微生物学通报 Microbiology China tongbao@im.ac.cn Nov. 20, 2015, 42(11): 2272 2281 2015 by Institute of Microbiology, CAS DOI: 10.13344/j.microbiol.china.150072 主编点评文章 温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成 L- 丙氨酸 * 周丽邓璨崔文璟刘中美周哲敏 ( 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡 214122) 摘要 : 目的 L- 丙氨酸的存在导致 Escherichia coli 的生长速率显著降低, 最终会降低发酵过程中 L- 丙氨酸的体积合成速率 用温度调节基因开关 (λp R -p L ) 高效 动态调控重组 E. coli 菌株菌体生长与 L- 丙氨酸合成过程, 使两者相协调 方法 以野生型 E. coli B0016 为出发菌株, 敲除乙酸 甲酸 乙醇 琥珀酸 乳酸代谢产物合成途径以及丙氨酸消旋酶编码基因 (acka-pta pflb adhe frda ldha dadx), 获得菌株 B0016-060B 将嗜热脂肪地芽孢杆菌 (Geobacillus stearothermophilus) 来源的 L- 丙氨酸脱氢酶基因 (alad) 克隆于 p L 启动子下游, 并在 B0016-060B 菌株中表达, 获得菌株 B0016-060B/pPL-alaD, 进行摇瓶和发酵罐发酵考察菌体生长和 L- 丙氨酸发酵性能 结果 竞争代谢途径的敲除显著降低了副产物合成量, 仅形成极少量的乙酸 琥珀酸和乙醇 28 C 下菌株 B0016-060B/pPL-alaD 几乎不合成 L- 丙氨酸, 可保证菌体快速生长 ; 而在 42 C 下可高效合成 L- 丙氨酸 经发酵罐发酵, 可合成 67.2 g/l L- 丙氨酸, 体积生产强度达到 2.06 g/(l h) 结论 通过发酵培养温度的简单切换, 分阶段实现了细胞的快速增量和 L- 丙氨酸的高强度合成 关键词 :L- 丙氨酸, 基因开关, 大肠杆菌, 发酵, 代谢工程 L-alanine production in recombinant Escherichia coli with thermo-regulated genetic switch ZHOU Li DENG Can CUI Wen-Jing LIU Zhong-Mei ZHOU Zhe-Min * (The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China) Abstract: [Objective] Specific growth rate of Escherichia coli could be significantly decreased by L-alanine, which would result in reduction in L-alanine volumetric productivity. Therefore, the λp R -p L promoter was used as a thermo-controllable genetic switch to coordinate the processes of cell growth and L-alanine production in E. coli. [Methods] Synthetic routes for acetate, formate, ethanol, succinate and lactate as well as for L-alanine recemization were inactivated by deleting the corresponding genes (acka-pta, pflb, adhe, frda, ldha, dadx) in the wild-type E. coli B0016 to generate B0016-060B. Subsequently, alanine dehydrogenase derived from Geobacillus stearothermophilus was cloned 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (No. 31300087); 江苏省自然科学基金项目 (No. BK20130131); 中央高校基本科研业务费专项资金项目 (No. JUSRP1004) * 通讯作者 :Tel:86-510-85325210; :zhmzhou@jiangnan.edu.cn 收稿日期 :2015-01-21; 接受日期 :2015-04-07; 优先数字出版日期 (www.cnki.net):2015-05-04
周丽等 : 温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成 L- 丙氨酸 2273 downstream of the p L promoter and expressed in B0016-060B to produce B0016-060B/pPL-alaD. Shake-flask and bioreactor experiments were conducted to investigate the properties of cell growth and L-alanine fermentation. [Results] Deletions of the competing pathways significantly decreased by-products accumulation with formation of low levels of acetate, succinate and ethanol. Strain B0016-060B/pPL-alaD hardly produced L-alanine during cell growth phase at 28 C, which facilitated high growth rate. Meanwhile, efficient L-alanine production was obtained when cultured at 42 C under oxygen-limited conditions. In bioreactor experiment, strain B0016-060B/pPL-alaD produced 67.2 g/l L-alanine, with a productivity of 2.06 g/(l h). [Conclusion] Efficient cell growth and L-alanine production were realized simply by switching the cultivation temperature. Keywords: L-alanine, Genetic switch, Escherichia coli, Fermentation, Metabolic engineering 微生物作为细胞工厂, 已被应用于许多同源及异源代谢产物的生产, 包括发酵型产物 ( 氨基酸 有机酸 有机醇 ) 以及众多次级代谢产物的生产 [1-4] 然而, 其中多数代谢产物的过量合成会对细胞造成伤害, 抑制细胞的生长或者使代谢流失衡 [5-6] 例如, 提高培养基中 L- 丙氨酸的浓度会显著抑制菌株的生长 因此, 希望在细胞生长至较高浓度后再可控地起始目的代谢产物的合成 将发酵过程分成独立的细胞生长阶段和产物合成阶段, 提高了发酵液中生物量, 从而获得了较高的体积生产强度 [7] 然而, 这种调控过程并不严密, 在菌体生长阶段仍可积累一定浓度的目的代谢产物, 与菌体生长竞争底物, 使得合成菌体的能力降低 [6-7] 因此, 需要通过基因工程手段对代谢流进行精确控制 λ 噬菌体启动子 [8] p L 和 p R 能够通过改变培养温度快速 有效地开启或关闭重组蛋白的表达, 且调控严密, 基本无本底表达 [8-9] [10], 显示了其作为代谢调控基因开关的潜在应用价值 在前期研究中, 用 p L 和 p R 启动子成功地对 D- 乳酸发酵过程进行了开关控制, 而该方法在其他代谢产物合成中的应用至今未见报道 L- 丙氨酸是最小的手性分子之一, 被用于医药和兽药行业, 与其他 L- 型氨基酸共同用作手术前和手术后的营养剂 [11] 由于 L- 丙氨酸具有甜味, 也被用于食品添加剂 [12] 目前 L- 丙氨酸是利用固定化 L- 天冬氨酸 -β- 脱羧酶或者德阿昆哈假单胞菌 (Pseudomonas dacunhae) 的细胞菌悬液, 以 L- 天冬氨酸为底物脱羧生产的 [13] 然而, 该生产过程成本 高, 其底物 L- 天冬氨酸是由富马酸经天冬氨酸酶催化合成的, 而富马酸是经石油炼制生产的 随着石油资源的日渐短缺, 以石油基原料为前体进行 L- [13] 丙氨酸合成已不再符合市场发展趋势 利用可再生资源通过微生物发酵合成 L- 丙氨酸受到了人们的关注 [11,14] 近年来, 利用基因工程手段, 将外源丙氨酸脱氢酶基因引入 E. coli 菌株, 在 E. coli 中实现了 L- 丙氨酸的合成, 进一步通过代谢工程策略改造竞争代谢途径, 显著提高了 L- 丙氨酸发酵合成水平和光学纯度 [12,15-16] 然而, 未见精细调节 L- 丙氨酸发酵过程的报道 本文以野生型 E. coli CICIM B0016 为出发菌株, 敲除副产物乙酸 甲酸 乙醇 琥珀酸 乳酸合成途径编码基因 acka-pta pflb adhe frda ldha, 并敲除丙氨酸消旋酶编码基因 dadx; 进一步将来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌 (Geobacillus stearothermophilus) 的 L- 丙氨酸脱氢酶编码基因 alad 克隆在 p L 和 p R 启动子下游, 在上述重组菌中表达, 构建出可通过温度开关控制 L- 丙氨酸合成的新型 E. coli 重组菌株 最后考察温度开关对该重组菌株 L- 丙氨酸发酵过程的控制效果 1 材料与方法 1.1 菌株 质粒和引物 菌株 Geobacillus stearothermophilus B0031 和 Escherichia coli CICIM B0016 由江南大学工业微生物资源和信息中心筛选和保藏 (http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn/) 质粒 pkd46 ( 温度
2274 微生物学通报 Microbiol. China 2015, Vol.42, No.11 敏感型, 含有阿拉伯糖启动子调控的 gam bet 和 exo 基因,Amp r ) pkd13 ( 含有 FRT-Kan-FRT 突变盒,Kan r ) pcp20 ( 温度敏感型, 含有 FLP 重组酶, Amp r ), 购于耶鲁大学基因保藏中心 ppl451 质粒由本中心保藏 所用菌株和质粒见表 1, 引物序列见表 2 ExTaq DNA 聚合酶 Prime Star DNA 聚合酶 各种限制性内切酶和 T4 DNA 聚合酶, 宝生物工程 ( 大连 ) 公司 ; 质粒提取 纯化和胶回收试剂盒, 北京博大泰克生物基因技术有限责任公司 1.2 培养基 LB 培养基 (g/l): 胰蛋白胨 10, 酵母粉 5, NaCl 10 M9-1 液体培养基 (g/l):na 2 HPO 4 12H 2 O 15.1, KH 2 PO 4 3.0,NH 4 Cl 1.0,NaCl 0.5,(NH 4 ) 2 SO 4 13.2, 补加 0.1% ( 体积比 ) 1 mol/l MgSO 4 和 0.1% ( 体积比 ) 的微量元素母液 微量元素成分为 (g/l): FeCl 3 6H 2 O 2.4,CoCl 2 6H 2 O 0.3,CuCl 2 2H 2 O 0.15, ZnCl 2 0.3, Na 2 MO 4 2H 2 O 0.3, H 3 BO 3 0.075, MnCl 2 4H 2 O 0.495 菌株 Strains 菌株 质粒 Strains and plasmids 表 1 本研究中所使用的菌株和质粒 Table 1 Strains and plasmids used in this study 相应特征 Relevant characteristics 来源 Sources Geobacillus stearothermophilus B0031 Wild type CICIM-CU a Escherichia coli strains B0016 Wild type CICIM-CU a B0016-010 B0016,Δack-pta 本研究构建 B0016-020 B0016,Δack-pta ΔpflB 本研究构建 B0016-030 B0016,Δack-pta ΔpflB ΔadhE 本研究构建 B0016-040 B0016,Δack-pta ΔpflB ΔadhE ΔfrdA 本研究构建 B0016-050 B0016,Δack-pta ΔpflB ΔadhE ΔfrdA ΔldhA 本研究构建 B0016-060B B0016,Δack-pta ΔpflB ΔadhE ΔfrdA ΔldhA ΔdadX 本研究构建 B0016-060B/pPL-alaD B0016-060B with ppl-alad plasmid 本研究构建 质粒 Plasmids pkd46 Amp r,γ β exo (red recombinase),temperature-conditional replicon CGSC b ;[17] pkd13 Amp r,kan r,frt-kan-frt cassette CGSC b ;[17] pcp20 Amp r,flp,temperature-conditional replicon CGSC b ;[17] ppl451 Amp r,λci ts 857,p R p L promoter CICIM-CU a ;[8] ppl-alad Amp r,alad 本研究构建 注 : a : 江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心 ; b : 耶鲁大学基因保藏中心. Note: a : The Culture and Information Center of Industrial Microorganisms of China Universities, Jiangnan University; b : Genetic Stock Center, Yale University.
