封底

广州美基生物科技有限公司 Tel: +86 20 22927158 Support:13430287051 magenbio@aliyun.com www.magentec.com.cn

HiPure Blood DNA Kits 血液等液体样品 DNA提取试剂盒 从血液等液体样品中提取 DNA

目录 简介 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 2 原理 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 2 试剂盒组成 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 3 保质期 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 5 准备工作 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 6 方案 1: 血液 DNA 小量抽提 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 7 方案 2:1ml 血液 DNA 中量提取 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 9 方案 3:2ml 血液 DNA 中量提取 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 11 方案 4:3ml 血液 DNA 中量提取 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 13 方案 5:5ml 血液 DNA 大量提取 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 15 方案 6:10ml 血液 DNA 大量提取 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 17 常见问题回答 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 19 版本 : 2010-01 第 1 页共 20 页

简介 HiPure Blood DNA Kits 为血液 血清 血浆 牛奶 唾液 或其它液体样品以及培养细胞的总 DNA 提取提供了一个简单快速的解决方案 试剂盒基于硅胶柱纯化技术, 提取过程中无需使用有毒的酚氯仿抽提, 也无需进行耗时的醇类沉淀, 整个提取过程只需 30 分钟 由于试剂盒对全血或液体样品直接裂解和消化, 因而纯化的 DNA, 包括基因组 DNA, 线粒体 DNA, 病毒 DNA( 如乙肝 ), 或其它寄生微生物的 DNA 得到的 DNA 可直接用于 PCR, Sourthern blot, 病毒 DNA 检测等实验 试剂盒 Mini Kit Midi Kit I Midi Kit II Midi Kit III Maxi Kit 96 Kit 编号 D3111 D3112 D3113 D3114 D3115 D3116 样品用量 250 µl 1 ml 2 ml 3 ml 5-10 ml 200 µl 样品类型 新鲜或冻藏全血, 血清, 血浆, 分泌物, 牛奶等液体样品, 培养细胞 结合能力 100 µg 250 µg 500 µg 500 µg 2 mg 50 µg 柱型 1.5 ml 柱 15 ml 柱 15 ml 柱 15 ml 柱 50 ml 柱 96 孔板 原理 HiPure 硅胶柱是采用高结合力的玻璃纤维滤膜为基质 滤膜在高浓度离子化剂 ( 如盐酸胍或异硫氰酸胍 ) 条件下, 可通过氢键和静电吸附核酸, 而蛋白质或其它杂质不被吸附而去除 吸附了核酸的滤膜经洗涤去除蛋白质和盐, 最后可以用低盐缓冲液 ( 如 Elution Buffer) 或水, 洗脱出滤膜上吸附的核酸 得到的核酸纯度高, 可直接用于各种下游实验 试剂盒基于硅胶柱纯化方式 血液或其它液体样品在裂解液和蛋白酶作用下裂解消化,DNA 释放到裂解液中 加入乙醇后, 转移至柱子中过滤,DNA 被吸附上柱子的膜上, 而蛋白质则不被吸附而随而滤液流出去除 柱子经 Buffer DW1 洗涤蛋白质和其它杂质, 经 Buffer DW2 洗涤去除盐分, 最后 DNA 被低盐缓冲液 (Elution Buffer) 洗脱 洗脱的 DNA 可直接用于 PCR Southern blot 病毒检测等实验 第 2 页共 20 页

组成 HiPure Blood DNA Mini Kit 产品编号 D3111-01 D3111-02 D3111-03 纯化次数 10 次 50 次 250 次 HiPure gdna Mini Columns 10 50 250 2ml Collection Tubes 20 100 5 x 100 Buffer AL 5 ml 20 ml 90 ml Buffer DW1 6 ml 30 ml 150 ml Buffer DW2* 5 ml 20 ml 2 x 50 ml Proteinase K 6 mg 30 mg 140 mg Protease Dissolve Buffer 1 ml 2 ml 10 ml Elution Buffer 5 ml 30 ml 100 ml 说明书 1 1 1 HiPure Blood DNA Midi Kit I 产品编号 D3112-01 D3112-02 D3112-03 纯化次数 2 次 10 次 50 次 HiPure gdna Midi Columns 2 10 50 15ml Collection Tubes 2 10 50 Buffer AL 3 ml 15 ml 60 ml Buffer DW1 5 ml 30 ml 120 ml Buffer DW2* 5 ml 20 ml 2 x 50 ml Proteinase K 4 mg 22 mg 110 mg Protease Dissolve Buffer 1 ml 2 ml 10 ml Elution Buffer 3 ml 20 ml 60 ml 说明书 1 1 1 *: Buffer DW2 使用前, 须按瓶子标签所示, 加入无水乙醇进行稀释 第 3 页共 20 页

