7 4 Vol. 7 No. 4 2016 4 Journal of Food Safety and Quality Apr., 2016 4 李 楠 1 1,, 王晓洁 2*, 侯兰梅 1, 吴猛 1, 常彦红 1, 张斌 1 (1., 264025; 2., 264670) 摘要 : 目的 4 (sulfamethoxazole, SMZ) (neomycin, NEO) (enrofloxacin, EF) (florfenico, FF), 方法 4 (GA) (EDC) (UV) (SDS-PAGE), ELISA 结果 GA SMZ,, 1 10 4 ; EDC GA NEO, EDC, 1 10 4 ; EF, EDC EF, 1 10 4 ; GA FF, 1 10 5 结论 SMZ, FF, NEO EF 关键词 : ; ; ; ; ; ; Effects of different synthesis methods on the immunogenicity of 4 kinds of fishery medicine artificial antigens LI Nan 1, WANG Xiao-Jie 1, 2*, HOU Lan-Mei 1, WU Meng 1, CHANG Yan-Hong 1, ZHANG Bin 1 (1. School of Life Science, Ludong University, Yantai 264025, China; 2. Yantai Hao Qing Biotechnology Co., Ltd., Yantai 264670, China) ABSTRACT: Objective To establish artificial antigen synthesis and immunogenicity test methods of sulfamethoxazole, neomycin, enrofloxacin and florfenico, and lay the foundation of preparation of their monoclonal antibody and rapid determination of fishery medicine residues. Methods Artificial antigens of 4 kinds of fishery medicine were compounded by diazotization method, glutaraldehyde method (GA), carbodiimide method (EDC) and mixed anhydride method, respectively, and authenticated by the method of ultraviolet spectroscopy (UV) and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and then the immunogenicity was tested by indirect-elisa method. Results SMZ artificial antigen could be compounded by diazotization method and GA method, but the UV and electrophoretogram of artificial antigen compounded by diazotization method were more obvious, and the antibody titer could reach 1 10 4. NEO artificial antigen could be compounded by EDC method 基金项目 : (2012147) Fund: Supported by the Technology Development Program of Yantai City (2012147) * 通讯作者 :,,, E-mail: wxj10304@126.com *Corresponding author: WANG Xiao-Jie, Ph.D., Professor, Animal Disease Prevention and Control, Ludong University, Yantai 264025 China. E-mail: wxj10304@126.com
1536 7 and GA method, but the UV and electrophoretogram of artificial antigen compounded by EDC method were more obvious, and the antibody titer could reach 1 10 4. EF artificial antigen could be compounded by EDC method, mixed anhydride method was failed in compounding EF artificial antigen, the UV and electrophoretogram of artificial antigen compounded by EDC method were obvious, and the antibody