周丽等 : 温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成 L- 丙氨酸 2275 表 2 本研究中所使用的引物 Table 2 Primers used in this study 引物 Primers AckA-pKD13F Pta-pKD13R YackAF PflB-pKD13F PflB-pKD13R YpflBF YpflBR AdhE-pKD13F AdhE-pKD13R YadhER FrdA-pKD13F FrdA-pKD13R YfrdAF YfrdAR LdhA-pKD13F LdhA-pKD13R YldhAR DadX-pKD13F DadX-pKD13R YdadXF YdadXR 序列 Sequence (5 3 ) TGGCTCCCTGACGTTTTTTTAGCCACGTATCAATTATAGGTACTTCCATG gtgtaggctggagctgcttc GCAGCGCAAAGCTGCGGATGATGACGAGATTACTGCTGCTGTGCAGACTG CAGGTATCCTTTAGCAGCCTGAAGG TTTTACTGTACGATTTCAGTCAAATCTAATTACATAGATTGAGTGAAGGT gtgtaggctggagctgcttc a CGAAGTACGCAGTAAATAAAAAATCCACTTAAGAAGGTAGGTGTTACATG GAGTGAATGCGACCAATAACTGACATT CATACTGGGTCATTTACCTGCGTG CCGTTTATGTTGCCAGACAGCGCTACTGATTAAGCGGATTTTTTCGCTTT gtgtaggctggagctgcttc CGAGCAGATGATTTACTAAAAAAGTTTAACATTATCAGGAGAGCATTATG ATCACAGTGAGTGTGAGCGCG GCACCACCTCAATTTTCAGGTTTTTCATCTCAGCCATTCGCCTTCTCCTT gtgtaggctggagctgcttc ACCCTGAAGTACGTGGCTGTGGGATAAAAACAATCTGGAGGAATGTCGTG TAAGGCACTTCATAGAATGCGCTATGC ATCATCTTCAGTGATAATTTAGCCCTCTTG CTCCCCTGGAATGCAGGGGAGCGGCAAGATTAAACCAGTTCGTTCGGGCA gtgtaggctggagctgcttc TATTTTTAGTAGCTTAAATGTGATTCAACATCACTGGAGAAAGTCTTATG AGCATGGGTAGTTAATATCCTGATTTAGCG CATCACGTCCGGGCCATTTACATGGCGCACACAGCTAAGGAAACGAGATG gtgtaggctggagctgcttc ACGTTGCCTCCGATCCGGCTTACAACAAGTTACACCGTCACAACCGGGAC GTTTTAATACCGAGCTGTTGCAACCG ACATTAACAACTACAGTTGCTGACCAGCC 酶切位点 Restriction sites AlaDF-BamH I TTTGGATCCTAAGGAGGTTAACTATGAAGATCGGCATTCCAAAAGAAATC BamH I AlaDR-EcoR I TTTGAATTCGGATCTTCCAGAGATTGAAGGAGTTGATC EcoR I
2276 微生物学通报 Microbiol. China 2015, Vol.42, No.11 1.3 基因敲除方法 [17] 用 Datsenko 等报道的基因敲除方法依次敲除 B0016 菌株染色体上的 acka-pta pflb adhe frda ldha 和 dadx 基因 其具体过程为 : 以 pkd13 质粒为模板, 分别用引物对 AckA-pKD13F/ Pta-pKD13R PflB-pKD13F/PflB-pKD13R AdhE-pKD13F/AdhE-pKD13R FrdA-pKD13F/ FrdA-pKD13R LdhA-pKD13F/LdhA-pKD13R 和 DadX-pKD13F/DadX-pKD13R 进行 PCR 扩增, 获得两端各具有 50 bp 同源臂序列 中部为 FRT-Kan-FRT 的突变盒片段 借助质粒 pkd46 上的 Red 重组系统将突变盒整合于待突变菌株的染色体上, 并用相应的验证引物对 (YackAF/ Pta-pKD13R, YpflBF/YpflBR, AdhE-pKD13F/ YadhER,YfrdAF/YfrdAR,LdhA-pKD13F/YldhAR, YdadXF/YdadXR) 进行菌落 PCR 验证, 最后用 pcp20 质粒去除重组菌中的卡那抗性基因, 并进一步用相应验证引物进行验证 1.4 发酵方法 1.4.1 摇瓶发酵方法 : 将保藏于 80 C 甘油保藏管的菌株划线于 LB 平板上培养 24 h, 将单菌落接种于 50 ml LB 液体培养基中,28 C 200 r/min 培养 10 h 8 000 r/min 离心 5 min, 收集菌体, 用 M9-1 培养基重悬, 以 0.02 g/l ( 菌体干重 / 培养基体积 ) 的接种量接种于 50 ml 含有 5 g/l 葡萄糖的 M9-1 液体培养基中 (250 ml 三角瓶中 ), 进行好氧 - 限氧两阶段发酵培养 好氧菌体生长阶段以 28 C 200 r/min 培养至细胞干重 (DCW) 达到 1.37 g/l, 限氧发酵阶段添加 1.5 ml 500 g/l 葡萄糖和 2 g CaCO 