使用说明书 产品名称 Ni IDA 琼脂糖磁珠 产品型号 MAg25K-IDA-Ni 目录号 P20 产品介绍 Enriching Beads Ni IDA 琼脂糖磁珠是专为组氨酸标签 (His-tag) 蛋白纯化而设计的新型功能化材料 与传统的金属螯合琼脂糖或者葡聚糖预装柱相比,Ni IDA 琼脂糖磁珠具有顺磁性, 借助外加磁场易实现目标蛋白的分离与纯化 ; 操作简单, 一步纯化即可获得高纯度的组氨酸标签蛋白 ; 可通过洗脱液体积控制目标蛋白浓度, 方便后续的样品处理, Ni 磁珠可简单再生 重复使用 Ni IDA 琼脂糖磁珠适合原核细胞 ( 如大肠杆菌 ) 表达的可溶性组氨酸标签蛋白的纯化 产品规格 平均粒径 25µm 螯合金属离子 Ni 2+ 金属离子密度 50~80μmol/mL(100%,v/v) 固形物浓度 10% (v/v) 分散液 H 2 O 目标蛋白结合量 20mg of 28KD protein/ml beads(100%,v/v) 产品特点 结合载量高 ; 非特异性吸附低 作用对象 细菌, 酵母, 昆虫和哺乳动物细胞等分泌或胞内表达的组氨酸标签蛋白 保存条件 去离子水, 长期保存建议 20% 乙醇,2 ~8, 请勿冻融使用 备注信息 1: 磁珠与蛋白结合量与目标蛋白特性有关, 此处仅作参考值 ; 2: 固形物浓度 10% (v/v) 是指 1mL 磁珠悬浮液中包含 100µL 体积的磁珠 ; 3: 产品可配合英芮诚 ETP-300 型核酸提取仪实现高通量工作 ; 4: 磁珠使用和保存过程中应避免反复冻融, 且不可以干燥 ; 5: 用户可进一步检测经 Ni IDA 琼脂糖磁珠纯化 磁场分离后的组氨酸标签蛋白上清液, 优化蛋白纯化流程 ; 6: 本产品可重复使用 8~10 次, 当纯化性能降低时, 建议进行再生处理 ; 1
7: 使用过的磁珠重复使用时, 建议纯化同种蛋白, 纯化不同种类蛋白时, 建议使用 新的磁珠 实验参考 表一 : 粗蛋白样本,Wash Buffer,Elution Buffer 使用推荐比例 粗蛋白样本 Wash Buffer Elution Buffer 1 Elution Buffer 2 1mL 500~1000µL 200~400µL 100~200µL 表二 :Ni 磁珠与蛋白结合能力 Ni 磁珠使用量 50uL( 建议最低使用量 ) 500uL 1000uL 蛋白结合量 75~150µg protein 750~1500µg protein 1500~3000µg protein 注 : 需要破碎菌体质量 / 体积根据所使用的表达体系和组氨酸标签蛋白的表达水平来决定,Ni 磁珠与不同的组氨酸标签蛋白的结合量略有不同, 参考表 1 和表 2 使用 Ni 磁珠 操作流程 1. 实验准备 1.1 离心管, 磁力架, 旋转混合仪或涡旋混合仪 ; 1.2 缓冲液的准备 : 目标蛋白与 Ni IDA 琼脂糖磁珠的结合性能将直接影响目标蛋白的纯化效率, 各种缓冲液配制也将在一定程度上影响目标蛋白的回收率和纯度 因此, 在较大规模蛋白纯化之前, 用户应该自行设计实验, 筛选出适合纯化目标蛋白的缓冲液体系, 主要包括 Binding Buffer Wash Buffer Elution Buffer Binding Buffer:20mM Sodium Phosphate, 500mM NaCl, 0~20mM Imidazole, ph7.4 Wash Buffer: 20mM Sodium Phosphate, 500mM NaCl, 0~80mM Imidazole, ph7.4 Elution Buffer: 20mM Sodium Phosphate, 500mM NaCl, 400mM Imidazole, ph7.4 注 1:Wash Buffer 中的 Imidazole 浓度推荐先用 10~30mM 进行尝试 2. 