titer can reach 1 10 4. The UV and electrophoretogram of FF artificial antigen compounded in GA method were obvious, and the antibody titer can reach 1 10 5. Conclusion Diazotization method was better for synthesis of SMZ artificial antigen, GA method was better for synthesis of FF artificial antigen, and EDC method was better for synthesis of NEO artificial antigen and EF artificial antigen. KEY WORDS: carbodiimide method; glutaraldehyde method; diazotization method; fishery medicine; bovine serum albumin; ovalbumin; enzyme-linked immunoadsordent assay 1 引言,,, [1], [2],,,,, [3,4],,, [5],,,, : ; ; ; ; ; [6] (GA) (EDC) 4 (sulfamethoxazole, SMZ) (neomycin, NEO) (enrofloxacin, EF) (florfenico, FF)4,,, 2 材料与方法 2.1 材料与试剂 2.1.1 仪器与试剂 (SMZ, ); (NEO, ); (EF, ); (FF, ); (OVA, Sigma ); (BSA, Sigma ); (GA, ); (EDTA, ); (FCA, Sigma ); (FIA, Sigma ); (TMB, Amresco ); (PEG, ); IgG(IgG-HRP, Multisciences ) TU-1810PC ( ); FC204 ( - ( ) ); TGL-16C ( ); DYY-2 ( ); DYCZ-24D ( ); LRH-150B ( ); MODEL-550 (BIO-RAD); 2.1.2 实验动物 4~6 BALB/c, 2.2 实验方法 [7,8] 2.2.1 GA 法 2.2.1.1 GA GA, 2 Schiff, 2 [9] 2.2.1.2 SMZ 12.5 mg SMZ 4 ml 20% DMF(N, N ), 200 mg BSA 15 ml 0.01mol/L PBS(pH 7.4), 2, 0.l mol/l HCl, ph 5.5, 5 ml 2.5% GA( PBS ) l h,, PBS 72 h, 8 h,, 4,, 20, BSA OVA, SMZ-OVA 2.2.1.3 NEO 40 mg NEO 10 ml PBS, 40
4, : 4 1537 μl GA, 20 min 40 mg BSA 10 ml 0.01 mol/l PBS(pH 7.4), NEO 24 h, PBS 72 h, 8 h,, 4,, 20 OVA BSA, BSA OVA, :, 4 h; 2 h, GA 25 μl, ph 6.0 2.2.1.4 FF FF 5.37 g, 1.28 g, 15 ml,, 3.0 g,,,, Rf( ) FFC, (FFA),,, FFA 25 mg FFA 2 ml DMF, 66 mg BSA 10 ml 0.01 mol/l PBS(pH 7.4), FFA BSA, 4, 100 μl GA, 24 h, PBS 72 h, 8 h,, 4,, 20, BSA OVA [10,11] 2.2.2 重氮化法 2.2.2.1 SMZ SMZ,,,, : SMZ 25.8 mg, 7 ml H 2 SO 4 (0.5 mol/l) ( ), 4 1 h ; 1 ml NaNO 2 (0.2 mol/l), 100 µl/min 4 30 min : 1 mol/l NaOH, ph 9 : 140 mg BSA, 4 ml 0.01 mol/l PBS(pH 7.4) ;, 1 mol/l NaOH PH, ph 9 4 6 h, PBS 72 h, 8 h,, 4,, 20, BSA OVA, SMZ-OVA 2.2.3 EDC 法 2.2.3.1 NEO [12,13] 80 mg NEO 5 ml 0.01 mol/lpbs(ph 7.4), 100 mg BSA 5 ml PBS, NEO BSA, EDC 160 mg 8 ml PBS, EDC, 2 h, 60 mg EDC 3 ml PBS,, 24 h, PBS 72 h, 8 h,, 4,, 20 BSA, BSA OVA, NEO-OVA 2.2.3.2 EF [14] 200 mg EF 100 mg NHS 150 mg EDC, 10 mldmf, 3 min, 24 h, ( DMF ) 100 mg BSA 6 ml 0.01 mol/ml PBS(pH 7.4), 2 ml,, 3 h, PBS 72 h, 8 h,, 4,, 20 EDC EF-OVA, BSA OVA [15] 2.2.4 混合酸酐法合成人工抗原 EF : 136 mg EF 8 ml DMF, 70 µl, 50 µl, 40 min, 228 mg BSA 10 ml 35%DMF PBS,,, 4 h, PBS 72 h, 8 h,, 4,, 20 EF-OVA, BSA OVA 2.2.5 完全抗原的鉴定方法 2.2.5.1 [7,16], BSA OVA 0.01 mol/l PBS(pH 7.4) 200 μg/ml, PBS, 200~500 nm,, 2.2.5.2 SDS-PAGE [17,18] 3%, 12%, 2 mg/ml,