3, 于 28 C 或 42 C 静置培养, 直至发酵液中葡萄糖被耗尽, 或两阶段共经 54 h 结束发酵 每组进行 3 个平行实验 上述培养过程中都添加终浓度为 100 μg/ml 氨苄青霉素 1.4.2 发酵罐发酵方法 : 种子液培养方法 : 菌体在 LB 平板及 LB 液体培养基中的培养方法同摇瓶发酵培养方法 8 000 r/min 离心 5 min, 收集 LB 液体培 养基中获得的菌体, 并以 0.1 g/l ( 菌体干重 / 培养基体积 ) 的接种量接种于 150 ml 含有 5 g/l 葡萄糖 100 μg/ml 氨苄青霉素的 M9-1 液体培养基中 (500 ml 三角瓶中 ),33 C 200 r/min 摇床培养 9 h 发酵罐接种方式 : 将种子液以 0.062 g/l ( 菌体干重 / 培养基体积 ) 的接种量接种于含有 M9-1 培养基 ( 不添加氨苄青霉素 ) 的 5 L 发酵罐 (Winpact FS-02,Major Science,Saratoga,CA,USA), 接种后发酵液初始体积为 3 L, 葡萄糖初始浓度为 30 g/l 好氧阶段培养方法 : 好氧菌体生长阶段, 初始空气通量为 3 L/min, 搅拌桨转速为 200 r/min, 此时的溶解氧浓度设定为 100%, 菌体生长过程中调节空气通量直至 7 L/min, 同时将搅拌转速与 DO 值关联来控制溶解氧浓度始终大于 30%; 使用 NH 4 OH 和 10% ( 体积比 ) H 2 SO 4 维持 ph 7.0; 发酵温度控制在 33 C 当菌体浓度达到 OD 600 为 20 时, 将发酵罐温度设定为 42 C 继续好氧培养 45 min, 再进入限氧发酵产酸阶段 限氧阶段培养方法 : 第二阶段, 空气通量调为 0, 搅拌桨转速控制为 100 r/min, 添加 NH 4 OH 来维持 ph 为 7.0, 发酵温度为 42 C, 并补加两次浓度为 600 g/l 的葡萄糖, 每次补加 200 ml, 以维持发酵过程中发酵液残糖浓度高于 10 g/l, 当所有补加的葡萄糖消耗尽后即结束发酵 发酵罐发酵进行两次平行实验 1.5 分析方法 1.5.1 菌体量测定方法 : 菌体密度采用浊度法间接测量, 通过 OD 600 来表示, 并通过下列公式换算为菌体干重 菌体干重 (DCW) 和 OD 600 的关系 : 1 OD 600 =0.38 g/l DCW 1.5.2 葡萄糖测定方法 : 葡萄糖用 SBA-40E 葡萄糖生物传感仪 ( 山东省科学院生物研究所 ) 进行分析 1.5.3 进行高压液相分析的发酵液样品预处理方法 : 有机酸测定样品预处理方法 : 发酵过程中如果添加了 CaCO 3, 发酵液样品用 5% ( 体积比 ) 浓硫酸酸化, 释放由 CaCO 3 中和的酸类代谢产物, 离心去
周丽等 : 温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成 L- 丙氨酸 2277 除 CaSO 4 沉淀后经 0.45 μm 微孔滤膜过滤后进行高压液相检测 氨基酸测定样品预处理方法 : 用 NH 4 OH 调节样品 ph 至 8.0, 适当稀释后再用苯基异硫酸酯 (PITC) 进行衍生 衍生步骤为 :500 μl 样品中加入 250 μl 0.1 mol/l PITC 乙腈溶液和 250 μl 1 mol/l 三乙胺乙腈溶液, 充分混匀, 避光室温放置 1 h, 加入 500 μl 正己烷溶液, 涡旋振荡器振荡 1 min, 静置 60 min, 吸取下层溶液, 用 0.45 μm 有机滤膜过滤后进行高压液相检测 [18] 1.5.4 有机酸测定方法 : 有机酸含量用高压液相色谱进行分析, 检测器为 UV (210 nm) 检测器, 色谱柱为 Prevail Organic Acid 5u (Grace Davison Discovery Sciences), 流动相为 25 mmol/l KH 2 PO 4 (ph 2.5), 流速为 1 ml/min, 柱温为室温 1.5.5 氨基酸测定方法 : 色谱柱为 AccQ Tag 3.9 mm 150 mm (Waters) 流动相 A 液为 80% ( 体积比 ) 乙腈水溶液,B 液为 97:3 ( 体积比 ) 的 0.1 mol/l 乙酸钠 - 乙腈溶液 采用梯度洗脱 :0 20 min,b 液由 95% 下降到 80%;20 30 min,b 液由 80% 上升到 95%;30 40 min,b 液梯度不变 检测波长为 254 nm, 柱温为室温 1.5.6 乙醇测定方法 : 乙醇含量用 SBA-40E 葡萄糖生物传感仪 ( 山东省科学院生物研究所 ) 进行分析 1.5.7 数据分析方法 : 2 ln( X ) X1 平均比生长速率 (μ)= ; t2-t1 P P 转化率 = 2 1 100% ; G2 G1 P2 P1 体积生产强度 = V ( t2 t1) 其中 :X (g/l) 为菌体浓度,t (h) 为时间,P (g) 为产物量,G (g) 为葡萄糖量,V (L) 为发酵结束时发酵液体积 2 结果与分析 2.1 E. coli B0016-060B 重组菌株的构建 [17] 用 Datsenko 等报道的基因敲除方法, 在菌株 E. coli B0016 中依次叠加敲除 acka-pta pflb adhe frda ldha 和 dadx 基因, 依次获得了 B0016-010 B0016-020 B0016-030 B0016-040 B0016-050 和 B0016-060B 菌株 ( 表 1) 用验证引物对上述突变进行验证, 结果如图 1 