502 南方医科大学学报 J South Med Univ 202;32(4) 基础研究 小鼠前列腺干细胞抗原的原核表达 纯化及抗原活性检测 董金凯 2 罗 津 3 阎瑾琦 2 张 亮 2 高江平 于继云 2 中国人民解放军总医院泌尿外科 北京 00853 2 军事医学科学院基础医学研究所 北京 00850 3 湖南省永州 市人民医院 湖南 永州 425000 摘要 目的 RT-PCR 扩增小鼠前列腺干细胞抗原 mpsca 基因 构建原核表达质粒 pet-42a-mpsca 诱导 mpsca 蛋白表达并 纯化 并检测 mpsca 蛋白的抗原活性 方法 利用 RT-PCR 的方法从小鼠前列腺癌细胞系 RM- 细胞中扩增 mpsca 基因 测序 正确后 PCR 的方法去掉 mpsca 的信号肽序列将其克隆至原核表达载体 pet-42a 中构建重组载体 pet-42a-mpsca 将其转化 至大肠杆菌 BL2 DE3 中诱导表达 随后将表达的融合蛋白进行纯化 经 SDS-PAGE 分析后 Western blot 检测纯化的蛋白 将纯化蛋白进一步包板后用 ELISA 法对其抗原活性进行评价 结果 测序结果证实成功扩增出全长 mpsca 基因 酶切和测序 结果证实 pet-42a-mpsca 原核表达载体构建成功 转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白 Western blot 检测证 实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应 ELISA 检测显示纯化后的 mpsca 抗原具有免疫原性 结论 成功扩增出小鼠全长 PSCA 基因 成功构建了 mpsca 基因的原核表达载体 获得了纯化的 mpsca 蛋白 该蛋白具有良好的抗原活性 为进一步研究 以PSCA为靶点的前列腺癌的免疫治疗奠定了基础 关键词 前列腺干细胞抗原 原核表达 蛋白纯化 前列腺癌 中图分类号 R3 文献标志码 A 文章编号 673-4254 202 04-0502-05 doi: 0.3969/j.issn.673-4254.202.04.03 http://www.cnki.net/kcms/detail/44.627.r.2020405.650.002.html Prokaryotic expression, purification and antigenicity identification of mouse prostate stem cell antigen DONG Jinkai, 2, LUO Jin3, YAN Jinqi2, Zhang Liang2, GAO Jiangping, YU Jiyun2 Department of Urology, General Hospital of PLA, Beijing 00853, China; 2Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 00850, China; 3Department of Urology, Yongzhou People's Hospital, Yongzhou 425000, China Abstract: Objective To amplify mouse prostate stem cell antigen (mpsca) gene and construct a recombinant plasmid to obtain mpsca protein and identify its antiginicity. Methods The gene of mpsca was amplified by RT-PCR from mouse prostate cancer cell line RM- with the signal peptide sequence removed. The PCR product was cloned into pet-42a prokaryotic expression vector to construct the recombinant plasmid pet-42a-mpsca, which was transformed into BL2 (DE3) for mpsca expression. The fusion protein was purified and identified by SDS-PAGE and Western blotting. The antigenicity of the purified protein was characterized by ELISA. Results The mpsca gene was obtained with an identical sequence to that