卷 PCRSu- 菌株 permix 25 滋 L, 补足 ddh 2 O 至总体积 50 滋 L PCR 1.4 ESBLs 基因扩增与测序分析挑取纯培养菌落, 按照说明书提取质粒 反应程序 : 预变性 94 5 min, 变性 94 30s, 退火 30s ( 退火温度参照引物合成

第 39 卷 8 期 2017 年 8 月 Journal of Ningxia Medical University 903 文章编号 :1674-6309(2017)08-0903-05 论著 产 ESBLs 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药性及基因型分析 蒋德安 1, 王芳 1, 马玲飞 1 2, 吴宁 (1. 宁夏吴忠市人民医院检验科, 吴忠 751100; 2. 中山大学达安基因股份有限公司科研部, 广州 510665) 摘要 : 目的分析本院临床分离标本中超广谱茁 - 内酰胺酶 (ESBLs) 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的耐药性及相关耐药基因的检出情况 方法采用纸片扩散法 (K-B 法 ) 对从我院分离的 236 株大肠埃希菌和 224 株肺炎克雷伯菌进行 ESBLs 表型鉴定 药敏试验, 利用 PCR 法扩增 ESBLs 耐药相关基因 TEM SHV 和 CTX-M(M1 M2 和 M9), 对其产物进行测序分析验证 结果产 ESBLs 大肠埃希菌的检出率为 32.63%, 产 ESBLs 肺炎克雷伯菌的检出率为 30.36%;ESBLs 大肠埃希菌 ESBLs 肺炎克雷伯菌对氨苄西林 哌拉西林 头孢呋辛 头孢他啶 头孢曲松 氨曲南 庆大霉素 左氧氟沙星等的耐药率均高于相应的非产 ESBLs 菌 (P 均 <0.05); 产 ESBLs 肺炎克雷伯菌 SHV 基因 CTX-M2 亚型检出率均高于产 ESBLs 大肠埃希菌 (P<0.05),CTX-M9 亚型的检出率低于产 ESBLs 大肠埃希菌 (P<0.05); 所有产物测序分析结果与 PCR 扩增结果一致 结论产 ESBLs 的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药形势复杂 多样, 临床应重视常规药敏试验并结合耐药基因检测的应用 关键词 : 超广谱茁 - 内酰胺酶 ; 大肠埃希菌 ; 肺炎克雷伯菌 ; 耐药性 ; 基因型中图分类号 :R378 文献标识码 :A DOI:10.16050/j.cnki.issn1674-6309.2017.08.012 肠杆菌科细菌在临床分离菌中比较常见, 是引起临床或院内感染的重要条件致病菌, 其耐药性也呈现明显的上升趋势 据 2015 年全国细菌耐药监测网报告, 肠杆菌科细菌分离率居于首 [1] 位 产超广谱茁 - 内酰胺酶 (Extended Spectrum Beta-Lactamases,ESBLs) 的大肠埃希菌和肺炎克 [2] 雷伯菌是其中分离率较高的两大类, 也是目前临床治疗和感染控制的难题 因此, 重视大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的耐药性及其分子流行病 [3] 学具有重要的临床意义 本文对我院 2013-2015 年 3 年临床分离标本中 236 株大肠埃希菌和 224 株肺炎克雷伯菌的耐药性 产 ESBLs 和耐药基因分布等情况进行分析, 以期为临床科学 合理地使用抗生素提供参考依据 1 材料与方法 1.1 菌株来源 2013 年 1 月至 2015 年 12 月本院临床标本中分离的大肠埃希菌 肺炎克雷伯菌, 剔除同一患者相同部位重复采集的菌株后分别得到 236 和 224 株 质控菌株 : 大肠埃希菌 ATCC25922 肺炎克雷伯菌 ATCC700603, 购自上海汉尼生物技 收稿日期 :2017-01-19 作者简介 : 蒋德安 (1965-), 男, 副主任检验技师, 从事临床检验工作 E-mail: 13995358146@163.com 术有限公司 1.2 仪器与试剂细菌鉴定 : 采用西门子全自动微生物分析仪 (walkway96plus) 进行 ;M-H 琼脂培养基购自广州迪景微生物科技有限公司 ; 抗菌药物药敏纸片购自英国 OXOID 公司 分子生物学检测 : 质粒小提试剂盒 (DP103) 购自北京天根生化科技有限公 司 ;2 EasyTaq R PCRSuperMix 购自北京全式金生 物科技有限公司 ;DL 2000DNAMARKER 购自大连宝生物公司 ;PCR 仪为美国 BIO-RAD MyCycler; 电泳仪和凝胶成像分析系统均购自美国 BIO-RAD 公司 1.3 药敏试验与 ESBLs 检测细菌分离培养按 全国临床检验操作规程 ( 第 3 版 ) 进行, 采用西门子全自动微生物分析仪 (walkway96plus) 鉴定到种 体外药敏试验采用纸片扩散法 (K-B 法 ), 药敏试验结果判断参照美国临床实验室标准化协会 (Clinical and Laboratory [4] Standards Institute,CLSI)2012 版标准执行 采用头孢他啶 (30 滋 g/ 片 ) 头孢他啶/ 克拉维酸 (30 滋 g/ 10 滋 g) 头孢噻肟(30 滋 g/ 片 ) 头孢噻肟/ 克拉维酸 (30 滋 g/10 滋 g) 进行 ESBLs 检测, 当两种药物中任何一种加克拉维酸与不加克拉维酸的抑菌环直径差值 5mm 时, 判定所检测菌株为产 ESBLs 型