所示, 均获得了大小 0.3 0.5 kb 左右的条带, 表明上述基因已成功删除 2.2 alad 基因的克隆及 E. coli B0016-060B/ ppl-alad 重组菌株的构建 根据 GenBank EF154460.1 报道的 alad 基因序列设计引物 AlaDF-BamH I 和 AlaDR-EcoR I, 并以 G. stearothermophilus B0031 菌株染色体为模板, 进行 PCR 扩增, 获得了 alad 基因及其部分下游基因序列, 其大小约为 1.2 kb 经 DNA 测序并用 BLAST 软件进行 DNA 序列比对, 表明 G. stearothermophilus B0031 来源的 alad 其结构基因部分 (1 119 bp) 与已报道的同菌种来源的 alad 基因 图 1 E. coli B0016-060B 突变基因的 PCR 鉴定电泳图谱 Figure 1 PCR identification of gene mutations in E. coli B0016-060B 注 :M:DL10000 marker;1: 用 YackAF 和 Pta-pKD13R 引物 PCR;2: 用 YpflBF 和 YpflBR 引物 PCR;3: 用 AdhE-pKD13F 和 YadhER 引物 PCR;4: 用 YfrdAF 和 YfrdAR 引物 PCR;5: 用 LdhA-pKD13F 和 YldhAR 引物 PCR;6: 用 YdadXF 和 YdadXR 引物 PCR. Note: M: DL10000 marker; 1: PCR with YackAF and Pta-pKD13R primers; 2: PCR with YpflBF and YpflBR primers; 3: PCR with AdhE-pKD13F and YadhER primers; 4: PCR with YfrdAF and YfrdAR primers; 5: PCR with LdhA-pKD13F and YldhAR primers; 6: PCR with YdadXF and YdadXR primers.
2278 微生物学通报 Microbiol. China 2015, Vol.42, No.11 图 2 ppl-alad 质粒物理图谱 (A) 及酶切验证图谱 (B) Figure 2 Map of recombinant vector ppl-alad (A) and restriction pattern of ppl-alad (B) 注 :1:BamH I 和 EcoR I 双酶切重组质粒 ppl-alad;m:dl10 000 marker. Note: 1: ppl-alad/bamh I, EcoR I; M: DL10 000 marker. (GenBank 登录号 :M33299.1) [19] 最高相似性达到 98%, 有 24 个碱基位点不同 用 BLAST 软件进行氨基酸序列比对, 表明与同菌种来源的丙氨酸脱氢酶 (NCBI 登录号 :WP_033014465) 最高相似性为 99%, 其中本文获得的 ALD 的 224 位为苏氨酸, 而文献报道的该位点多为异亮氨酸 将克隆到的 alad 基因片段用 BamH I 和 EcoR I 进行双酶切, 克隆于 ppl451 质粒载体的相同酶切位点, 获得重组质粒 ppl-alad, 其物理图谱如图 2A 所示 重组质粒 ppl-alad 用 BamH I 和 EcoR I 进行双酶切, 电泳获得了 4.2 kb 和 1.2 kb 两条带 ( 图 2B), 表明质粒构建正确 将 ppl-alad 质粒转化菌株 B0016-060B, 获得 B0016-060B/pPL-alaD 重组菌株, 进一步进行发酵实验检测其 L- 丙氨酸合成性能 2.3 L- 丙氨酸浓度对菌体生长的影响菌株 B0016-060B 不具有发酵型丙氨酸脱氢酶 (ALD), 发酵液中不积累 L- 丙氨酸, 因此以该菌株为研究对象, 在其培养基中分别添加终浓度为 0 1 10 20 30 g/l 的 L- 丙氨酸, 考察 L- 丙氨酸对菌体生长的影响 结果如表 3 所示, 添加终浓度为 1 g/l 的 L- 丙氨酸使得菌体比生长速率显著降低, 随着 L- 丙氨酸添加浓度的增加, 菌体生长速率大幅度降低, 表明 L- 丙氨酸对菌体生长存在抑制作用 因此,L- 丙氨酸发酵生产过程中, 在菌体生长阶段应限制 L- 丙氨酸的合成量, 以减少其对菌体生长的抑制作用 ; 而当菌体浓度达到一定值时, 再高水平表达 L- 丙氨酸脱氢酶, 可促进 L- 丙氨酸的快速合成 2.4 B0016-060B/pPL-alaD 菌株丙氨酸发酵特征野生型菌株 B0016 重组菌株 B0016-060B/ ppl-alad 及对照菌株 B0016-060B 进行摇瓶发酵培表 3 不同 L- 丙氨酸添加浓度下 B0016-060B 菌株的比生长速率 Table 3 Specific growth rate of B0016-060B under different concentrations of L-alanine L- 丙氨酸添加量比生长速率 L-alanine addition (g/l) Specific growth rate μ (h 1 ) 0 0.47±0.01 1 0.40±0.00 10 0.11±0.00 20 0.08±0.00 30 0.06±0.00