1538 食品安全质量检测学报 第7卷 上样量为 20 μl, 开始时电流 10 ma 左右, 待样品进入 药, 主要用间接 ELISA 做交叉实验, 探究所得抗体与其 分离胶后, 改为 20~30 ma, 后用考马斯亮蓝染色, 再用 他药物是否有交叉反应 脱色液脱色, 直至蛋白质条带清晰 3 2.2.6 免疫原性检测 2.2.6.1 小鼠免疫[19] 选用两只健康的 4~6 周龄 BALB/c 小白鼠, 将免疫 原用灭菌的 PBS 稀释至 0.1~2 mg/ml 第 1 次免疫时, 取 等量的弗式完全佐剂与免疫原混合, 第 2 次用等量的弗 3.1 结果与分析 紫外扫描与电泳图谱 3.1.1 SMZ 人工抗原的合成 3.1.1.1 重氮化法 氏不完全佐剂与免疫原混合, 通过腹腔注射对小鼠进行 采用重氮化法合成 SMZ 人工抗原, 如图 1 所示, 免疫, 第 3 次和第 4 次直接用 PBS 稀释的免疫原进行尾 BSA 的特征吸收峰在 278 nm 处, 这是由 BSA 含有的酪 静脉注射, 第 4 次免疫后的第 6 d, 小鼠断尾取血, 37 氨酸决定的 SMZ-BSA 在 378 nm 处出现了相比于 BSA 水浴 2 h, 4 过夜后 3000 r/min 离心 5 min 取上清, 保存 和 SMZ 都没有的新吸收峰, 这与反应过程中重氮键的 备用 形成是一致的, SMZ-BSA 免疫抗原偶联成功; OVA 的特 2.2.6.2 ELISA 法检测血清效价[20] 征吸收峰在 279 nm 处, SMZ-OVA 在 356 nm 处形成了 将与 OVA 连接的偶联物作为包被原, PBS 作为空白, OVA 和 SMZ 都没有的新吸收峰, 这也与重氮键的形成 免疫前小鼠血清作为阴性对照, 进行 ELISA 效价测定, 相吻合, 说明 OVA 载体蛋白上连接了 SMZ 在图 1 的 在 450 nm 波长下用酶标仪测定各孔吸光值, 大于规定 电泳图中, SMZ-BSA 和 SMZ-OVA 的电泳条带都明显滞 的阴性对照 OD 值的 2.1 倍, 即为阳性 后于 BSA 与 OVA, 说明 BSA 和 OVA 连接上 SMZ, 分子 2.2.6.3 交叉反应 [21] 量增大, 导致电泳条带滞后, 进一步说明免疫原与包被 交叉反应选择与本种药物结构 功能相似的同系渔 Fig. 1 原均偶联成功 图 1 重氮法合成 SMZ 人工抗原紫外与电泳图谱 The UV and electrophoretogram of SMZ artificial antigen by diazotization method
第4期 3.1.1.2 李 楠, 等: 不同合成方法对 4 种渔药人工抗原免疫原性的影响 GA 法 1539 接了 SMZ 在图 2 的电泳图中, SMZ-BSA 和 SMZ-OVA 电 由图 2 可知, 在 250~280 nm 的范围内, BSA 的特征吸 泳条带均明显滞后于 BSA 与 OVA, 由于 BSA 和 OVA 连接 收峰在 278 nm 处, SMZ 的特征吸收峰在 256 nm 处, 上了 SMZ, 分子量增大, 导致条带滞后, 进一步说明免疫原 SMZ-BSA 的特征吸收峰在 274 nm 处, 相比于 BSA 和 SMZ, 与包被原均合成成功 偶联物的波形变化相对较明显, 且波形更宽, 特征吸收峰发 3.1.2 NEO 人工抗原的合成 3.1.2.1 EDC 法 生明显位移, 说明 BSA 载体蛋白上连接了 SMZ; OVA 的特 征吸收峰在 279 nm 处, SMZ-OVA 的特征吸收峰在 273 nm 如图 3 所示, BSA 的泳动速度大于 NEO-BSA, 偶联 处, SMZ-OVA 的特征吸收峰相比 OVA 和 SMZ 均发生了明 物分子量增大导致明显的滞后现象, 说明 NEO 与 BSA 显位移, 波形上具有二者的特点, 说明 OVA 载体蛋白上连 已成功偶联; OVA 的泳动速度大于 NEO-OVA, 偶联产物 Fig. 2 图 2 GA 法合成 SMZ 人工抗原紫外与电泳图谱 The UV and electrophoretogram of SMZ artificial antigen by GA method Fig. 3 图 3 EDC 法合成 NEO 人工抗原电泳图谱 The electrophoretogram of NEO artificial antigen by EDC method