retrieved in GenBank. The prokaryotic expression vector for mpsca was successfully constructed as confirmed by enzyme digestion and DNA sequencing. Both Western blotting and ELISA demonstrated the antigenicity of the purified mpsca protein. Conclusion The purified mpsca obtained possesses good antigenicity, which will facilitate further study of immunotherapy for prostate cancer targeting PSCA. Key words: prostate stem cell antigen; prokaryotic expression; protein purification 前列腺干细胞抗原 PSCA 是998年Reiter等 在 研究前列腺癌基因表达的过程中发现的一个肿瘤相关 抗原 属于 Ly-6/Thy- 家族 是具有 23 个氨基酸的糖 蛋白 因为PSCA与干细胞抗原-2 SCA-2 具有30%的 收稿日期 202-02-07 基金项目 国家自然科学基金 30840094 国家高技术研究发展计划 863 项目(2007AA02Z45) Supported by National Natural Science Foundation of China (30840094) and National High Technology Research and Development Program of China (2007AA02Z45). 作者简介 董金凯 博士 E-mail: jk_dong@63.com 通讯作者 于继云 副研究员 电话 00-6693236 E-mail: yujyun@26. com 同源性 因而被称为前列腺 干细胞抗原 但是目前的 研究表明 PSCA主要表达于分化成熟的细胞表面而不 是干细胞表面 2-3 其具体的功能还不清楚 PSCA在前 列腺癌 膀胱癌以及胰腺癌中表达增加 并且发现其表 达水平与前列腺癌的临床分期及转移密切相关 因此 PSCA 已经成为这些肿瘤的诊断和预后判断的生物学 标记 除此之外 PSCA 也成为这些肿瘤的免疫治疗靶 点 特别是在前列腺癌的免疫治疗中显示出很大的临床 应用潜力 4 在PSCA为靶点的前列腺癌免疫治疗的临 床前研究中 多采用小鼠或转基因小鼠前列腺癌模型进 行临床前评价 为进一步探讨 PSCA 在前列腺癌免疫
第 4 期 董金凯, 等. 小鼠前列腺干细胞抗原的原核表达 纯化及抗原活性检测 503 治疗中的效果及其相关机制, 本研究钓取了 mpsca 全长基因, 构建了 mpsca 蛋白的原核表达载体, 纯化得到了 mpsca 蛋白并对其免疫原性进行了相关的检测, 为下一步 PSCA 在前列腺癌免疫治疗临床前的研究奠定了基础 材料和方法. 材料质粒 pet-42a 感受态大肠杆菌 E.coli. DH5α 和 E.coli. BL2(DE3) 为本实验室保存 ; 小鼠前列腺癌细胞系 RM- 购自上海细胞库 ;T 4 DNA 连接酶为 TaKaRa 产品 ;DNA 限制性内切酶 Sal Ⅰ BamH Ⅰ 购自 New England Biolabs; 所用 PCR 引物均由 Invitrogen 合成 ; DNA 片段纯化试剂盒 DNA 片段凝胶回收试剂盒 质粒小量提取试剂盒均购自北京三博远志生物技术有限公司 ;Trizol 为 Invitrogen 产品 ; 逆转录试剂盒购自东洋纺生物科技有限公司 ; 兔抗鼠 PSCA 多克隆抗体购自 Santa Cruz; 兔抗小鼠 IgG 抗体和 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 的抗体购自中杉金桥公司 ;Western blot 超敏发光液购自普利莱公司 ;IPTG 购自 Promega; 凝血酶 Thrombin 购自 Sigma; 标准相对分子质量蛋白 Marker 购自经科宏达生物公司 ; 谷胱甘肽琼脂糖凝胶 Glutathione SepharoseTM4B 纯化试剂购自 GE Healthcare.2 方法.2. mpsca 基因的扩增根据小鼠 PSCA 的 cdna 序列 ( 序列号 :NM_02826) 设计引物, 用于扩增 PSCA 全长基因 : 上游引物为 F: 5'ACCATGAAGACCGTC TTCTTTC3'; 下游引物为 R: 5'TCTCCCAGAGCCTA CAGAC3' 用 Trizol 一步法提取小鼠前列腺癌细胞系 RM- 细胞的总 