周丽等 : 温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成 L- 丙氨酸 2279 养, 测定发酵液中 L- 丙氨酸和有机酸合成量, 结果如表 4 所示 野生菌株 B0016 在 M9-1 培养基中进行好氧 - 限氧两阶段发酵培养, 主要代谢产物为乳酸 乙酸 琥珀酸 甲酸和乙醇, 其合成量与野生型菌株 B0013 相仿 [7],L- 丙氨酸含量极低 ( 小于 0.05 g/l) 将竞争代谢途径删除后, 重组菌株 B0016-060B 中上述副产物的合成量都大幅度降低, 而由于丙酮酸的分解代谢途径被阻断, 丙酮酸积累量增加, 同时还原型辅酶利用途径的删除也导致糖酵解途径产生的 NADH 不能被氧化再生, 使得限氧阶段糖消耗速率降低 菌株 B0016-060B/pPL-alaD 在 28 C 下进行两阶段培养, 几乎不能诱导 p R -p L 启动子起始表达, 发酵过程中仅检测出少量的 L- 丙氨酸 (0.26 g/l) 而在 42 C 下进行限氧发酵, 菌株 B0016-060B/ ppl-alad 利用葡萄糖合成 11 g/l L- 丙氨酸, 其得率达到 70.3 g 丙氨酸 /100 g 葡萄糖, 生产强度达到 0.2 g/(l h) 上述结果表明通过控制温度调节 p R -p L 启动子的活性, 在 28 C 下可有效关闭 L- 丙氨酸的合成, 避免 L- 丙氨酸的积累对菌体生长产生抑制作用 ; 而在 42 C 下可高效开启 L- 丙氨酸的合成, 实 现了重组大肠杆菌 L- 丙氨酸合成的开关控制 前期研究中, 用 p L 启动子成功调控了 D- 乳酸发酵过程, 并优化了开关控制的培养条件 (33 C 生长菌体,42 C 诱导及限氧发酵 ) 本文利用该最佳培养条件, 在 5 L 发酵罐中, 考察菌株 B0016-060B/ ppl-alad 进行 L- 丙氨酸的发酵效果 发酵过程中 L- 丙氨酸和菌体浓度如图 3 所示 在菌体生长阶段控制较低温度, 使得 L- 丙氨酸的合成量可控制在极低的水平, 保证了菌体快速生长 经 42 C 诱导, L- 丙氨酸开始快速合成, 并且在限氧条件下糖酵解途径可与 L- 丙氨酸合成途径耦合, 实现还原力的循环, 促进了 L- 丙氨酸的快速合成 最终发酵液中, L- 丙氨酸产量达 67.2 g/l, 体积生产强度达到 2.06 g/(l h) 限氧发酵阶段 L- 丙氨酸转化率可达 87.2 g/100 g 葡萄糖, 整个发酵阶段 L- 丙氨酸转化率也可达到 67.1 g/100 g 葡萄糖 发酵液中主要副产物是乙酸 (5.8 g/l), 其他副产物含量都低于 0.2 g/l 3 结论野生型 E. coli B0016 菌株经好氧 - 限氧两阶段发酵, 产生大量的乳酸 乙酸 甲酸 乙醇 琥珀酸等代谢产物 ( 表 4) 将这些代谢产物合成途径编码 表 4 L- 丙氨酸发酵性能的比较 Table 4 Comparison of alanine fermentation 丙氨酸 转化率 菌株 Strain 生产强度 Productivity (g/l h) d Alanine 限氧阶段转化率 Oxygen-limited yield (g/100 g glucose) e 丙氨酸 Alanine Yield for indicated agent (g/100 g glucose) f 乳酸 乙酸 琥珀酸 Lactate Acetate Succinate 甲酸 Formate 丙酮酸 Pyruvate 乙醇 Ethanol B0016 a 0.00±0.00 0.1±0.0 0.1±0.0 42.5±1.8 17.3±0.9 15.1±0.5 9.2±0.7 1.4±0.1 5.9±0.9 B0016-060B a,b 0.00±0.00 0.5±0.0 0.4±0.0 0.0±0.0 3.9±0.4 8.2±0.5 0.0±0.0 23.8±1.2 0.7±0.0 B0016-060B/pPL-alaD b,c 0.00±0.00 2.0±0.4 2.1±0.1 0.0±0.0 9.2±0.5 2.0±0.2 0.0±0.0 15.0±0.6 0.1±0.0 B0016-060B/pPL-alaD a 0.20±0.00 70.3±3.9 59.4±3.1 0.0±0.0 5.6±0.1 1.5±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.1±0.0 注 : a : 菌体生长阶段在 28 C 进行, 限氧发酵阶段在 42 C 进行 ; b : 底物葡萄糖未消耗完 ; c : 整个发酵过程在 28 C 进行 ; d : 限氧阶段的平均生产强度 ; e : 限氧阶段的平均转化率 ; f : 整个发酵阶段的平均转化率. Note: a : Cells were cultured in shake flasks at 28 C during growth phase and at 42 C during oxygen-limited phase; b : Incomplete utilization of glucose substrate; c : Cells were cultured in shake flasks at 28 C during the entire fermentation process; d : Average productivity during the oxygen-limited phase; e : Average alanine yield during the oxygen-limited phase; f : Average yield during the overall fermentation phase.