1540 食品安全质量检测学报 分子量增大导致条带明显滞后于 OVA, 这说明包被原偶 联成功 3.1.2.2 第7卷 3.1.3 EF 人工抗原的合成 3.1.3.1 EDC 法 由图 5 所示, EF-BSA 在 250~300 nm 有特征吸收峰, 同 GA 法 如图 4 所示, 与 BSA 标准蛋白相比, NEO-BSA 偶联 样 BSA 在此范围内也有吸收峰, 但位置发生偏移, 这说明 物条带有明显的滞后现象, 可以判断人工抗原 偶联物中含有 BSA, 在 300~350 nm 范围内, BSA 没有吸收 NEO-BSA 合成成功; 与 OVA 标准蛋白相比, NEO-OVA 峰, 而 EF-BSA 出现特征吸收峰, 同时在此范围内 EF 也出 偶联物条带有明显的滞后现象, 可以判断人工抗原 现特征吸收峰, 说明 EF-BSA 中含有 EF, 初步说明 EF 已与 NEO-OVA 合成成功 BSA 偶联而成为完全抗原; EF-OVA 在 250~300 nm 之间出现 Fig. 4 Fig. 5 图 4 GA 法合成 NEO 人工抗原电泳图谱 The electrophoretogram of NEO artificial antigen by GA method 图 5 EDC 法合成 EF 人工抗原紫外与电泳图谱 The UV and electrophoretogram of EF artificial antigen by EDC method
4, : 4 1541, OVA, EF-OVA OVA, 300~350 nm, EF EF-OVA,, EF-OVA EF, EF OVA 5, EF-BSA EF-OVA, BSA OVA, 3.1.3.2 6, 250~300 nm, EF-BSA BSA, 300~350 nm, EF,, EF BSA ; 250~300 nm, EF-OVA OVA,, 300~350 nm EF,, EF OVA 6, BSA OVA, 3.1.4 FF 人工抗原的合成 7, 200~250 nm, FFA-BSA BSA,, BSA, 250~300 nm, FFA, BSA,,, FFA-BSA ; 200~250 nm, FFA-OVA OVA, FFA,, OVA, 250~300 nm, FFA-OVA 267 nm, FFA 269 nm, OVA 279 nm, FFA-OVA FFA, OVA,, FFA-OVA 7 FFA-BSA FFA-OVA BSA OVA,,,, 3.2 ELISA 免疫原性的测定, 2.1 1, GA SMZ P/N 2.1, 1 10 4, P/N GA ; EDC GA NEO P/N 2.1, 1 10 4, EDC P/N GA ; EDC EF P/N 2.52, 1 10 4, ; GA FF P/N 2.19, 1 10 5 Fig. 6 6 EF The UV and electrophoretogram of EF artificial antigen by mixed anhydride method
1542 第7卷 食品安全质量检测学报 Fig. 7 图 7 GA 法合成 FFA 人工抗原紫外与电泳图谱 The UV and electrophoretogram of FFA artificial antigen by GA method Table 1 表 1 间接 ELISA 法检测抗体效价 The titer of antibodies identified by indirect-elisa method SMZ 抗体 P/N(104) NEO 抗体 P/N(105) EDC 法 GA 法 2.13 0.88 重氮化法 7.54 1.33 EF 抗体 FF 抗体 P/N(104) P/N(105) P/N(104) P/N(105) 2.93 1.34 2.52 1.03 2.68 1.55 混合酸酐法 合成失败 P/N(104) P/N(105) 7.61 2.19 合成失败 交叉反应结果 SMZ OTC 无交叉反应, 与 EF CTX 有交叉反应, 原因 4 种不同抗体的交叉实验结果见表 2~表 6, 由表可 可能是 EF CTX 与 NEO 有相似的环状结构构象, 这种 知, SMZ 抗体与 EF 反应为阳性, 与 NEO OTC CTX 构象可能组成抗原决定簇或抗原决定簇的一部分, 就会 反应均为阴性, 即 SMZ 抗体与 NEO OTC CTX 均无 使 NEO 抗体与 EF CTX 发生交叉反应; EF 抗体与 CTX 交叉反应, 与 EF 有交叉反应 原因可能是 SMZ 与 EF 反应为阳性, 与 SMZ NEO OTC 反应为阴性, 即 EF 具有相似的氨基结构, 因为当抗原某区段上具有相同或 抗体与 CTX 有交叉反应, 与 SMZ NEO OTC 无交叉 相似构象时, 不同抗原具有相同或相似的抗原决定簇, 反应, 导致交叉反应的原因可能是 CTX 具有复杂的环 一种抗体能与具有相同或相似的抗原决定簇的抗原发 状结构, 合成完全抗原后与 EF 完全抗原具有相同或相 生结合, 所以会出现交叉反应; NEO 抗体与 EF CTX 反 似的抗原决定簇造成; FFA 抗体与 SMZ OTC TAP 应为阳性, 与 SMZ OTC 反应为阴性, 即 NOE 抗体与 NFLX 均没有交叉反应 3.3