mrna, 按照东洋纺公司逆转录试剂盒说明书进行逆转录为 cdna, 以其为模板进行 PCR 扩增 PCR 反应条件为 :94 预变性 5 min,94 30 s 58 30 s 72 30 s 进行 30 个循环,72 延伸 5 min 取反应产物 50 μl 琼脂糖凝胶电泳, 胶回收纯化 PCR 产物 将 PCR 产物连入 pmd8-t 载体, 连接产物转化入大肠杆菌 E.coli. DH5α, 挑取阳性克隆, 提取质粒, 测序比对正确的质粒命名为 pmd8-t-mpsca.2.2 mpsca 原核表达载体的构建及鉴定在 mpsca 原序列基础上, 运用 PCR 方法进行改造, 去掉 mpsca 基因序列中的信号肽序列, 引物设计如下 : 上游引物 F: 5'GCGGATCCCTGCAGTGCTATTCATG3'; 下游引物 R:5'GCGTCGACTCTCCCAGAGCCTACAGAC3' 在 mpsca 基因上下游分别引入 BamHⅠ 和 SalⅠ 两个酶切位点, 以 pmd8t-mpsca 质粒为模板,PCR 反应条件为 :94 预变性 5 min,94 30 s 58 30 s 72 30 s 进行 30 个循环, 最后 72 延伸 5 min 取反应产物 50 μl 琼脂糖凝胶电泳, 胶回收纯化 PCR 产物 将 PCR 产物连入 T 载体, 连接产物转化入大肠杆菌 E.coli. DH5α, 挑取阳性克隆, 提取质粒, 送英骏生物技术公司测序 测序正确的质粒和 pet-42a 载体分别用 BamHⅠ 和 SalⅠ 双酶切,T 4 连接酶连接, 连接产物转化感受态菌 E. coli. DH5α, 卡那霉素平板筛选阳性克隆, 提取阳性克隆质粒, 用 BamHⅠ 和 SalⅠ 双酶切及 PCR 鉴定, 鉴定正确的质粒送测序, 测序正确的质粒命名为 pet-42a-mpsca.2.3 mpsca 蛋白的诱导表达将重组表达质粒 pet- 42a-mPSCA 转化至感受态菌 E.coli. BL2 ( DE3) 中, 挑取阳性克隆,37 培养过夜, 同时转化 pet-42a 空载体作为对照 将 50 μl 菌液接种于 5 ml Kana 抗性 LB 培养基中,37 振荡培养至 D 600 0.6 取出 ml 未诱导的菌液做为对照, 其余液体加入 IPTG 至终浓度 0.25 mmol/l, 30 继续培养 在诱导 4 h 后取 ml 菌液放到离心管中,4,2 000 r/min 离心 min, 弃上清, 加入 SDS 上样缓冲液 00 μl,00 加热 5 min, 行 SDS-PAGE 检测, 鉴定融合蛋白的诱导表达 同时以含有 GST 标签蛋白的 pet-42a 空载体转化并进行诱导表达作为对照.2.4 GST-mPSCA 蛋白的纯化对含重组质粒 pet- 42a-mPSCA 的 E.coli. BL2(DE3) 菌落进行大量扩增, 37 培养至菌液 D 600 0.6 时, 加入 IPTG 终浓度为 0.25 mmol/l 诱导 30 培养 4 h 4,8000 r/min 离心 5 min 离心收集菌体, 采用预冷的裂解缓冲液重悬菌体, 进行超声波碎菌, 随后 4,2 000 r/min 离心 30 min 收集上清液进行纯化, 具体纯化操作参照 GE Healthcare 生物公司的 Glutathione SepharoseTM4B 纯化试剂说明书进行, 将得到的蛋白样品测浓度后分装保存于 -70 冰箱备用 取部分样品用 SDS 上样缓冲液处理后进行 2% 的 SDS-PAGE 分析.2.5 GST-mPSCA 融合蛋白的 Western blot 检测融合蛋白 GST-mPSCA 经 2% SDS-PAGE 分离后电转移至 PVDF 膜, 室温封闭 2 h, 200 稀释兔抗小鼠 PSCA 多抗体 (Santa Craz) 孵育过夜,TBST 洗膜 3 次,0 min/ 次, 最后加入 2000 稀释的 HRP 标记的羊抗兔 IgG 抗体, 37 孵育 h,tbst 洗膜 3 次,0 min/ 次, 显影 未诱导的转化 pet42a-mpsca 质粒的菌液总蛋白按相同步骤操作, 设为对照.2.6 ELISA 检测纯化的 GST-mPSCA 蛋白用凝血酶室温过夜切割纯化回收后, 用包被液将纯化后的 mpsca 蛋白稀释至 2 μg/ml,00 μl 包被 96 孔 ELISA 酶标板 4 过夜,PBST 洗板 3 次, min/ 次,% BSA 37 封闭 h;pbst 洗板 3 次, min/ 次, 各孔分别加入按照 00 200 400 800 600 3200 稀释