904 39 卷 PCRSu- 菌株 permix 25 滋 L, 补足 ddh 2 O 至总体积 50 滋 L PCR 1.4 ESBLs 基因扩增与测序分析挑取纯培养菌落, 按照说明书提取质粒 反应程序 : 预变性 94 5 min, 变性 94 30s, 退火 30s ( 退火温度参照引物合成单上的温度 ), 延 DNA, 然后进行 PCR 扩增 扩增引物序列见表 1, 委托上海生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司进行合成 每管 PCR 反应加 DNA 模板 1 滋 g, 伸 72 1min,35 个循环, 延伸 72 5min 扩增产物行琼脂糖凝胶电泳分析, 测序验证委托广州达安基因公司进行 10 滋 M 上 下游引物各 1 滋 L,2 EasyTaq R 表 1 ESBLs 耐药基因引物序列表 基因 引物 (5'-3') 扩增片段 /bp TEM 正向 ATAAAATTCTTGAAGAC 1076 反向 TTACCAATGCTTAATCA SHV 正向 GGGTTATTCTTATTTGTCGC 930 反向 TTAGCGTTGCCAGTGCTC CTX-1 正向 CGGTGCTGAAGAAAAGTC 354 反向 TACCCAGCGTCAGATTAC CTX-2 正向 ACGCTACCCCTGCTATTT 780 反向 GCTTTCCGCCTTCCCTGCTC CTX-9 正向 GCACATAATACGCAGGTG 393 反向 CGGCGTGGTGGTGTCTCT 1.5 统计学方法细菌的检出率 耐药率采用 Whonet 5.6 软件进行分析, 耐药基因型检出率和耐药分布模式采用 SPSS 19.0 软件进行分析 计数资料组间比较采用 χ 2 检验,P 0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中产 ESBLs 菌株检出率从 236 株大肠埃希菌检出产 ESBLs 菌株 77 株, 检出率为 32.63% 从 224 株肺炎克雷伯菌中检出产 ESBLs 菌株 68 株, 检出率为 30.36% 2.2 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对常见抗生素的耐药率大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对 18 种抗生素耐药谱相似 无论产 ESBLs 或非产 ESBLs 大肠埃希菌 产 ESBLs 或非产 ESBLs 肺炎克雷伯菌对第四代头孢菌素类 酶抑制剂复方制剂 亚胺培南 阿米卡星 妥布霉素 呋喃妥因的耐药率均较低 与非 ESBLs 大肠埃希菌相比, ESBLs 大肠埃希菌对氨苄西林 哌拉西林 替卡西林 / 克拉维酸 头孢呋辛 头孢他啶 头孢吡肟 头孢曲松 氨曲南 庆大霉素 左氧氟沙星 头孢替坦 阿米卡星和环丙沙星的耐药率更高 (P<0.05); 与非 ESBLs 肺炎克雷伯菌相比, ESBLs 肺炎克雷伯菌对氨苄西林 哌拉西林 头孢呋辛 头孢他啶 头孢吡肟 头孢曲松 头孢替坦 氨曲南 阿米卡星 庆大霉 素 环丙沙星 左氧氟沙星 哌拉西林 / 他唑巴坦和替卡西林 / 克拉维酸的耐药率更高 (P<0.05), 见表 2 2.3 产 ESBLs 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的耐药基因型检出率对确认的 77 株产 ESBLs 大肠埃希菌及 68 株产 ESBLs 肺炎克雷伯菌进行 TEM SHV CTX-M ( 主要亚型为 M1 M2 和 M9) 等耐药基因检测, 发现产 ESBLs 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中 TEM 基因 CTX-M1 亚型检出率差异无统计学意义 (P>0.05); 产 ESBLs 肺炎克雷伯菌 SHV 基因 CTX-M2 亚型检出率均高于产 ESBLs 大肠埃希菌 (P<0.05),CTX-M9 亚型的检出率低于产 ESBLs 大肠埃希菌 (P<0.05), 见表 3 2.4 产 ESBLs 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药基因分布各耐药基因在两菌中分布情况见表 4 2.5 基因测序分析验证对上述所有基因扩增片段进行测序分析验证, 结果与 PCR 扩增电泳分析结果一致 3 讨论大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为肠杆菌科主要分离菌株, 据报道分别占 40.6% 和 32.0% [6] 大肠埃希菌是肠道菌群的组成部分, 其中产 ESBLs 大肠埃希菌泌尿系统感染已成为临床治疗难题, [7] 也是医院感染控制面临的严峻挑战 肺炎克雷

