincRNA HOTAIR对胃癌迁移及 增殖抑制作用的研究 (蚌埠医学院病原学教研室, 安徽省感染与免疫重点实验室, 蚌埠 2333) 通 过 下 调 人 胃 癌 细 胞BGC823中lincRNA HOTAIR基 因 的 表 达, 该 文 探 讨 了lincRNA 摘要 HOTAIR低表达对胃癌迁移 侵袭及增殖能力的影响 该文构建针对人lincRNA HOTAIR基因的 干扰质粒, 稳定转染入胃癌BGC823 筛选稳转株, qpcr检测lincrna HOTAIR在胃癌细 胞中表达水平 采用划痕试验 侵袭试验 MTT法分别检测转染胃癌迁移 侵袭及增殖能力 结果表明, 稳定转染干扰质粒后下调lincRNA HOTAIR表达的胃癌株迁移 侵袭及 增殖能力较阴性对照组明显减弱 下调胃癌中lincRNA HOTAIR的表达, 可降低胃癌的迁移 力 侵袭性 抑制其增殖能力, 提示lincRNA HOTAIR可作为分子靶点用于胃癌的分子靶向治疗 胃癌; lincrna HOTAIR; RNA干扰; 靶向治疗 关键词 Study of Downregulated LincRNA HOTAIR on Migration and Proliferation Inhibition of Gastric Cancer Cells Chen Dengyu, Xu Zhiben, Zheng Qingwei (Department of Pathogenic Biology, Bengbu Medical College, Anhui Key Laboratory of Infection and Immunity, Bengbu Medical College, Bengbu 2333, China) Abstract This work was aim to study the effect of downregulating lincrna HOTAIR expression on the migration and proliferation of BGC823 gastric cancer cells. The short hairpin RNA was transfected into BGC823 gastric cancer cells, and the stably transfected cells were isolated by G418 selection. The lincrna HOTAIR gene expression was detected by qpcr. The abilities of migration, invasion and proliferation of transfected gastric cancer cells were investigated in the ways of wound healing and transwell invasion and MTT assays. The results showed that the abilities of migration, invasion and proliferation of the gastric cancer cells of low lincrna HOTAIR expression were significantly decreased compared with the control group. Targeting lincrna HOTAIR expression in gastric cancer cells with RNA interference could significantly reduce and inhibit the migration and proliferation abilities of gastric cancer cells. These data suggested that lincrna HOTAIR could be one potential therapeutic target for human gastric caner treatment. Keywords gastric cancer; lincrna HOTAIR; RNA interference; targeted therapy 由于聚餐式饮食习惯和不良卫生环境因素, 我国 的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)交叉感染较为 普遍 Hp感染可引起慢性活动性胃炎 胃及十二指 肠慢性溃疡 胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌[1-2] 收稿日期: 215-3-3 接受日期: 215-7-8 蚌埠医学院科技发展基金重点项目(批准号: Bykf13A8)资助的课题 通讯作者 Tel: 552-3175275, E-mail: chengong131@sina.com Received: March 3, 215 Accepted: July 8, 215 This work was supported by the Key Fund Project of Science and Technology Development of Bengbu Medical College (Grant No.Bykf13A8) Corresponding author. Tel: +86-552-3175275, E-mail: chengong131@sina.com 网络出版时间: 215-7-29 1:59:19 URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/31.235.q.215729.159.2.html