504 南方医科大学学报 J South Med Univ 兔抗小鼠 PSCA 多克隆抗体 00 μl 并以同型无关抗体 兔抗小鼠IgG 抗体作阴性对照 以PBS 为空白对照 每 个浓度设立 3 个副孔 37 孵育 h PBST 洗板 3 次 min/次 加入 2000 稀释的 HRP 标记的羊抗兔 IgG 50 μl 37 孵育 h PBST 洗板3次 TMB 底物显色后 以2 mol/l H2SO4终止 D450 nm 测定吸光度值 2 结果 2. mpsca 基因的扩增及序列测定 经 %琼脂糖凝胶电泳分析 以小鼠前列腺癌细胞 系RM-的cDNA 为模板的PCR反应 成功扩增出大小 约为380 bp的条带 与预期的片段长度一致 图 连 接入过度载体 pmd8-t 后测序证实与 GenBank 中公 布的序列一致 序列号 NM_02826 bp M 2 000 500 750 500 250 图 RT-PCR 扩增 mpsca 基因产物琼脂糖 电泳图 M: DNA Marker DL2000 ; : mpsca 基 因 RT-PCR扩增产物 Fig. Agarose gel electrophoresis of the RT-PCR product of mpsca gene. bp M 第 32 卷 2 3 2 000 500 750 500 250 图 2 重组质粒 pet-42a-mpsca 酶切鉴定及 PCR 鉴 定电泳图 M: DNA Marker DL2000 ; : 重组质粒 pet-42a-mpsca; 2: 重组质粒BamHⅠ, SalⅠ双酶切鉴定; 3: 去信号肽后mPSCA基因PCR鉴定 Fig.2 Identification of the recombinant plasmid pet-42a-mpsca by enzyme digestion and PCR. GST-mPSCA经SDS-PAGE分析 可见一清晰的相对分 子质量大小约为40 000的条带 箭头所指 与预期的蛋 白大小相符 图3 pet-42a空载体可见诱导的gst蛋 白的表达 箭头所指 2.4 GST-mPSCA蛋白的Western blot检测 GST-mPSCA 蛋白应用特异性的抗小鼠 PSCA 的 抗体可以检测到相对分子质量与预期的片段大小一致 的特异性条带 图4 可见纯化后的融合蛋白具有与特 异性抗体结合的能力 2.5 间接ELISA法鉴定mPSCA蛋白的抗原性 以切割纯化后的mPSCA蛋白包被酶标板 用不同 稀释倍数的兔抗 mpsca 抗体对包被蛋白进行 ELISA 检测 以同型无关抗体兔抗鼠 IgG 作阴性对照 每个稀 释度做3个复孔 所有数据用均数±标准差表示 结果如 表 所示 将表 数据以抗体浓度为横坐标(x) 以D450 nm值为 纵坐标(y) 绘制曲线见图5 线性回归方程为y=0.607x+ 0.77 相关系数R2=0.979 由于R2>0.9 可判定为y与x 之间为高度线性相关 由图中可以看出纯化后的 mpsca抗原具有较高的灵敏性及特异性 2.2 pet-42a-mpsca 重组质粒的鉴定 PCR 的方法去除 mpsca 基因的信号肽序列后连 接入 pet-42a 载体构建成重组质粒 pet-42a-mpsca 3 讨论 该重组质粒用 BamHⅠ和 SalⅠ双酶切鉴定 可以获得 前列腺癌是西方国家人群最常见的恶性肿瘤之一 大小约为 320 bp 的基因片段 图 2 同时以该质粒为 在我国的发病率也呈上升趋势 目前对于发展到雄激 模板和去除信号肽序列时的引物进行PCR扩增可以获 素非依赖期以后的前列腺癌的治疗尚缺乏特别有效的 得大小约为320 bp片段 图2 鉴定正确的质粒 送测 手段 因此 免疫治疗作为一种通过激活机体免疫系统 序 将测序正确的重组质粒命名为 pet-42a-mpsca 并 特异性清除肿瘤细胞的新方法 也正逐步应用到前列腺 保存 癌的治疗中 200 年美国 FDA 已经批准以 PAP-GM2.3 GST-mPSCA 蛋 白 的 诱 导 表 达 及 纯 化 的 SDSCSF 融合蛋白致敏的自体抗原递呈细胞 APC 疫苗 PAGE分析 5 上市用于治疗雄激素难治性的转移性 在预试验中通过对IPTG的浓度 诱导的温度和时 Sipuleucel-T 前列腺癌 开创了前列腺癌免疫治疗的新时代 间进行了一系列的优化 最终确定诱导的条件为 IPTG PSCA是一种发现相对较晚的前列腺癌相关抗原 终浓度为 0.25 mmol/l 30 诱导 4 h 时 GST-mPSCA 在前列腺癌细胞中表达显著增加 组织特异性相对较好 蛋白的可溶性表达最好 纯化后的融合蛋白