8 期蒋德安, 等. 产 ESBLs 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药性及基因型分析 905 抗菌药物 大肠埃希菌 (n=236) 肺炎克雷伯菌 (n=224) ESBLs(n=77) 非 ESBLs(n=159) ESBLs(n=68) 非 ESBLs(n=156) 氨苄西林 77(100.00) ** 143(89.94) 68(100.00) ** 123(78.85) 哌拉西林 75(97.40) ** 106(66.67) 63(92.64) ** 49(31.41) 哌拉西林 / 他唑巴坦 3(3.90) 3(1.89) 4(5.88) * 2(1.28) 替卡西林 / 克拉维酸 28(36.36) ** 30(18.87) 16(23.53) * 19(12.18) 头孢呋辛 74(96.10) ** 10(62.89) 64(94.12) ** 49(31.41) 头孢他啶 73(94.81) ** 51(32.08) 63(92.65) ** 51(32.69) 头孢曲松 74(96.10) ** 102(64.15) 52(76.47) ** 46(29.49) 头孢吡肟 31(40.26) ** 30(18.87) 14(20.59) ** 11(7.05) 头孢替坦 8(10.39) ** 5(3.14) 7(10.29) ** 2(1.28) 氨曲南 52(67.53) ** 69(43.40) 23(33.82) ** 28(17.95) 亚胺培南 0(0.00) 0(0.00) 1(1.47) 0(0.00) 阿米卡星 10(12.89) * 7(4.40) 11(11.76) ** 4(2.56) 庆大霉素 56(72.73) ** 82(51.57) 28(41.18) ** 30(19.23) 妥布霉素 25(32.47) 33(20.75) 7(10.29) 9(5.77) 环丙沙星 61(79.22) * 101(63.52) 63(92.64) ** 101(64.74) 左氧氟沙星 74(96.10) ** 97(61.01) 22(32.35) ** 18(11.54) 复方磺胺甲噁唑 76(98.70) 156(98.11) 67(98.53) 153(98.08) 呋喃妥因 8(10.39) 9(5.67) 37(54.41) ** 40(25.64) 与非 ESBLs 菌比较 * P<0.05, ** P<0.01 表 2 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药率 [ 例 (%)] 表 3 产 ESBLs 的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药基因的检出率 [ 例 (%)] 耐药基因 产 ESBLs 大肠埃希菌 (n=77) 产 ESBLs 肺炎克雷伯菌 (n=68) χ 2 值 P 值 TEM 46(59.74) 49(72.06) 2.43 0.12 SHV 32(41.56) 53(77.94) 19.71 0.00 CTX-M1( 亚型 ) 12(15.58) 17(25.00) 2.00 0.16 CTX-M2( 亚型 ) 14(18.18) 23(33.82) 4.65 0.03 CTX-M9( 亚型 ) 45(58.44) 20(25.97) 12.30 0.00 表 4 耐药基因 产 ESBLs 的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药基因分布情况 [ 例 (%)] 产 ESBLs 大肠埃希菌 (n=77) 产 ESBLs 肺炎克雷伯菌 (n=68) TEM+SHV+CTX-M 28(36.36) 29(42.65) TEM+SHV 4(5.19) 8(11.76) TEM+CTX-M 12(15.58) 12(17.65) SHV+CTX-M 20(25.98) 13(19.12) TEM 2(2.60) 0(0.00) SHV 0(0.00) 3(4.41) CTX-M 11(14.29) 3(4.41) 合计 77(100.00) 68(100.00) 伯菌是临床常见条件致病菌之一, 并保持较高的 [6,8] 检出率, 多药耐药的肺炎克雷伯菌已成为 ICU 肠道菌群异位感染的关键因素 [9] 本研究中产 ES- BLs 大肠埃希菌的检出率为 32.63%, 产 ESBLs 肺炎克雷伯菌的检出率为 30.36%, 黄烈等报道产 ESBLs 大肠埃希菌的检出率为 42.7% 产 