182 研究论文 而胃癌是我国常见的消化道恶性肿瘤, 发病率有逐年 增高的趋势, 已位于我国人群高发性恶性肿瘤前三 位, 治疗失败的原因多为肿瘤的复发 侵袭和转移 [1] 长非编码 RNA(large intergenic non-coding RNA, lincrna) 调节染色体基因 DNA 的转录表达, lincrna 中有一种为 HOX 转录反义 RNA(HOX antisense intergenic RNA, HOTAIR) 高表达与肿瘤 侵袭转移有关 [3], 对肿瘤迁移侵袭转移相关的 上皮 间质转化 (epithelial-mesenchymal transition, EMT) 进程相关基因同源异型基因 (homeotic genes, HOX) 等转录调控发挥重要作用 LincRNA HOTAIR 调控 HOX 对增殖与定向分化作用, HOTAIR 的 5 端可招募结合多梳蛋白抑制复合物 2(polycomb repressive complex 2, PRC2), 借助 PRC2 上甲基化酶 使另一基因座 HOXD 上长约 4 Kb 的序列转录沉默, 从而使内转录倾向于成纤维样表型 [3-4] 本课题拟探讨 lincrna HOTAIR 在胃癌侵袭 转移中对癌上皮 间质转化进程的调控作用, 研 究下调 lincrna HOTAIR 对胃癌迁移 侵袭及增 殖能力的影响, 以期阐明肿瘤新靶点, 有利于临床抗 肿瘤药物开发并用于胃癌侵袭转移的分子靶向治疗 1 材料与方法 1.1 与试剂 人胃癌株 BGC823 购自科学院上海 库 ; Trizol 试剂购自 Invitrogen 公司 ; RT-PCR 及 qpcr 试剂盒购自北京天根生化科技有限公司 ; 限制 性核酸内切酶 Hind III Bgl II 及 T4 DNA 连接酶购 自大连宝生公司 ; 质粒小提及割胶纯化试剂盒 购自 Axygen 公司 ; 脂质体 2 购自 Invitrogen 公司 ; G418 购自 Sigma 公司 ; matrigel 基质胶购自 BD 公司 ; Transwell 小室购自 Corning 公司 ; MTT 检测试剂盒购 自南京凯基科技公司 1.2 RT-PCR 及 qpcr 检测 胃癌 BGC823 抽提总 RNA, 随机引物逆转 录 RNA, RT-PCR 及 qpcr 扩增 lincrna HOTAIR 等基 因, 以 U6 作为内参 lincrna HOTAIR 引物, 上游 5 - GGT AGA AAA AGC AAC CAC GAA GC-3, 下游 5 - TTG GGG AAG CAT TTT CTG AC-3, 产物 744 bp; U6 引物, 上游 5 -CTC GCT TCG GCA GCA CA-3, 下游 5 -AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3, 产物 94 bp ABI StepOnePlus 荧光定量 PCR 仪检测 E- 钙黏附 蛋白 (E-cadherin) 引物, 上游 : 5 -TAC ACT GCC CAG GAG CCA GA-3, 下游 : 5 -TGG CAC CAG TGT CCG GAT TA-3, 产物 13 bp; 内参 β-actin 引物, 上游 : 5 -GGA CTT CGA GCA AGA GAT GG-3, 下游 : 5 - AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG-3, 产物 234 bp 1.3 干扰质粒构建及转染 根据国外文献 [4] 查找靶向 lincrna HOTAIR 基 因 (Gene ID: 11247) 的有效 sirna 序列, 根据干 扰质粒 psuper-egfp1 载体要求合成 shrna 寡核苷 酸模板, shrna 基因由上海 Invitrogen 公司合成, Bgl II 和 Hind III 酶切残基连接入载体质粒 同时, 合成 不靶向任何基因的阴性对照序列 scramble-shrna HOTAIR-shRNA 序列正义链 : 5 -GAT CCC CGA AC GGG AGT ACA GAG AGA TTC AAG AGA TCT CTC TGT ACT CCC GTT CTT TTT GGA AA-3 ; 反 义链 : 5 - AGC TTT TCC AAA AAG AAC GGG AGT ACA GGA GAT CTC TTG AAT CTC TCT GTA CTC CGT TCG GG-3 -shrna 序列, 参考以往 工作文献 [5] 构建质粒 psuper-egfp1-hotairshrna( 简称 ), 双酶切及测序鉴定, 稳定 转染肿瘤后可产生 HOTAIR-siRNA: 5 -GAA CGG GAG UAC AGA GAG A-3, 干扰 HOTAIR 基因 的表达 ; 同法构建和转染 psuper-egfp1-scrambleshrna( 