第 4 期 董金凯, 等. 小鼠前列腺干细胞抗原的原核表达 纯化及抗原活性检测 505 Mr 0 3 M 2 3 4 5 M 70 30 00 70 55 40 35 25 5 图 3 GST-mPSCA 融合蛋白的诱导表达及其纯化产物的 SDS-PAGE 分析 M: 蛋白预染 Marker; : pet-42a 空载体未诱导 ; 2: pet-42a 空载体诱导 ; 3: pet-42a-mpsca 未诱导 ; 4: pet-42a-mpsca 诱导 ; 5: 纯化后的 GST-mPSCA 蛋白 Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressed and purified products of GST-mPSCA fusion protein. 2.5 y=0.607x+0.77 R 2 =0.979 图 4 GST-mPSCA 融合蛋白的 Weatern blot 鉴定 : 阴性对照 ( 未诱导的菌液蛋白 ); 2: GST-PSCA 融合蛋白 Fig.4 Identification of GST-PSCA fusion protein by Western blotting. 表 mpsca 抗原包被的检测结果 Tab. Results of ELISA with mpsca as the coating antigen 抗体稀释倍数 00 200 400 800 600 3200 空白对照 抗体浓度 (ng/μl) 2 0.5 0.25 0.25 0.0625 0 兔抗鼠 mpsca.34±0.86 0.853±0.34 0.562±0.40 0.349±0.093 0.203±0.065 0.48±0.044 0.052±0.007 D450 nm 兔抗鼠 IgG 0.083±0.0 0.080±0.006 0.079±0.0 0.073±0.007 0.06±0.009 且不易引起免疫耐受, 成为前列腺癌免疫治疗的良好的 靶点 [6] 目前以 PSCA 抗原肽致敏的 DC 细胞疫苗已经 在晚期抗前列腺癌患者中进行了 Ⅰ-Ⅱ 期临床试验 [7-8], 与对照组相比可以延长患者的中位生存时间达 4 个 月, 患者体内可以检测到迟发性超敏反应从而说明该 - 0.053±0.004 D450 nm.0 0.5 0.0 兔抗鼠 PSCA 兔抗鼠 lgg 0.0 0.5.0.5 2.0 2.5 Cρ 抗体 /(ng μl - ) 图 5 D 450 nm 随抗体浓度变化的曲线 Fig.5 Curve of D450 nm for different antibody concentrations. DC 疫苗可以激活机体产生抗原特异性的肿瘤免疫反 应 以 PSCA 为靶点的前列腺癌免疫治疗的其他形式 的疫苗也已经进行了临床前的评价 编码鼠 PSCA 基 因的 DNA 疫苗进行的临床前评价证实, 疫苗能够诱导 产生 PSCA 特异性的 CD8+T 细胞免疫反应, 可以抑制 小鼠体内前列腺癌移植瘤的生长, 延缓前列腺癌转基因 小鼠的肿瘤发展, 并对疫苗发挥作用的可能机理进行了 初步的探讨 [9-] 另外的研究发现 PSCA 抗体与 T 细胞 受体 β 链融合后修饰的 T 细胞可以特异性地杀伤 PSCA 阳性的肿瘤细胞 [2] 本实验室前期已经成功表达并纯 化出人 PSCA 蛋白 [3], 但是目前以 PSCA 为靶点的免疫 治疗的临床前评价中大多采用小鼠或转基因小鼠前列 腺癌模型进行评价, 因此钓取小鼠全长 PSCA 基因并纯
506 南方医科大学学报 (J South Med Univ) 第 32 卷 化小鼠 PSCA 蛋白对研究 PSCA 为靶点的免疫治疗的临床前研究具有重要作用, 在后续的免疫治疗实验中可以用于评价血清中 PSCA 抗体水平 致敏 DC 制备单克隆抗体以及用于 PSCA 为靶点的免疫治疗的机制研究 本研究中我们应用 RT-PCR 的方法成功扩增出小鼠全长 PSCA 基因, 为下一步构建以 PSCA 为靶点的 DNA 疫苗奠定了基础 同时我们将去除信号肽的 mpsca 基因构建到原核表达载体 pet-42a 中并在大肠杆菌 BL2 中诱导表达, 在实验中对 mpsca 蛋白的表达条件进行了优化, 确定了 IPTG 的浓度 诱导温度 诱导时间的最佳条件从而降低重组蛋白的合成速度, 实现 GST-mPSCA 融合蛋白在大肠杆菌中高效 可溶性表达及纯化 对纯化后的蛋白进行了 Western blot 检测, 证实纯化后的 mpsca 蛋白能与特异性抗体发生反应, 同时对纯化后蛋白进行 ELISA 检测, 结果证实该蛋白具有良好的抗原性, 且其 D 450 nm 值与抗体浓度变化呈高度线性相关, 为下一步以 PSCA 为靶点的前列腺癌免疫治疗的临床前评价中抗体水平的检测提供了理想抗原 总之,mPSCA 基因的扩增以及 mpsca 蛋白的纯化为下一步以 PSCA 为靶点的 DNA 疫苗的构建以及动物体内免疫学评价研究奠定了坚实的基础 参考文献 : [] Reiter RE, Gu Z, Watabe T, et al. Prostate stem cell antigen: A cell surface marker overexpressed in prostate cancer[j]. Proc Natl Acad Sci USA, 998, 95(4): 735-40. [2] Tran CP, Lin