2280 微生物学通报 Microbiol. China 2015, Vol.42, No.11 基因敲除获得菌株 B0016-060B, 显著降低了这些产物的积累量 ( 表 4), 其残余量与前期研究结果相仿 [7] 此外,DadX 是 E. coli 中主要的丙氨酸消旋酶 [20], 将该基因敲除, 减少 L- 丙氨酸向 D- 丙氨酸的转化, 可获得高光学纯度的 L- 丙氨酸 [16] Zhang [16] 等通过敲除 mgsa 基因提高菌体生长速率并去除了残余的乳酸副产物 可能是由于出发菌株之间的差异, 使得本文在没有敲除 mgsa 基因的情况下, 仍可达到较高的菌体生长速率 ( 图 3), 且发酵液中乳酸副产物含量极低 [16] Zhang 等将来源于 Geobacillus stearothermophilus 的 alad 基因整合于重组 E. coli SZ194 染色体上, 经驯化后, 最终菌株 XZ132 (pflb frd adhe acka mgsa dadx ldha::alad) 经 48 h 可利用无机盐培养基以及 120 g/l 葡萄糖合成 1 279 mmol/l 图 3 菌株 B0016-060B/pPL-alaD 丙氨酸发酵过程 Figure 3 Representative experiment of alanine fermentation by E. coli B0016-060B/pPL-alaD 注 : : 丙氨酸 ; : 细胞干重 (DCW); : 乙酸 ; : 丙酮酸 ; : 乳酸 ; : 琥珀酸 ; : 甲酸 ; : 乙醇. 虚线箭头表示培养温度由 33 C 转为 42 C. 虚线表示发酵由好氧培养阶段转为限氧培养阶段. 箭头表示向发酵罐中添加 120 g (A) 和 120 g (B) 葡萄糖. Note: : Alanine; : Dry cell mass (DCW); : Acetate; : Pyruvate; : Lactate; : Succinate; : Formate; : Ethanol. The dotted arrow shows the time when the culture was shifted from 33 C to 42 C. The dotted line indicates the time when the culture was shifted from the aerobic cultivation to the oxygen-limited production phase. Additions of glucose of 120 g (A) and 120 g (B) were made to the bioreactor as indicated by arrows. 丙氨酸, 丙氨酸转化率达到 95 g/100 g 葡萄糖, L- 丙氨酸光学纯度达到 99.5%, 是目前利用重组 E. coli 菌株进行 L- 丙氨酸合成的最高产量 基于上述成功例子, 且考虑到来源于嗜热菌 G. stearothermophilus 的 ALD 具有较好的热稳定性 [16], 所构建的重组菌株在较高温度培养时对该酶活性影响会较小, 本文克隆了该来源的 ALD 在重组 E. coli 中进行 L- 丙氨酸合成 所获得的 alad 基 [16] 因与 Zhang 等报道的 (GenBank 登录号 : EF154460.1) 相比, 有 39 个位点碱基不同, 存在 8 个位点氨基酸序列的差异, 这可能使两个酶的催化性能有所差别, 导致两个发酵过程也产生差别 然而, 发酵实验表明该 ALD 酶同样可进行 L- 丙氨酸的高效合成 [16] Zhang 等用乳酸脱氢酶基因 (ldha) 的启动子控制 ALD 的表达, 该启动子受生长调节, 可在厌氧条件下高效表达 然而, 前期乳酸发酵过程研究中, 发现 P ldha 启动子对于基因表达的调控并不严格 例如, 乳酸发酵重组菌株 B0013-070 (acka pta pps pflb dld poxb adhe frda) 好氧阶段仍可合成 7 g/l 乳酸, 与菌体生长竞争丙酮酸, 抑制了菌体的生长 [7] 因此, 用 P ldha 启动子调控丙氨酸发酵过程, 同样可能导致菌体生长阶段丙氨酸积累而抑制菌体生长 Lee 及 Smith 等在 E. coli 菌株中用 trc 启动子调控 alad 基因 ( 来源于 Bacillus sphaericus) 的表达 [12,15], 但需添加 IPTG 进行诱导, 其价格昂贵, 不适于工业应用 本文选用 p L -p R 启动子对 ALD 的表达进行开关调控, 相对于基因工程中一些常用的启动子, 该启动子为严谨型启动子, 在低温下无本底表达, 且仅通过调节温度就可以实现有效调控, 不需要添加一些昂贵的化合物进行诱导 ; 另外, 由于 ppl451 质粒在无抗生素选择压力时仍可较稳定存在 [18], 故在发酵罐发酵试验时未加抗生素, 更符合实际生产过程, 具有更好的应用前景 通过控制温度, 可在菌体生长阶段严格关闭菌株 B0016-060B/pPL-alaD L- 丙氨酸的合成水平, 避免产物对菌体生长的抑制和竞争作用 同时, 在产物
周丽等 : 温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成 L- 丙氨酸 2281 合成阶段可开启 L- 丙氨酸的快速合成 重组菌株 B0016-060B/pPL-alaD 经发酵罐发酵, 可产生 67.2 g/l L- 丙氨酸, 其体积生产强度达到 2.06 g/(l h), 显示出较好的生产潜力 进一步对该菌株的开关控制发酵条件进行优化, 提高其 L- 丙氨酸生产性能, 以及将 p L -alad 基因整合于染色体上进行稳定表达的研究结果将在后续文章中报道 参考文献 [1] Kern A, Tilley E, Hunter IS, et al. Engineering primary metabolic pathways of industrial micro-organisms[j]. Journal of Biotechnology, 2007, 129(1): 6-29 [2] Krärner R. Genetic and physiological approaches for the production of amino acids[j]. Journal of Biotechnology, 1996, 45(1): 1-21 [3] Mijts BN, Schmidt-Dannert C. Engineering of secondary metabolite pathways[j]. Current Opinion in Biotechnology, 2003, 14(6): 597-602 [4] Jones BB, Chan H, Rothstein S, et al. RNA polymerase binding sites in λplac5 DNA[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of Sciences of the United States of America, 1977, 