样品处理 2.1 高速离心收集大肠杆菌 酵母或细胞等 ; 2.2 向上述的细胞沉淀中加入适量体积的 Binding Buffer, 以及蛋白酶抑制剂 ( 如终浓度为 的 PMSF), 重悬细胞, 冰浴超声或者高压破碎裂解细胞, 即为粗蛋白样品 3. 磁珠预处理 3.1 将 Ni IDA 琼脂糖磁珠悬浮液充分混匀, 移取所需量到离心管中, 磁性分离去除上清液 ; 3.2 加入去离子水, 充分混匀磁珠, 磁性分离去除上清液 (1 次 ); 3.3 加入 Binding Buffer, 充分混匀磁珠, 磁性分离去除上清液 (1 次 ) 4. 目标蛋白纯化 2
4.1 将步骤 2( 样品处理 ) 得到的粗蛋白样品加入含预处理过磁珠的离心管中, 将离心管放置于旋转混合仪上, 室温旋转孵育 30min; 4.2 磁性分离去除上清液或保留上清液以备后续检测 ; 4.3 加入 Wash Buffer, 反复颠倒离心管 1min 使磁珠重悬, 磁性分离, 保留磁珠, 弃上清液或保留上清液以备后续检测 ; 4.4 重复 4.3 步骤 2~3 次 注 :1 如果目标蛋白含量较低或者结合能力较弱, 建议延长磁珠与 His 标签蛋白的孵育时间 ; 2 如果目标蛋白易降解, 可以在 2~8 的低温环境下孵育, 孵育时间请延长至 1h 以上 ; 5. 目标蛋白洗脱 5.1 加入适量 Elution Buffer, 充分混匀磁珠, 洗脱 5~10min, 置于旋转混合仪上旋转 10min 以上效果更佳, 用户可根据需要改变洗脱体积, 调整目标蛋白浓度 ; 5.2 磁性分离, 收集洗脱液到新的离心管中, 得到纯化的目标蛋白 ; 5.3 加入适量 Elution Buffer 进行第二次洗脱 6. 磁珠后处理 6.1 在装有磁珠的离心管中加入 Elution Buffer, 充分混匀磁珠, 磁性分离去除上清液, 重复 2~3 次 ; 6.2 加入 1 ml 去离子水, 充分混匀磁珠, 磁性分离去除上清液, 重复 2~3 次 ; 6.3 清洗完毕的磁珠可直接用于下一次同种蛋白的纯化, 或分散于超纯水中短期保存, 长期保存建议分散到 20%(v/v) 乙醇溶液, 置于 2~8 保存 7. 磁珠再生 Ni IDA 琼脂糖磁珠连续使用 8~10 次后, 结合目标蛋白的能力可能会明显降低, 建议进行磁珠再生处理,Ni IDA 琼脂糖磁珠的再生需要先自行配置下列缓冲液 : Stripping Buffer:50mM Tris-HCl 150mM EDTA 的 PBS 溶液,pH=7.2~7.6; Beads Wash Buffer:0.5M NaOH,2M NaCl, 去离子水溶液 ; Recharge Buffer:100~200mM NiSO 4 溶液 ; Storage Buffer:20%(v/v) 乙醇 7.1 将 Ni IDA 琼脂糖磁珠悬浮液磁性分离去除上清液 ; 7.2 加入 1mL Stripping Buffer, 充分混匀磁珠, 室温旋转混合 10min, 磁性分离去除上清液, 重复此步骤 1 次 ; 7.3 加入 1mL 去离子水, 充分混匀磁珠, 磁性分离去除上清液 ; 7.4 加入 1mL Beads Wash Buffer, 充分混匀磁珠, 室温旋转混合 10min, 磁性分离去除上清液, 去离子水重复洗涤 3~5 次, 至洗涤液呈中性为止 ; 7.5 加入 1mL Recharge Buffer, 充分混匀磁珠, 室温旋转混合 30~60 min; 磁性分离去除上清液, 去离子水重复洗涤 5 次以上, 磁珠再生完毕 3