ES- BLs 肺炎克雷伯菌的检出率为 36.2%, 可能和区域差别 抗生素使用情况不同有关 自 1983 年德国报道了首例由 ESBLs 引起的 [10] 感染, 目前这类细菌已成为我国院内感染主要的目标细菌监测类型 本研究中 ESBLs 大肠埃希菌和 ESBLs 肺炎克雷伯菌对第四代头孢菌素类 酶抑制剂复方制剂 阿米卡星 妥布霉素 呋喃妥因耐药率较低, 对亚胺培南的耐药率分别为 0.00% 和 1.47%, 提示临床可以根据病人感染情况按照限制级别选择这些抗生素对病人进行抗感染治疗 ; 两种细菌对茁 - 内酰胺类 第三代头孢菌素类抗生素均高度耐药, 耐药率均高于 90%; 两种细菌对四环素类 奎诺酮类 氨基糖苷类和磺胺类药物的耐药率均较高, 可能和它们携带多药耐药 [11] 基因有关 由于每个国家 地区抗生素使用习惯不同, 因此不同地区肠杆菌科细菌中流行的 ESBLs 耐药基因型有所不同 TEM 和 SHV 型呈全球性分布, 主要发生于欧美等发达国家 ;CTX-M 型目前分布日趋广泛, 为亚洲 欧洲 ESBLs 主要耐药基 [12] [12] 因型 中国为 CTX-M 型高发地区, 北京 上海 广州等地均有报道 本文对我院主要肠杆菌科大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产 ESBLs 菌株

906 39 卷 TEM SHV 和 CTX-M(M1 M2 和 M9 亚型 ) 耐药基因进行检测, 产 ESBLs 大肠埃希菌和产 ESBLs 肺炎克雷伯菌携带 TEM 耐药基因型检出率差异 [13] 无统计学意义, 与王忠永等结果不同 产 ESBLs 大肠埃希菌种 SHV 基因的检出率低于产 ESBLs [14] 肺炎克雷伯菌, 与岳欣等的报道相似, 与黄烈 等结果不同 CTX-M 是流行于中国 ESBLs 菌的 [13] 主要耐药基因型 CTX-M2 型在产 ESBLs 肺炎克雷伯菌中的检出率高于产 ESBLs 大肠埃希菌, CTX-M9 亚型在产 ESBLs 肺炎克雷伯菌中的检出率低于产 ESBLs 大肠埃希菌 本研究的 77 株产 ESBLs 大肠埃希菌和 68 株产 ESBLs 肺炎克雷伯菌中分别有 64 和 62 株携带 2 种或 3 种耐药基因, 提示本地区产 ESBLs 耐药基因型流行的复杂性和多样性 单纯携带 CTX-M 基因在产 ESBLs 大肠埃希菌中占 14.29%, 在产 ESBLs 肺炎克雷伯菌中占 4.41%, 这可能和当地临床对肠杆菌科大肠埃希菌的治疗过程中长期使用第三代头孢菌素如头孢曲松 头孢噻肟等有关 综上, 我院产 ESBLs 大肠埃希菌和产 ESBLs 肺炎克雷伯菌对第四代头孢菌素类 酶抑制剂复方制剂 亚胺培南 阿米卡星 妥布霉素 呋喃妥因耐药率较低, 对第三代头孢菌素具有较高的耐药性, 耐药基因型具有复杂性和多样性 因此, 常规药敏试验结合耐药基因检测, 可以更好地指导临床合理使用抗生素, 帮助医务人员控制泛耐药菌株在医院内的传播流行 参考文献 : [1] 全国细菌耐药监测网. 2015 年全国细菌耐药监测网报告 [R]. 北京 : 全国细菌耐药监测网,2015. [2] Ghafourian S,Sadeghifard N,Soheili S,et al. Extended Spectrum Beta-lactamases: Definition, Classification and Epidemiology[J]. Curr Issue Mol Biol, 2014,17 (5):11-22. [3] Brookes VJ,Jordan D,Davis S,et al. Saltelli global sensitivity analysis and simulation modelling to identify intervention strategies to reduce the prevalence of escherichia coli O157 contaminated beef carcasses [J]. PLoSOne,2015,10(12):e0146016. [4] CLSI. M100S22Peformance standards for antimicrobial susceptiblility testing[s]. Wayne,PA. USA: CLSI, 2012. 黄烈, 韦洁宏, 张银辉, 等. 大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌产 ESBLs 表型与基因型分析 [J]. 中华医院感染学杂志,2009,19(1):17-20. [6] 李刚, 赵慧铮, 贾伟, 等. 7315 株肠杆菌科细菌的临床分布与耐药性分析 [J]. 国际检验医学杂志, 2015,36 (6):786-790. [7] 陈夏容, 张华平, 曾秀玉, 等. 社区产 ESBLs 大肠埃希菌泌尿系感染的危险因素分析 [J]. 