4, : 4 1543 Table 2 表 2 间接 ELISA 法检测 SMZ 抗体交叉反应 Cross schemes of SMZ antibody tested by indirect-elisa method OD (N) OD (P) P/N -OVA 0.112 0.254 2.27 -OVA 0.113 0.111 0.98 -OVA 0.036 0.118 3.28 -OVA 0.033 0.052 1.58 -OVA 0.072 0.073 1.01 Table 3 表 3 间接 ELISA 法检测 NEO 抗体交叉反应 Cross schemes of NEO antibody tested by indirect-elisa method OD (N) OD (P) (P/N) -OVA 0.112 0.336 3 -OVA 0.113 0.040 0.35 -OVA 0.036 0.118 3.3 -OVA 0.033 0.048 1.5 -OVA 0.072 0.198 2.75 Table 4 表 4 间接 ELISA 法检测 EF 抗体交叉反应 Cross schemes of EF antibody tested by indirect-elisa method OD (P) OD (N) (P/N) -OVA 0.046 0.108 2.35 -OVA 0.112 0.233 2.08 -OVA 0.033 0.057 1.73 -OVA 0.113 0.113 1.00 -OVA 0.072 0.212 2.94 表 5 竞争 ELISA 检测 FFA 抗体交叉反应 (x±s, n=6) Table 5 Cross schemes of FFA antibody tested by competitive-elisa method( x ±s, n=6) (μg/ml) OD (N) - 0.06±0.006 (P) - 0.304±0.0024 0.1 0.246±0.016 * 0.1 0.303±0.012 0.1 0.298±0.013 0.1 0.302±0.011 0.1 0.299±0.011 : *, (P<0.01) 表 6 4 种不同抗体的交叉实验 Table 6 Cross schemes of 4 kinds of different antibodies SMZ NEO EF FFA SMZ + DC NEO + EF + + + FFA + OTC CTX + + TAP NFLX : + P/N 2.1, ; P/N<2.1, ; P ; N ; OTC ; CTX ; TAP ; NFLX
1544 7 4 结论, : SMZ, 1 10 4, GA, EF ; NEO EDC, 1 10 4, EF CTX ; EF EDC, 1 10 4, CTX ; FF, 1 10 5,, 4 B/B 0 80.9% 99.7% 98% 99.3% 98.4%,,, 参考文献 [1]. [J]., 2010, (9): 57 58. Liu B. The effect of the fishery drugs and misunderstanding in use [J]. China Fish, 2010, (9): 57 58. [2],,,. [J]., 2007, 378(5): 65 67. Ye JM, Yang XX, Jiang ZH, et al. The use present situation, problems and rationalization proposal of domestic fishery drugs [J]. China Fish, 2007, 378(5): 65 67. [3],,. [J]., 2013, 3(4):1 6. Yang XL, Guo WW, Sun Q. Food safety and standard use of fishery drugs on aquatic products[j]. Chin Fish Qual Stand, 2013, 3(4):1 6. [4],,,. [J]., 2004, 13(1): 60 66. Huang YP, Yang XL, Zhan J, et al. Progress on research of disease control of aquatic animals [J]. J Shanghai Fish Univ, 2004, 13(1): 60 66. [5]. [J]., 2015, (1): 74 76. Liu FR. Discussion of improving the aquatic breeding health administrative supervision mechanism [J]. China Fish, 2015, (1): 74 76. [6] 琍,,. [J]., 2008, 47(1): 10 14. Ben YL, Zhu DR, Liu LD. Design and selection of synthesis methods of artificial antigens for pesticides [J]. Agrochemica, 2008, 47(1): 10 14. [7],,,. [J]., 2010, 31(15): 225 230. Zhao PL, Zheng HT, Jiang PP, et al. Preparation of haptens by two different methods for immunoassay determination of florfenicol and their identification [J]. Food Sci, 2010, 31(15): 225 230. [8],. [M]. :, 1993. Hong XZ, Sun MQ. Protein connection technology [M]. Beijing: China Medical Science Press, 1993. [9],. [M]. :, 2004. Jiao K, Zhang SS. Enzyme-linked