组成 HiPure Blood DNA Midi Kit II 产品编号 D3113-01 D3113-02 D3113-03 纯化次数 2 次 10 次 50 次 HiPure gdna Midi Columns 2 10 50 15ml Collection Tubes 2 10 50 Buffer AL 5 ml 30 ml 120 ml Buffer DW1* 8 ml 40 ml 200 ml Buffer DW2* 5 ml 20 ml 2 x 50 ml Proteinase K 9 mg 42 mg 220 mg Protease Dissolve Buffer 1 ml 3 ml 20 ml Elution Buffer 5 ml 30 ml 100 ml 说明书 1 1 1 HiPure Blood DNA Midi Kit III 产品编号 D3114-01 D3114-02 D3114-03 纯化次数 2 次 10 次 50 次 HiPure gdna Midi Columns 2 10 50 15ml Collection Tubes 2 10 50 Buffer AL 8 ml 40 ml 180 ml Buffer DW1 8 ml 50 ml 180 ml Buffer DW2* 5 ml 20 ml 2 x 50 ml Proteinase K 14 mg 63 mg 320 mg Protease Dissolve Buffer 2 ml 5 ml 25 ml Elution Buffer 10 ml 30 ml 120 ml 说明书 1 1 1 *: Buffer DW2 使用前, 须按瓶子标签所示, 加入无水乙醇进行稀释 第 4 页共 20 页

组成 HiPure Blood DNA Maxi Kit 产品编号 D3115-01 D3115-02 D3115-03 纯化次数 2 次 10 次 50 次 HiPure gdna Maxi Columns 2 10 50 50ml Collection Tubes 2 10 50 Buffer AL 25 ml 120 ml 600 ml Buffer DW1 32 ml 180 ml 900 ml Buffer DW2* 20 ml 2 x 50 ml 3 x 200 ml Proteinase K 42 mg 210 mg 1.1 g Protease Dissolve Buffer 3 ml 15 ml 60 ml Elution Buffer 10 ml 30 ml 120 ml 说明书 1 1 1 *: Buffer DW2 使用前, 须按瓶子标签所示, 加入无水乙醇进行稀释 保质期 HiPure Blood DNA Kits 除 Proteinase K 外, 可在室温下 (15-25 ) 干燥保存 12 个月 长期保存时需置于 2-8 低温下,Buffer AL 可能会有沉淀形成, 需 55 水浴让沉淀完全溶解 Proteinase K 干粉室温运输, 收到试剂盒后请保存于 2-8 或 -20 溶解后, Proteinase K 需保存于 -20 第 5 页共 20 页

需要准备材料和工具 无水乙醇 (96-100%) 移液枪头 ( 可选 ) 50mg/ml RNase A Solution 小型离心管 (10,000 x g) 或大型桶状离心管 (5000rpm) 70 水浴锅 溶解 Proteinase K (20mg/ml): 加入适量的 Protease Dissolve Buffer 溶解 Proteinase K 至终浓度为 20mg/ml, 轻轻颠倒让蛋白酶 K 充分溶解 Proteinase K 干粉可在 2-8 保存一年, 但溶解的 Proteinase K 须分装保存于 -20 反复冻溶 Proteinase K 会影响其活性 Buffer DW2 使用前, 须按瓶子标签所示, 加入无水乙醇进行稀释 Buffer RBC( 另外订购 ), 处理附加流程时, 才需另外订购 第 6 页共 20 页