74(11): 4914-4918 [5] Bunch PK, Mat-Jan F, Lee N, et al. The ldha gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli[j]. Microbiology, 1997, 143(1): 187-195 [6] Zhou L, Niu DD, Tian KM, et al. Genetically switched D-lactate production in Escherichia coli[j]. Metabolic Engineering, 2012, 14(5): 560-568 [7] Zhou L, Zuo ZR, Chen XZ, et al. Evaluation of genetic manipulation strategies on D-lactate production by Escherichia coli[j]. Current Microbiology, 2011, 62(3): 981-989 [8] Love CA, Lilley PE, Dixon NE. Stable high-copy-number bacteriophage[lambda] promoter vectors for overproduction of proteins in Escherichia coli[j]. Gene, 1996, 176(1/2): 49-53 [9] Elvin CM, Thompson PR, Argall ME, et al. Modified bacteriophage lambda promoter vectors for overproduction of proteins in Escherichia coli[j]. Gene, 1990, 87(1): 123-126 [10] Ptashne M. A Genetic Switch: Phage λ and Higher Organisms[M]. Cambridge: Cell Press, 1992: 11 [11] Hols P, Kleerebezem M, Schanck AN, et al. Conversion of actococcus lactis from homolactic to homoalanine fermentation through metabolic engineering[j]. Nature Biotechnology, 1999, 17(6): 588-592 [12] Lee M, Smith G, Eiteman M, et al. Aerobic production of alanine by Escherichia coli acef ldha mutants expressing the Bacillus sphaericus alad gene[j]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2004, 65(1): 56-60 [13] Shibatani T, Kakimoto T, Chibata I. Stimulation of L-asparate beta-decarboxylase formation by L-glutamate in Pseudomonas dacunhae and improved production of L-alanine[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1979, 38(3): 359-364 [14] Uhlenbusch I, Sahm H, Sprenger GA. Expression of an L-alanine dehydrogenase gene in Zymomonas mobilis and excretion of L-alanine[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1991, 57(5): 1360-1366 [15] Smith GM, Lee SA, Reilly KC, et al. Fed-batch two-phase production of alanine by a metabolically engineered Escherichia coli[j]. Biotechnology Letters, 2006, 28(20): 1695-1700 [16] Zhang XL, Jantama K, Moore JC, et al. Production of L-alanine by metabolically engineered Escherichia coli[j]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 77(2): 355-366 [17] Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products[j]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000, 97(12): 6640-6645 [18] Yang Y, Qin Q, Guo WZ. Separation and quantitative analysis of amino acids derivatized with phenyl isothiocyanate by high performance liquid chromatography (HPLC)[J]. Chinese Journal of Chromatography, 1994, 12(4): 295-296 (in Chinese) 杨扬, 秦强, 郭伟忠. 苯基异硫氰酸酯衍生氨基酸的高效液相色谱分析 [J]. 色谱, 1994, 12(4): 295-296 [19] Kuroda S, Tanizawa K, Tanaka H, et al. Alanine dehydrogenases from two Bacillus species with distinct thermostabilities: molecular cloning, DNA and protein sequence determination, and structural comparison with other NAD(P) + -dependent dehydrogenases[j]. Biochemistry, 1990, 29(4): 1009-1015 [20] Wild J, Hennig J, Lobocka M, et al. Identification of the dadx gene coding for the predominant isozyme of alanine racemase in Escherichia coli K12[J]. Molecular and General Genetics, 1985, 198(2): 315-322