immunoassay technology and application [M]. Beijing: Chemical Industry Press, 2004. [10],,,. ELISA [J]., 2004, 20(2): 191 194. Zhao PC, Yuan DW, Zhu R, et al. Preparation of monoclonal antibody against sulfadiazine and development of an ELISA kit [J]. J Cell Mol Immunol, 2004, 20(2): 191 194. [11]. [D]. :, 2008. Li YY. The preparation and preliminary application of sulfamethoxazole monoclonal antibodies [D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2008. [12],. - [J]., 2007: 208 211. Liu SZ, Huang F. Development of ELISA for the detection of neomycin: preparation of anti- neomycin antibodies [J]. Food Sci Technol, 2007: 208 211. [13],,,. [J]., 2008, (12): 64 65. Liu XB, Zhang GP, Hou YZ, et al. Synthesis and identification of gentamicin artificial antigens [J]. Heilongjiang Anim Sci Vet Med, 2008, (12): 64 65. [14],,,. [J]., 2004, 37(7): 1060 1064. Cai QR, Zeng ZL, Yang GX, et al. Studies on preparation and characterization of monoclonal antibodies against enrofloxacin [J]. Sci Agric Sin, 2004, 37(7): 1060 1064. [15],. [J]., 2003, 22(06): 6 9. Zou M, Chen ZL. Synthesis and identification of difloxacin artificial antigens[j]. J Tradit Chin Vet Med, 2003, 22(06):6 9. [16],. [M] :, 2002. Wang JZ, Fan M. The technical manuals of protein [M]. Beijing: Science Press, 2002. [17],,,. [J]., 2008, 24(5): 405 408. Chen YZ, Liu AH, Liu XY, et al. Synthesis of methamphetamine-bovine serum albumin conjugates [J]. Modern Food Sci Technol, 2008, 24(5): 405 408. [18],,,. 噁 [J]., 2008, (2): 17 18. Cai HX, Hou YZ, Deng RG, et al. Preparation and identification of sulfamethoxazole artificial antigens [J]. Shanghai J Anim Husbandry Vet Med, 2008, (2): 17 18. [19]. [M]. :, 2010. Cao XT. Technology and application of immunology [M]. Beijing: Science Press, 2010. [20] Yan C, Hong T, Jian HH, et al. Indirect ELISA with recombinant GP5 for detecting antibodies to porcine reproductive and respiratory syndrome virus [J]. Virol Sin, 2011, 26(1): 61 66. [21] Zhu GN, Gui WJ, Zheng ZT, et al. Synthesis and identification of artificial antigen for lmidacloprid [J]. Agric Sci China, 2006, 5(4): 307 312. ( 责任编辑 : 姚菲 )
4, : 4 1545 作者简介 李楠, 硕士, 主要研究方向为动物病害防治 E-mail: ln168627@sina.com 王晓洁, 教授, 博士, 主要研究方向为动物病害与防治 E-mail: wxj10304@126.com 食品包装材料 专题征稿函,,,,,, (, ), 2016 8,,, 2016 6 30 E-mail 投稿方式 : : www.chinafoodj.com E-mail: jfoodsq@126.com 食品安全质量检测学报 编辑部