方案 1. 血液 DNA 小量提取 (D3111) 该方案适合于从 10-250µl 抗凝血液, 血清, 血浆或其它体液样品中直接提取总 DNA 该方案直接对样品进行裂解消化, 获得的总 DNA, 包括了基因组 DNA, 线粒体 DNA, 以及感染的病毒 DNA( 如乙肝 ), 寄生细菌 DNA, 以及游离 DNA(>100bp) 此外, 该方案也适合于处理其它动物的血液样品以及培养细胞 以下离心均在室温下进行 1. 在 1.5ml 离心管中, 加入 25µl Proteinase K 2. 转移 10-250µl 抗凝血液, 血清, 血浆, 牛奶, 唾液, 或其它液体样品至装有蛋白酶的离心管中 轻轻振荡混匀 若样品 <250µl, 则用 Buffer PBS 或 Elution Buffer 调整总体积至 250µl 若需要从 DNA 含量较低的样品如血清 血浆, 尿液等中提取病毒 DNA 或游离 DNA 时, 推荐加入 2µl Carrier RNA(1µg/µl) 以提高得率 注 : 由于鸟类, 鱼类等非哺乳类动物的血液红细胞是带核的, 其 DNA 含量极为丰富 一次只能处理 5-10µl 血液, 用 Buffer PBS 或 Elution Buffer 调整总体积至 250µl 处理培养细胞( 不超过 5 x 10 6 ): 400xg 离心 5 分钟收集细胞 倒弃培养液, 并加入 250µl PBS Buffer 涡旋重悬细胞, 然后按第二步进行操作 ; 3. 加入 250µl Buffer AL 至样品中 颠倒 3-5 次混匀 最高速度涡旋 30 秒混匀 70ºC 水浴 10 分钟, 其间涡旋混匀一次 注 : 由于 Buffer AL 非常粘稠, 转移时, 先在 Buffer AL 溶液中吸打几次润湿枪头以确保转移溶液的准确性 若需去除 RNA, 加入 2µl RNase Solution 至裂解液中, 室温静置 10 分钟 4. 加入 250µl 无水乙醇至样品中 涡旋 30 秒混匀 短暂离心收集管壁的液滴 5. 把 gdna 柱装在新的收集管中 转移混合液至柱子中 10,000 x g 离心 1 分钟 丢弃收集管和流出液 6. 把 DNA 柱装在新的收集管中 加入 500µl Buffer DW1 至柱子上 颠倒混匀几次 10,000 x g 离心 30-60 秒 7. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 加入 650µl Buffer DW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱子中,10,000 g 离心 30-60 秒 注意 :Buffer DW2 在使用之前, 必须用无水乙醇进行稀释 按瓶子标签指示进行稀释 第 7 页共 20 页

8. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 加入 650µl Buffer DW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱子中,10,000 g 离心 30-60 秒 9. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 10,000 g 离心 2 分钟 ; 这一步可彻底去除柱子中残留的乙醇 10. 将柱子转移至新的 1.5ml 离心管中 加入 30-100µl 预热至 70ºC Elution Buffer 或 Buffer TE 至柱子的膜中央 放置 3 分钟 10,000 g 离心 1 分钟 11. 再加入 30-100µl 预热至 70ºC Elution Buffer 或 Buffer TE 至柱子的膜中央 放置 3 分钟 10,000 g 离心 1 分钟 注 : 处理 DNA 含量很低的样品, 如血清 血浆 尿液 鼻涕等无需第二次洗脱, 最低的洗脱体积为 30µl 若纯化的 DNA 需要长期保存, 建议用 Buffer TE 来洗脱 DNA 12. 丢弃 DNA 结合柱, 把 DNA 保存 2-8, 长期保存需保存于 -20 附加方案 : 处理 0.25-1ml 的血液 DNA 抽提 ( 注 : 该方案需要另外订购 10 x Buffer RBC) 1. 转移 250-1000µl 抗凝血液样品至 15ml 离心管中 2. 加入 3 倍体积 1 x Buffer RBC 至样品中, 颠倒混匀 5 次 3. 2,000 x g 离心 5 分钟 小心倒弃上清液, 并反扣于吸水纸上吸尽残液 注 : 倒弃上清液时, 小心不要倒弃细胞沉淀 4. 加入 250µl 灭菌水和 25µl 蛋白酶 K 至白细胞沉淀团中 涡旋 30 秒打散沉淀团 5. 按第 7 页的第 3 步进行操作 第 8 页共 20 页