简称 scramble) 质粒, 稳定转染肿瘤后可 产生 scramble-sirna: 5 -UUC UUC CGA ACG UGU CAC GU-3, 不干扰任何基因的表达, 为阴性对照组 使用 以脂质体 2 将构建的干扰质粒分别转染入 胃癌后, 以干扰质粒 GFP 绿色荧光蛋白表达及 G418 抗性的特征及有限稀释法筛选出稳定转染胃 癌株, 挑选三个单克隆组成混合系, 扩 大培养, 用于后续功能性实验检测 1.4 划痕试验 (Wound healing assay) 肿瘤迁移力检测采用划痕试验的方法 [5], 将待 观测 质粒稳定转染胃癌及 scramble 阴性对照质粒稳定转染胃癌分别种于 6 孔板中, 重复 3 孔, 待生长融合度达到 95% 左右后, 更换含 5% 小牛血清 164 培养液进行划痕检测 分析计算愈合 度 (healing degree)=(1 某时点划痕宽度 / 原始划痕宽 度 ) 1%, 判定迁移能力 1.5 Transwell 小室基质胶侵袭试验 (Transwell invasive assay) 肿瘤侵袭力检测采用 Transwell 小室 Matrigel

陈登宇等: 下调lincRNA HOTAIR对胃癌迁移及增殖抑制作用的研究 183 基质胶侵袭实验的方法, 测定转染胃癌BGC823 构建的干扰质粒序列正确与否 插入的 侵袭溶解穿越基质胶的能力 放Transwell小室于24 shrna正向序列为: 5 -GAT CCC CGA ACG GGA GTA 孔板内, 将稀释好的基质胶置于Transwell上层, 凝固 CAG AGA GAT TCA AGA GAT CTC TCT GTA CTC 后每孔种植2 1, 小室下层加含血清完全培养 CCG TTC TTT TTG GAA A-3 图1为干扰 基, 孵育24 h后取出小室, 清洗 固定 染色, 晾干后 质粒正向测序, 所插入位置可查见所要序列, 见图中 倒置显微镜下2倍镜观察并计数分析 下划线部分基因, 说明干扰质粒构建正确 4 1.6 MTT法测定生长曲线 MTT法采集数据, 绘制实验组及对照组的 生长曲线 分别将各组转染用含血清培养液配 制成单悬液, 计数后接种于96孔培养板, 每 孔1 14, 同时设立空白组, 共培养7 d, 每2 d换 阴 性 对 照shRNA-scramble序 列 正 义 链 为: 5 - GAT CCC CTT CTC CGA ACG TGT CAC GTT TCA AGA GAA CGT GAC ACG TTC GGA GAA TTT TTG GAA A-3 构建的阴性对照干扰质粒正向测 序如图2所示, 划线部分可查见所要序列, 说明阴性 液1次 第2, 3, 4, 5, 6 d, 分别每组各取6孔, 加 对照干扰质粒scramble构建成功 入MTT试剂进行检测, 酶联免疫检测仪上49 nm波 2.2 定量PCR检测转染lincRNA HOTAIR表达量 提 取 稳 定 转 染 胃 癌 细 胞 株, RNA逆 转 录 后, qpcr测 定lincRNA HOTAIR RNA表 达 量 结 果 显 示, 稳定转染的胃癌较scramble转染 胃癌中lincRNA HOTAIR表达显著下降, 差异极 显著(P<.1)(图3) 该结果表明, 干扰有 效, 获得的lincRNA HOTAIR下调胃癌株可用于 长测定各孔吸光度(D)值, 以时间为横轴, D值为纵轴 绘制生长曲线 1.7 统计学方法 实验重复3次, 统计数据以平均数±标准差表示, 运用GraphPad.Prism.v5.软件进行数据统计分析并 作图, 配对t检验, P<.5认为差异具有统计学意义 2 结果 lincrna HOTAIR下调后相关功能性实验 2.3 下调lincRNA HOTAIR对胃癌的迁移能 力及基质胶侵袭能力影响 对划痕实验中24, 48 h时间点划痕愈合度进行 2.1 构建干扰质粒 针 对lincRNA HOTAIR的siRNA干 扰 序 列 为: 5 GAA CGG GAG TAC AGA GAG A-3 基因测序验证 14 15 16 17 18 19 2 21 22 图1 psuper-egfp1-基因测序图 Fig.1 psuper-egfp1- gene sequencing map 5 6 7 8 9 1 11 图2 psuper-egfp1-scramble质粒正向测序图 Fig.2 psuper-egfp1-scramble plasmid forward sequencing map 12 13

研究论文 184 果显示, 组胃癌较scramble组侵袭力 明显下降, 差异极显著(图5A和图5B)(P<.1) 2.4 下调lincRNA HOTAIR对胃癌增殖能力 的影响 MTT法 细 胞 增 殖 实 验 结 果 显 示(图6), 下 调 lincrna HOTAIR后胃癌增殖能力较阴性对照组 明显下降, 差异有统计学意义, 显示lincRNA HOTAIR 11 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 下 调 后 减 缓 了 胃 癌 细 胞 增 殖 能 力 培 养 第3, 4 d, LincRNA HOTAIR relative expression (%) P<.1 组胃癌较scramble组增殖能力下降, 差 图3 定量PCR检测转染lincRNA