注 : 以上再生的磁珠可直接用于 His 标签蛋白的纯化, 或分散于超纯水中短期保存, 长期保存建议分散到 20%(v/v) 乙醇溶液, 置于 2~8 保存 蛋白纯化流程的优化 以上操作流程适用于大部分组氨酸标签蛋白的纯化, 根据目标蛋白与金属离子螯合磁珠的结合性能不同, 用户可以从以下几个方面对纯化流程进行优化, 以提高目标蛋白的回收率和纯度 提高目标蛋白回收率的参考方法 1. 适当降低样品溶液和 Binding/Wash Buffer 中的 Imidazole 浓度 ; 2. 在样品溶液和其它缓冲液中添加表面活性剂等物质 ; 3. 添加合适的蛋白酶抑制剂, 防止目标蛋白降解 ; 4. 适当增加磁珠用量 ; 5. 延长蛋白与磁珠的孵育时间 ; 6. 延长洗脱目标蛋白的时间或增加洗脱次数 提高目标蛋白纯度的参考方法 1. 适当提高样品溶液和 Binding/Wash Buffer 中的 Imidazole 和 NaCl 浓度 ; 2. 样品和缓冲液中添加表面活性剂等物质 ; 3. 添加合适的蛋白酶抑制剂, 防止目标蛋白降解 ; 4. 延长清洗时间, 增加清洗次数 ; 5. 采用梯度 Imidazole 浓度洗脱目标蛋白 其它 该产品可配合英芮诚核酸提取仪 ( 订货号 ETP-300) 进行自动化操作, 也可以配合多功能磁力架 ( 订货号 CQT-0011) 16 位磁力架 ( 订货号 CQT-0001) 手动磁性萃取指套 ( 订货号 CQT-0008) 进行手动操作 4
注意事项 1. 首次使用本产品前, 请务必详细阅读本用户手册 ; 2. 磁珠使用和保存过程中应避免冷冻 干燥和高速离心等操作 ; 3. 在使用本产品前, 请务必充分振荡使磁珠保持均匀的悬浮状态 ; 4. 请选用质量好的移液器吸头和离心管, 以免磁珠贴壁或混合过程中发生渗漏引起磁珠的损耗 ; 5. 磁珠与溶液混合过程中, 如果溶液粘稠无法通过翻转离心管重悬磁珠, 可采用移液器反复吹打或短时涡旋混合使磁珠充分重悬 ; 6. 用户可根据实际需要保留经磁性分离移去的上清液, 进行取样检测, 以便分析纯化过程和优化蛋白纯化流程 ; 7. 本产品可以重复使用, 当纯化性能降低时, 建议进行再生处理 ; 8. 使用过的磁珠重复使用时, 建议纯化同种蛋白, 纯化不同种类的蛋白时, 建议使用新的磁珠 ; 9. 本产品需与磁性分离器配套使用 ; 10. 本产品在 2~8 可稳定保存, 保质期两年 ; 11. 本产品仅供研究使用 5
附 1:Ni 磁珠溶剂耐受性表 溶剂种类溶剂名称可耐受浓度备注 缓冲液试剂 螯合试剂 巯基试剂 表面活性剂 其它添加剂 HEPES Tris-HCl,pH7.4 Tris-Acetate, ph7.4 MOPS EDTA EGTA DTE DTT 带有仲胺或叔胺的缓冲液会将 Ni 离子还原 会将 Ni 离子从磁珠上剥离 低浓度时会将 Ni 离子还原 β- 巯基乙醇 20mM 防止分子间形成二硫键, 高浓度时 THP 会将 Ni 离子还原 Triton X-100 2% Tween20 2% NP-40 2% Cholate 2% CHAPS 1% Imidazole 500mM Ethanol 20% NaCl 1.5M Na 2 SO 4 Glycerin 50% Citrate 60mM 英芮诚 ( 上海 ) 有限公司地址 : 上海市杨浦区翔殷路 128 号 1 号楼 B 座 301 室电话 :021-55809378 网址 :www.bio-enriching.com 电子邮件 :marketing@bio-enriching.com 版权声明 : 英芮诚 ( 上海 ) 有限公司保留本使用说明书的所有权利 版本 :V.170102 6