C, Yamashiro J, et al. Prostate stem cell antigen is a marker of late intermediate prostate epithelial cells[j]. Mol Cancer Res, 2002, (2): 3-2. [3] Sakamoto H, Yoshimura K, Saeki N, et al. Genetic variation in PSCA is associated with susceptibility to diffuse-type gastric cancer [J]. Nat Genet, 2008, 40(6): 730-40. [4] Saeki N, Gu J, Yoshida T, et al. Prostate stem cell antigen: a Jekyll and Hyde molecule[j]? Clin Cancer Res, 200, 6(4): 3533-8. [5] Hall SJ, Klotz L, Pantuck AJ, et al. Integrated safety data from 4 randomized, double-blind, controlled trials of autologous cellular immunotherapy with sipuleucel-t in patients with prostate Cancer [J]. J Urol, 20, 86(3): 877-8. [6] 韩刚, 于继云, 高江平. 以 PSCA 为靶点的前列腺癌免疫治疗的研究进展 [J]. 军医进修学院学报, 2009, 30(2): 225-6. [7] Fuessel S, Meye A, Schmitz M, et al. Vaccination of hormonerefractory prostate cancer patients with peptide cocktail-loaded dendritic cells: results of a phase I clinical trial[j]. Prostate, 2006, 66(8): 8-2. [8] Waeckerle-Men Y, Uetz-von Allmen E, Fopp M, et al. Dendritic cell-based multi-epitope immunotherapy of hormone-refractory prostate carcinoma[j]. Cancer Immunol Immunother, 2006, 55(2): 524-33. [9] Zhang X, Yu C, Zhao J, et al. Vaccination with a DNA vaccine based on human PSCA and HSP70 adjuvant enhances the antigen-specific CD8 + T-cell response and inhibits the PSCA + tumors growth in mice[j]. J Gene Med, 2007, 9(8): 75-26. [0]Garcia-Hernandez Mde L, Gray A, Hubby B, et al. Prostate stem cell antigen vaccination induces a long-term protective immune response against prostate cancer in the absence of autoimmunity[j]. Cancer Res, 2008, 68(3): 86-9. [0]Ahmad S, Casey G, Sweeney P, et al. Prostate stem cell antigen DNA vaccination breaks tolerance to self-antigen and inhibits prostate cancer growth[j]. Mol Ther, 2009, 7(6): 0-8. [2]Morgenroth A, Cartellieri M, Schmitz M, et al. Targeting of tumor cells expressing the prostate stem cell antigen (PSCA) using genetically engineered T-cells[J]. Prostate, 2007, 67(0): 2-3. [3] 任杰, 高江平, 阎瑾琦, 等. 人前列腺干细胞抗原的原核表达 纯化及鉴定 [J]. 解放军医学杂志, 200, 35(8): 986-8. ( 编辑 : 陈望忠 )