中国循证医学杂志,2016,16(2):125-129. [8] 刘婧娴, 俞静, 刘瑛. 产碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药基因及流行病学研究进展 [J]. 中国感染与化疗杂志,2015,15(1):91-96. [9] 王惠娇, 徐娇君, 陈小平, 等. ICU 患者感染多药耐药肺炎克雷伯菌的耐药性分析 [J]. 中华医院感染学杂志,2016,26(6):1235-1240. [10] Min YW,Rhee PL. The clinical potential of ramosetron in the treatment of irritable bowel syndrome with diarrhea (IBS D)[J]. Therap Adv Gastroenterol,2015,8(3): 136-142. [11] 王卓, 王雨欣, 陈强, 等. 产 ESBLs 肠杆菌科细菌的检测及耐药性 [J]. 中国微生态学杂志, 2016,28 (5):564-569. [12] 王辉, 陈民钧, 倪语星, 等. 2003-2004 年中国十家教学医院革兰阴性杆菌的耐药分析 [J]. 中华检验医学杂志,2005,28(12):1295-1303. [13] 王忠永, 李响新, 吕美艳, 等. 革兰阴性杆菌超广谱茁 - 内酰胺酶基因分型及耐药相关性研究 [J]. 中华医院感染学杂志,2010,20(16):2361-2363. [14] 岳欣, 田文君, 王鹏. 产超广谱茁 - 内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌等耐药及 TEM 与 SHV 基因型分析 [J]. 中华医院感染学杂志,2016,26(14): 3125-3128. ( 责任编辑 : 刘瑛 )

8 期蒋德安, 等. 产 ESBLs 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药性及基因型分析 907 The Antibiotic Resistance and Genotype in ESBLs Escherichia Coli and Klebsiella Pneumoniae JIANG Dean 1, WANG Fang 1, MA Lingfei 1, WU Ning 2 (1. Dept. of Laboratory Medicine, Wuzhong People s Hospital, Wuzhong 751100; 2. Dept. of Scientific Research, Daan Gene Co., Ltd. of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510665) Abstract: Objective To investigate the antibiotic resistance and genotype in ESBLs Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. Methods 236 Escherichia coli and 224 Klebsiella pneumoniae strains were continuously collected from our hospital and they were tested by antibiotic sensitivity and phonotype of ESBLs. ESBLs related genes of TEM, SHV and CTX-M (M1,M2 and M9) were amplified by PCR and verified by sanger sequencing. Results The positive rate of ESBLs Escherichia coli was 32.63% and that of Klebsiella pneumoniaeis was 30.36%. Both ESBLs Escherichia coli and ESBLs Klebsiella pneumoniae were highly resistant to Ampicillin, Piperacillin, Cefuroxime, Ceftazidime, Ceftriaxone, Aztreonam, Gentamycin, Levofloxacin, etc. As for resistant genes detecting results, the SHV and CTX-M2 gene in ESBLs Escherichia colistrains was significantly higher than that in ESBLs Escherichia coli with significant difference(p<0.05) while CTX-M9 