HOTAIR表达量 Fig.3 The expression of lincrna HOTAIR in cells detected by qpcr 异有统计学意义(P<.5) 培养第5, 6 d, 组 胃癌较scramble组增殖能力明显下降, 差异极显 著(P<.1) 度下降, 差异有统计学意义(图4A和4图B)(P<.5) 2.5 下调lincRNA HOTAIR对胃癌的E-cadherin 表达的影响 定量PCR法检测不同转染E-cadherin表达 情况, 结果显示(图7), 下调lincRNA HOTAIR后胃癌 Transwell小室基质胶侵袭实验结果为5个随机镜下 E-cadherin mrna表达水平较阴性对照组增加, 视野计数出每孔侵袭平均数进行比较, 统计结 差异有统计学意义, 表明lincRNA HOTAIR下调后增 的胃癌较转染阴性对照scramble质粒愈合 (A) h 24 h 48 h (B) Healing degree (%) 比较, 结果显示, 稳转下调HOTAIR表达 8 6 4 2 A: 划痕试验(2 ); B: 划痕愈合率, P<.5 A: wound healing assay (2 ); B: the cell recovery rate of wound-healing assay, P<.5. 48 h 24 h 图4 迁移试验检测转染胃癌迁移能力 Fig.4 The migration ability of cells detected by wound healing assay (B) Invasive cells per field (A) 12 1 8 6 4 2 A: 穿过铺基质胶的Transwell小室的(2 ); B: 穿过Transwell小室的数统计, P<.1 A: invasive cells of Transwell invasion assay (2 ); B: the number of invasive cells, P<.1. 图5 Transwell小室基质胶肿瘤侵袭试验检测转染胃癌侵袭能力 Fig.5 The invasion ability of cells detected by Transwell invasive assay

陈登宇等: 下调lincRNA HOTAIR对胃癌迁移及增殖抑制作用的研究 15.6 E-cadherin mrna relative expression ratio (%).8 D49 P<.5.4 1 2 3 4 5 6 Time (d) P<.5, P<.1, 与scramble组比较 P<.5, P<.1 vs scramble group. 图6 MTT法检测转染胃癌增殖能力 Fig.6 The proliferation ability of cells detected by MTT assay 75 5 25 图7 定量PCR法检测转染胃癌E-cadherin表达水平 Fig.7 The expression E-cadherin mrna in cells detected by qpcr 示lincRNA HOTAIR在胃癌迁移 侵袭中发挥促 进作用, 对胃癌生长也起到促进作用 加了胃癌E-cadherin表达 1.2 125 1. 185 探讨机制发现, lincrna HOTAIR下调后增加了 3 讨论 胃 癌 细 胞E-cadherin表 达 E-cadherin是 细 胞 间 黏 长非编码RNA(lincRNAs)可在表观遗传调控 附分子, 主要介导同种间的黏附反应, 是维护 转录调控以及转录后调控等多种层面上调控基因 上皮形态和结构完整性和极性的重要分子, 当, 其 中lincRNA HOTAIR高 表 达 与 上 E-cadherin表达失调时可导致间黏附能力下降 皮来源性肿瘤(如乳腺癌 结肠癌)侵袭 转移等 及促进肿瘤的转移[9] 在上皮向间叶转化 密切相关 LincRNA HOTAIR是HOX基因转录反义 的过程中, 主要特点是黏附蛋白及黏附蛋 RNA(HOX transcript antisense RNA, HOTAIR), 长 白调节蛋白表达异常, 使失去正常接触, 造成细 非编码RNA HOTAIR作为lincRNAs的成员之一, 由 胞离散 迁移, 而黏附能力下降是肿瘤发生侵 HOXC基 因 座 转 录, 是 一 个 长 度 为2.2 Kb的 基 因, 袭和转移的前提 因而推测, 下调lincRNA HOTAIR 不编码任何蛋白质, 产物为一段长的非编码RNA, 通过增加E-cadherin表达导致间黏附能力提高, lincrna HOTAIR的高表达与肿瘤转移和预后有关 降低胃癌的迁移 侵袭作用 此外, E-cadherin lincrna HOTAIR可结合HOX基因使其表达发生基 与 胞 膜 及 胞 浆 内β-连 环 蛋 白(β-catenin)相 关 联, 而 因沉默, 但lincRNA HOTAIR如何促进肿瘤转移的具 β-catenin参与wnt信号传递调节的生长增殖[1], 体机制却仍有待阐明, 调控lincRNA HOTAIR的上游 可能为下调lincRNA HOTAIR降低胃癌增殖能力 分子也有待探明 的机制之一 的表达水平 [3-4] 幽门螺杆菌在抗生素等作用后的变异体缺壁 由 此 可 见, 靶 向 下 调lincRNA HOTAIR的 表 达, 菌即Hp-L型在胃癌形成和发展中也发挥一定促进 