方案 2. 1ml 血液 DNA 中量提取 (D3112) 该方案适合于从 1ml 抗凝血液 血清 血浆 尿液 或其它体液样品中直接提取总 DNA 该方案直接对样品进行裂解消化, 获得的 DNA 包括了基因组 DNA( 如淋巴细胞 ) 线粒体 DNA 游离的 DNA(>100bp) 以及病毒 DNA( 如乙肝 ) 和微生物 DNA 若样品体积小于 1ml, 可用 Elution Buffer 调整至 1ml 1. 在 15ml 离心管中, 加入 100µl Proteinase K 2. 转移 1ml 抗凝的血液, 血清, 血浆, 牛奶, 唾液, 或其它液体样品至装有蛋白酶的离心管中, 振荡混匀 若样品小于 1ml, 用 PBS 或 Elution Buffer 调整总体积至 1ml 若需要从 DNA 含量很低的样品如血清 血浆, 尿液中提取 DNA, 加入 5µl Carrier RNA(1µg/µl) 至样品中以提高得率 3. 加入 1ml Buffer AL 至样品中 盖好盖子, 颠倒混匀 3-5 次, 最高速度涡旋 1 分钟 65 水浴 30 分钟, 其间颠倒或涡旋混匀 2-3 次 注 : 由于 Buffer AL 非常粘稠, 涡旋时须让裂解液与血液充分混匀 转移 Buffer AL 时, 先在 Buffer AL 溶液中吸打几次润湿枪头以确保转移溶液的准确性 若需去除 RNA, 加入 10µl RNase Solution 至裂解液中, 室温静置 10 分钟 4. 加入 1ml 无水乙醇至样品中 最高速度涡旋 1 分钟 短暂离心收集管壁的液滴 5. 把 DNA 中量柱装在 15ml 收集管中 转移混合液至柱子中 5,000rpm 离心 3 分钟 6. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 加入 2ml Buffer DW1 至柱子上 5,000 rpm 离心 3 分钟 7. 弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 加入 3ml Buffer DW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱子中, 5,000 rpm 离心 3 分钟 注 :Buffer GW2 在使用之前, 必须用无水乙醇进行稀释 按瓶子标签指示进行稀释 8. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 加入 3ml Buffer DW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱子中, 5,000 rpm 离心 3 分钟 9. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 5,000rpm 离心空柱 10 分钟, 以甩干柱子的基质 这一步可彻底去除柱子中残留的乙醇 第 9 页共 20 页

10. 将柱子转移至新的 15ml 灭菌的离心管 ( 自配 ) 加入 200µl 预热至 65 Elution Buffer 或 Buffer TE 至柱子的膜中央 室温放置 3 分钟 5,000 rpm 离心 3 分钟 11. 再加入 200µl 预热至 65 Elution Buffer 或 Buffer TE 至柱子的膜中央 室温放置 3 分钟 5,000 rpm 离心 3 分钟 注 :DNA 柱子最小洗脱体积是 200µl, 小于 200µl 会导致洗脱效率下降 处理 DNA 含量很低的样品, 如血清 血浆 尿液 鼻涕等无需第二次洗脱 若纯化的 DNA 需要长期保存, 建议用 Buffer TE 来洗脱 DNA 12. 丢弃 DNA 结合柱, 把 DNA 保存 2-8, 长期保存需保存于 -20 附加方案 : 处理 1-3ml 的血液 DNA 抽提 ( 注 : 该方案需要另外订购 Buffer RBC) 1. 转移 1-3ml 抗凝血液样品至 15ml 离心管中 2. 加入 3 倍体积 1 X Buffer RBC 至样品中, 颠倒混匀 5 次 3. 2,000 x g 离心 5 分钟 小心倒弃上清液, 并反扣于吸水纸上吸尽残液 注 : 倒弃上清液时, 小心不要倒弃细胞沉淀 4. 加入 1000µl 灭菌水和 100µl 蛋白酶 K 至样品中, 涡旋 30 秒打散沉淀团 5. 按第 9 页的第 3-12 步进行操作 第 10 页共 20 页

方案 3. 2ml 血液 DNA 中量提取 (D3113) 该方案适合于从 2ml 人类的抗凝血液 血清 血浆 尿液 或其它体液样品中直接提取 DNA 该方案直接对样品进行裂解消化, 获得的 DNA 包括了基因组 DNA( 如淋巴细胞 ) 线粒体 DNA 游离的 DNA 以及病毒 DNA( 如乙肝 ) 和微生物 DNA 若样品体积小于 2ml, 可用 Elution Buffer 调整至 2ml; 1. 在 15ml 离心管中, 加入 200µl Proteinase K 2. 转移 2ml 抗凝血液, 血清, 血浆, 牛奶, 唾液, 或其它体液样品至装有蛋白酶的离心管中, 振荡混匀 若样品小于 2ml, 用 PBS 或 Elution Buffer 调整总体积至 2 ml 若需要从 DNA 含量较低的样品如血清 血浆, 尿液等中提取细胞 DNA 病毒 DNA 或游离 DNA 时, 我们推荐加入 5µl Carrier RNA(1µg/µl) 至样品中以提高其回收效率 3. 加入 2.1ml Buffer AL 至样品中 盖好盖子, 颠倒混匀 3-5 次, 最高速度涡旋 1 分钟 65 水浴 30 分钟, 其间涡旋混匀 3-5 次 注 : 由于 Buffer AL 非常粘稠, 涡旋时须让裂解液与血液充分混匀 转移 Buffer AL 时, 先在 Buffer AL 溶液中吸打几次润湿枪头以确保转移溶液的准确性 若需去除 RNA, 加入 20µl RNase Solution 至裂解液中, 室温静置 10 分钟 4. 加入 2.1 ml 无水乙醇至样品中 立即于最高速度涡旋 60 秒 5. 把 DNA 中量柱 II 装在 15ml 收集管中 转移一半混合液至柱子中 5,000 rpm 离心 3 分钟 6. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 把剩余的混合液转移至柱子中 5,000 rpm 离心 3 分钟 7. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 加入 3ml Buffer DW1 至柱子上 5,000 rpm 离心 3 分钟 8. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 加入 3.5ml Buffer DW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱子中,5,000 rpm 离心 3 分钟 注 :Buffer DW2 在使用之前, 必须用无水乙醇进行稀释 按瓶子标签指示进行稀释 9. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 加入 3.5ml Buffer DW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱子中, 5,000 rpm 离心 3 分钟 第 11 页共 20 页

10. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 5,000rpm 离心空柱 15 分钟, 以甩干柱子的基质 ; 这一步可彻底去除柱子中残留的乙醇 11. 将柱子转移至新的 15ml 灭菌的离心管 ( 自配 ) 加入 400µl 预热至 65 Elution Buffer 或 Buffer TE 至柱子的膜中央 室温放置 5 分钟 5,000 rpm 离心 3 分钟 12. 再加入 400µl 预热至 65 Elution Buffer 或 Buffer TE 至柱子的膜中央 室温放置 5 分钟 5,000 rpm 离心 3 分钟 注 :DNA 柱子最小洗脱体积是 300µl, 小于 300µl 会导致洗脱效率下降 第一次洗脱可洗脱出 40-60% DNA; 二次洗脱可洗脱出 70-90% 的 DNA 处理 DNA 含量很低的样品, 如血清 血浆 尿液 鼻涕等无需第二次洗脱 若纯化的 DNA 需要长期保存, 建议用 Buffer TE 来洗脱 DNA 若需要获得最高产量, 建议进行第三次洗脱 13. 丢弃 DNA 结合柱, 把 DNA 保存 2-8, 长期保存需保存于 -20 附加方案 : 处理 2-3ml 的血液 DNA 抽提 ( 注 : 该方案需要另外订购 Buffer RBC) 1. 转移 2-3ml 抗凝血液样品至 15ml 离心管中 2. 加入 3 倍体积 Buffer RBC 至样品中, 颠倒混匀 5 次 3. 2,000 x g 离心 5 分钟 小心倒弃上清液, 并反扣于吸水纸上吸尽残液 注 : 倒弃上清液时, 小心不要倒弃细胞沉淀 4. 加入 2 ml 灭菌水和 0.2ml 蛋白酶 K, 涡旋 30 秒打散沉淀团 5. 按第 11 页的第 3-13 步进行操作 第 12 页共 20 页

方案 4. 3ml 血液 DNA 中量提取 (D3114) 该方案适合于从 3ml 人类的抗凝血液 血清 血浆 尿液 或其它体液样品中直接提取 DNA 该方案直接对样品进行裂解消化, 获得的 DNA 包括了基因组 DNA( 如淋巴细胞 ) 线粒体 DNA 游离的 DNA 以及病毒 DNA( 如乙肝 ) 和微生物 DNA 若样品体积小于 3ml, 可用 Elution Buffer 调整至 3ml; 1. 在 15ml 离心管中, 加入 300 µl Proteinase K 2. 转移 3ml 抗凝的血液, 血清, 血浆或其它体液样品至装有蛋白酶的离心管中, 振荡混匀 若样品小于 3ml, 用 PBS 或 Elution Buffer 调整总体积至 3 ml 若需要从 DNA 含量较低的样品如血清 血浆, 尿液等中提取病毒 DNA 或游离 DNA 时, 我们推荐加入 5 µl Carrier RNA(1µg/µl) 至样品中以提高其回收效率 3. 加入 3.2ml Buffer AL 至样品中 盖上盖子, 颠倒混匀 3-5 次, 然后最高速度涡旋 1 分钟 65 水浴 30 分钟, 其间涡旋混匀 3-5 次 注 : 由于 Buffer AL 非常粘稠, 涡旋时须让裂解液与血液充分混匀 转移 Buffer AL 时, 先在 Buffer AL 溶液中吸打几次润湿枪头以确保转移溶液的准确性 若需去除 RNA, 加入 30µl RNase Solution 至裂解液中, 室温静置 10 分钟 4. 加入 3.2ml 无水乙醇至样品中 立即于最高速度涡旋 1 分钟 5. 把中量柱装在 15ml 收集管中 转移 4ml 混合液至柱子中 5,000 rpm 离心 3 分钟 6. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 继续转移 4ml 混合液至柱子中 5,000rpm 离心 3 分钟 重复此步直至所有混合液都转移至柱子中过滤完毕 7. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 加入 3ml Buffer DW1 至柱子上 5,000 rpm 离心 5 分钟 8. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 加入 3.5ml Buffer DW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱子中,5,000 rpm 离心 5 分钟 注 :Buffer DW2 在使用之前, 必须用无水乙醇进行稀释 按瓶子标签指示进行稀释 9. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 加入 3.5ml Buffer DW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱子中, 5,000 rpm 离心 5 分钟 第 13 页共 20 页

10. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 5,000rpm 离心空柱 15 分钟, 以甩干柱子的基质 ; 这一步可彻底去除柱子中残留的乙醇 11. 将柱子转移至新的 15ml 灭菌的离心管 ( 自配 ) 加入 500µl 预热至 65 Elution Buffer 或 Buffer TE 至柱子的膜中央 室温放置 3 分钟 5,000 rpm 离心 5 分钟 12. 再加入 500µl 预热至 65 Elution Buffer 或 Buffer TE 至柱子的膜中央 室温放置 3 分钟 5,000 rpm 离心 5 分钟 注 :DNA 柱子最小洗脱体积是 300µl, 小于 300µl 会导致洗脱效率下降 第一次洗脱可洗脱出 30-50% DNA; 二次洗脱可洗脱出 60-80% 的 DNA 处理 DNA 含量很低的样品, 如血清 血浆 尿液 鼻涕等无需第二次洗脱 若获得的 DNA 产量还偏低, 可再重复第 12 步进行第三次洗脱 若纯化的 DNA 需要长期保存, 建议用 Buffer TE 来洗脱 DNA 若需要获得最高产量, 建议进行第三次洗脱 13. 丢弃 DNA 结合柱, 把 DNA 保存 2-8, 长期保存需保存于 -20 附加方案 : 处理 3-5ml 的血液 DNA 抽提 ( 注 : 该方案需要另外订购 Buffer RBC) 1. 转移 3-5ml 抗凝血液样品至 50ml 离心管中 2. 加入 3 倍体积 Buffer RBC 至样品中, 颠倒混匀 5 次 3. 2,000 x g 离心 5 分钟 小心倒弃上清液, 并反扣于吸水纸上吸尽残液 注 : 倒弃上清液时, 小心不要倒弃细胞沉淀 4. 加入 3 ml 灭菌水和 0.3ml 蛋白酶 K 至样品中 涡旋 30 秒打散沉淀团 5. 按第 13 页的第 3-13 步进行操作 第 14 页共 20 页

方案 5. 5ml 血液 DNA 大量提取 (D3115) 该方案适合于从 5ml 人类的抗凝血液 血清 血浆 尿液 或其它体液样品中直接提取总 DNA 该方案直接对样品进行裂解消化, 获得的 DNA 包括了基因组 DNA( 如淋巴细胞 ) 线粒体 DNA 游离的 DNA(>100bp) 以及病毒 DNA( 如乙肝 ) 和微生物 DNA 若样品体积小于 5ml, 可用 Elution Buffer 调整至 5ml; 1. 在 50ml 离心管中, 加入 500µl Proteinase K 2. 转移 5ml 抗凝的血液, 血清, 血浆或其它体液样品至蛋白酶的离心管中 轻轻振荡混匀 若血液小于 5ml, 用 PBS 或 Elution Buffer 调整总体积至 5ml 3. 加入 5.5ml Buffer AL 至样品中 盖上盖子, 颠倒 3-5 次 最高速度涡旋混匀 60 秒 65 水浴 30 分钟 其间涡旋混匀 2-3 次 注 : 由于 Buffer AL 非常粘稠, 涡旋时须让裂解液与血液充分混匀 转移 Buffer AL 时, 先在 Buffer AL 溶液中吸打几次润湿枪头以确保转移溶液的准确性 若需去除 RNA, 加入 50µl RNase Solution 至裂解液中, 室温静置 10 分钟 4. 加入 5.5ml 无水乙醇至样品中 盖上盖子, 颠倒 3-5 次 涡旋混匀 60 秒 5. 把 DNA 大量结合柱装在 50ml 收集管中 转移混合液至柱子中 3,000rpm 离心 5 分钟 6. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 加入 10ml Buffer DW1 至柱子上 3,000 rpm 离心 5 分钟 7. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 加入 15ml Buffer DW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱子中,3,000 rpm 离心 5 分钟 注 :Buffer DW2 在使用之前, 必须用无水乙醇进行稀释 按瓶子标签指示进行稀释 8. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 加入 15ml Buffer DW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱子中,3,000 rpm 离心 5 分钟 9. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 5,000rpm 离心空柱 15 分钟, 以甩干柱子的基质 ; 这一步可彻底去除柱子中残留的乙醇 ( 这一步要尽量提高离心速度以减少乙醇的残留, 但是离心速度不能超过 5000rpm) 第 15 页共 20 页