gene in ESBLs Escherichia colistrains was significantly lower than that in ESBLs Escherichia coli. Conclusion The situation of the antibiotic-resistance of ESBLs Escherichia coli and Klebsiella pneumoniaeare is serious in our hospital and it must be attached more attention to the combination with routine test and antibiotic-resistant gene detection which are applied in clinics. Key words: Extended Spectrum Beta-Lactamases; Escherichia coli; Klebsiella pneumoniae; antibiotic-resistance; genotype ( 上接第 902 页 ) the patients followed with cerebral angiography. Methods 436 cases admitted to our hospital between October 2012 and June 2016 were included. All patients underwent cerebrovascular angiography were divided into CI-AKI group or non CI-AKI group based on the baseline of elevated serum creatinine(scr) above 25% after operation within one day. Pre-and post-operative ul-fabp and u-ngal levels were detected by ELISA. Related indicators, clinical information were collected, and the diagnostic value was verified on the risk factors by diagnostic test and receiver operating characteristic(roc) curve. Results 1) Pre-operative ul-fabp, u-ngal, dose of contrast medium>100ml, dose of contrast medium and history of diabetes were significantly different in two groups(p<0.05). 2) Pre-operative ul-fabp, u-ngal, dose of CM>100mL and history of diabetes were significantly associated with the incidence of CI-AKI(P<0.05). 3) Postoperative ul-fabp and u-ngal levels were significantly positively correlated with postoperative Scr level(p <0.05). 4) The optimal cutoff of postoperative ul-fabp to predict CI-AKI was 72.86μg(g Cr) -1 (sensitivity 0.833, specificity 0.768) and the optimal cutoff of postoperative u-ngal to predict CI-AKI was 1128.36μg(g Cr) -1 (sensitivity 0.867, specificity 0.761). Conclusion Pre-operative ul-fabp and u-ngal is positively correlated with the incidence of CI-AKI. It is suggested that post-operative ul-fabp and u-ngal are of early diagnostic value for CI-AKI. Key words: cerebrovascular angiography;contrast-induced acute kidney injury;liver-type fatty acid binding proteins; urinary neutrophil gelatinase-associated lipocalin