可以降低胃癌的迁移 侵袭及增殖能力, lincrna, 幽门螺杆菌可使胃癌发生上皮 间质 HOTAIR可以作为候选靶点用于胃癌的分子靶向治 作用 [6-7] 转化及干性增强的表现, 临床治疗时需将Hp-L型 [8] 疗, 作为靶点用于抗癌药物的开发 完全清除才能使在胃炎 消化性溃疡及胃癌防治 中取得良好的疗效 Hp-L型感染可促进胃癌的发 生 发展 侵袭及转移 其中, 需要探明, 通过何种 1 胞内分子发挥作用, 以利于治疗 lincrna HOTAIR可 能为其中的重要调控分子, 本研究发现, 下调lincRNA HOTAIR后, 胃癌迁移 侵袭及增殖能力下降, 显 参考文献 (References) Kim SS, Ruiz VE, Carroll JD, Moss SF. Helicobacter pylori in the pathogenesis of gastric cancer and gastric lymphoma. Cancer Lett 211; 35(2): 228-38. 2 Wen S, Moss SF. Helicobacter pylori virulence factors in gastric carcinogenesis. Cancer Lett 29; 282(1): 1-8.

186 研究论文 3 Endo H, Shiroki T, Nakagawa T, Yokoyama M, Tamai K, Yamanami H, et al. Enhanced expression of long non-coding RNA HOTAIR is associated with the development of gastric cancer. PLoS One 213; 8(1): e777. 4 Gupta RA, Shah N, Wang KC, Kim J, Horlings HM, Wong DJ, et al. Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis. Nature 21; 464(7291): 171-6. 5 陈登宇, 陈峻崧, 王净, 曹文虎, 张洪义, 杨翠萍, 等. 靶向上皮性卵巢癌 SKOV3 ZEB1-shRNA 重组体构建及功能研究. 免疫学杂志 (Chen Dengyu, Chen Junsong, Wang Jing, Cao Wenhu, Zhang Hongyi, Yang Cuiping, et al. Construction of targeting ZEB1-shRNA recombinant and its functional research in epithelial ovarian cancer SKOV3 cells. Chinese Journal of Immunology) 212; 28(7): 611-5. 6 黄谷良, 林特夫, 贾继辉, 叶和平. 幽门螺杆菌 L 型及其致病性. 蚌埠医学院学 (Huang Gulin, Lin Tefu, Jia Jihui, Ye Heping. Helicobacter pylori L-form and its pathogenicity. Journal of Bengbu Medical College) 23; 28(1): 9-12. 7 罗彦丽, 于东红, 周蕾, 蔡兆根, 承泽农. 幽门螺杆菌 L 型感染与胃癌浸润和转移的关系. 癌变. 畸变. 突变 (Luo Yanli, Yu Donghong, Zhou Lei, Cai Zhaogen, Cheng Zenong. Relation between Helicobacter pylori L-form infection in gastric carcinoma and its invasion and metastasis. Carcinogenesis, Teratogenesis & Mutagenesis) 29; 21(5): 384-7. 8 Bessède E, Staedel C, Acuña Amador LA, Nguyen PH, Chambonnier L, Hatakeyama M, et al. Helicobacter pylori generates cells with cancer stem cell properties via epithelial-mesenchymal transition-like changes. Oncogene 214; 33(32): 4123-31. 9 Thiery JP, Acloque H, Huang RY, Nieto MA. Epithelialmesenchymal transitions in development and disease. Cell 29; 139(5): 871-9. 1 Su YJ, Chang YW, Lin WH, Liang CL, Lee JL. An aberrant nuclear localization of E-cadherin is a potent inhibitor of Wnt/ β-catenin-elicited promotion of the cancer stem cell phenotype. Oncogenesis 215; 4: e157.