10. 将柱子转移至新的 50ml 灭菌的离心管 ( 自配 ) 加入 700µl 预热至 65 Elution Buffer 或 Buffer TE 至柱子的膜中央 室温放置 5 分钟 5,000 rpm 离心 5 分钟 11. 再加入 700µl 预热至 65 Elution Buffer 或 Buffer TE 至柱子的膜中央 室温放置 5 分钟 5,000 rpm 离心 5 分钟 注 :DNA 柱子最小洗脱体积是 700µl, 小于 700µl 会导致洗脱效率下降 处理 DNA 含量很低的样品, 如血清 血浆 尿液 鼻涕等无需第二次洗脱 若纯化的 DNA 需要长期保存, 建议用 Buffer TE 来洗脱 DNA 12. 丢弃 DNA 结合柱, 把 DNA 保存 2-8, 长期保存需保存于 -20 附加方案 : 处理 5-10ml 的血液 DNA 抽提 ( 注 : 该方案需要另外订购 Buffer RBC) 1. 转移 5-10ml 抗凝血液样品至 50ml 离心管中 2. 加入 2.5 倍体积 Buffer RBC 至样品中, 颠倒混匀 5 次 3. 2,000 x g 离心 5 分钟 小心倒弃上清液, 并反扣于吸水纸上吸尽残液 注 : 倒弃上清液时, 小心不要倒弃细胞核沉淀 4. 加入 5 ml 灭菌水和 0.5ml 蛋白酶 K 到样品中 涡旋 30 秒打散沉淀团 5. 按第 15 页的第 3 步进行操作 第 16 页共 20 页

方案 6. 10ml 血液 DNA 大量提取 (D3115) 该方案适合于从 10ml 人类的抗凝血液 血清 血浆 尿液 或其它体液样品中直接提取 DNA 该方案直接对样品进行裂解消化, 获得的 DNA 包括了基因组 DNA( 如淋巴细胞 ) 线粒体 DNA 游离的 DNA 以及病毒 DNA( 如乙肝 ) 和微生物 DNA 若样品体积小于 10ml, 可用 Elution Buffer 调整至 10ml; 1. 在 50ml 离心管中, 加入 500µl Proteinase K 2. 转移 10ml 抗凝血液, 血清, 血浆或体液样品至装有蛋白酶的离心管中, 轻轻振荡混匀 若血液小于 10ml, 用 PBS 或 Elution Buffer 调整总体积至 10ml 3. 加入 10ml Buffer AL 至样品中 盖上盖子, 颠倒几次 然后最高速度涡旋 60 秒混匀 65 水浴 30 分钟, 其间涡旋混匀 2 次 注 : 由于 Buffer AL 非常粘稠, 涡旋时须让裂解液与血液充分混匀 转移 Buffer AL 时, 先在 Buffer AL 溶液中吸打几次润湿枪头以确保转移溶液的准确性 若需去除 RNA, 加入 50µl RNase Solution 至裂解液中, 室温静置 10 分钟 4. 加入 10ml 无水乙醇至样品中 立即盖上盖子, 颠倒几次 涡旋混匀 60 秒 5. 把 DNA 大量结合柱装在收集管 转移一半混合液至柱子中 5,000rpm 离心 3 分钟 6. 倒弃流出液, 把柱子装回收集管中 把剩余混合液转移至柱子中 5,000 rpm 离心 3 分钟 7. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 加入 15ml Buffer DW1 至柱子上 5,000 rpm 离心 5 分钟 8. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 加入 15ml Buffer DW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱子中,5,000 rpm 离心 5 分钟 注 :Buffer DW2 在使用之前, 必须用无水乙醇进行稀释 按瓶子标签指示进行稀释 9. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 加入 15ml Buffer DW2( 已用乙醇稀释 ) 至柱子中, 5,000 rpm 离心 5 分钟 10. 倒弃流出液, 把柱子重新装回收集管中 5,000rpm 离心空柱 15 分钟, 以甩干柱子的基质 ; 这一步可彻底去除柱子中残留的乙醇 ( 这一步要尽量提高离心速度以减少乙醇的 第 17 页共 20 页

残留, 但是离心速度不能超过 8000rpm) 11. 将柱子转移至新的 50ml 灭菌的离心管 ( 自配 ) 加入 700µl 预热至 65 Elution Buffer 或 Buffer TE 至柱子的膜中央 室温放置 5 分钟 5,000 rpm 离心 5 分钟 12. 再加入 700µl 预热至 65 Elution Buffer 或 Buffer TE 至柱子的膜中央 室温放置 5 分钟 5,000 rpm 离心 5 分钟 注 :DNA 柱子最小洗脱体积是 700µl, 小于 700µl 会导致洗脱效率下降 第一次洗脱可洗脱出 40-60% DNA; 二次洗脱可洗脱出 70-90% 的 DNA 处理 DNA 含量很低的样品, 如血清 血浆 尿液 鼻涕等无需第二次洗脱 若纯化的 DNA 需要长期保存, 建议用 Buffer TE 来洗脱 DNA 若需获得最高产量, 建议进行第三步洗脱 13. 丢弃 DNA 结合柱, 把 DNA 保存 2-8, 长期保存需保存于 -20 第 18 页共 20 页

常见问题解答该列表可能有利于解决提取过程所碰到的问题 Magen 的技术人员也可以随时为您提供服务, 若您对试剂盒存在问题或建议, 或您在分子生物学碰到问题, 都请您联系我们 我们将竭尽所能为您排扰难解 现象 原因及解决方法 DNA 溶液带颜色 血液与 Buffer AL 混匀不充分 重新提取, 加入 Buffer AL 后立 样品裂解不充分 即颠倒混匀 3-5 次, 然后以最高速度涡旋让样品与 Buffer AL 充分混匀 重新制备 Proteinase K 使用后 Proteinase K 必须立即保存于 Proteinase K 活性下降血液放置过程有凝血块 Buffer GW2 没有按说明书加入正确体积的乙醇 -20 分装保存 Proteinase K, 避免反复冻融 Proteinase K 与 Buffer AL 不能预先混合 处理陈旧的血液样品时, 加大蛋白酶的用量, 或用附加方案进行提取按说明书或瓶子标签所示, 用适当的乙醇稀释 Buffer GW2 DNA 产量低 样品 DNA 含量低 柱子堵塞 处理无细胞的体液时可用超滤柱浓缩于 250µl 重新提取时在 Buffer AL 中加入 2µl Carrier RNA 提取得率 样品用量太多 血液与 Buffer AL 混匀不充分 重新提取, 加入 Buffer AL 后立 样品裂解不充分 Proteinase K 活性下降洗脱效率不够 Buffer GW2 中乙醇没有加入或加入量不够柱子没有空甩 即颠倒混匀 3-5 次, 然后以最高速度涡旋让样品与 Buffer AL 充分混匀 分装保存 Proteinase K, 避免反复冻融 Proteinase K 与 Buffer AL 不能预先混合 洗脱时 Elution Buffer 预热至 70, 并加到膜中央, 室温放置 3 分钟 Elution Buffer 的洗脱体积不够 进行第三步洗脱 按说明书或瓶子标签所示, 加入正确的乙醇 柱子必须空甩 2-3 分钟以去除膜上残留的乙醇 第 19 页共 20 页

OD260/OD280 比值不正常 RNA 污染 Proteinase K 活性下降加入 Buffer AL 后混匀不充分 Buffer DW2 中乙醇没有加入或加入量不够 加入 RNASE 酶消化, 或延长 RNASE 酶的消化时间重新制备 Proteinase K 使用后 Proteinase K 必须立即保存于 -20 分装保存 Proteinase K, 避免反复冻融 重新提取, 加入 Buffer AL 后立即颠倒混匀 3-5 次, 然后以最高速度涡旋让样品与 Buffer AL 充分混匀 按说明书或瓶子标签所示, 加入正确的乙醇 第 20 页共 20 页