運用耶氏酵母菌胞外分泌系統執行降血糖機能性胜肽 GHP 之蛋白質 開發與生產 專題生 : 李至軒 指導教授 : 簡宏堅 E-mail:nightstart0615@hotmail.com 摘要所謂的 胜肽 就是小分子胺基酸鏈, 蛋白質經水解後, 轉變成由數個胺基酸組成之極小分子量物質, 一般身體分解食物中的蛋白質必須經過多種酵素的輔助才可分解吸收 胜肽是蛋白質的裂解物, 因其分子極小 ( 分子量約為 1kDa, 只有蛋白質的幾十或幾百分之一的大小 ), 可溶於水, 不會被酸分解且耐高溫, 不必經消化分解, 很容易就可以由腸吸收, 被人體的吸收率是一般蛋白質的 5 倍 近年來科學家以現代的科學方法檢驗, 證實苦瓜確有降血糖的功能 進一步的研究更發現苦瓜中有降血糖功能的成分, 以及其降血糖的原理 細胞實驗證實, 這些由白蓮苦瓜或山苦瓜分離出的三萜類化合物, 可解開發炎性細胞激素對細胞所造成的胰島素抗性, 使細胞恢復吸收葡萄糖的能力 作用類似臨床上使用的胰島素增敏劑, 因此對於改善第二型糖尿病或胰島素抗性有很大的潛力 其中有些三萜類分子還可以取代胰島素, 直接活化胰島素訊息傳遞路徑, 促進細胞對葡萄糖的吸收 我們先在 Human Tyrosine Hydroxylase (HTH) 之中, 選 5 個區段 ( 不影響蛋白活性之區段 ), 利用置換的方式將胜肽 GHPYYSIKKS 構築在 HTH 之中並在前後各加一 F(phenylala nine) 的胺基酸幫助往後被 pepsin 給分解而釋放出來 將其選殖入 Yarrowia lipolytica (Y.lipolytica) 酵母菌之胞外表現載體 pylsc1 最後將其轉形至含 82 組 Gentomycin 基因 Y.lipolytica 酵母菌染色體中進行生產關鍵字 : 胜肽 降血糖 糖尿病 GHPYYSIKKS 引言現代藥理研究證明苦瓜具有降血糖 降血脂 抗癌 抗艾滋病病毒 抑菌 抗氧化等功效 將山苦瓜萃取物的降血糖活性進行了研究, 並從中篩選出降血糖活性肽 同时通過鹼性蛋白酶 Alcalase 酶法水解红外光譜圖顯示多肽 MC2-1-5 在 500~4000 cm~(-1) 範圍具有肽的特征吸收峰 串聯質譜儀測得 MC2-1-5 的相對分子質量為 3405.5174 蛋白測定序得到 MC2-1-5 的 N 端前 10 個氨基酸殘基排列次序为 GHPYYSIKKS MC2-1-5 降糖機制是修復胰導 β 细胞, 增加肝糖原含量及提高抗氧化能力 我們已經知道,GHPYYSIKKS 胜肽具有修復胰導 β 细胞, 增加肝糖原含量及提高抗氧化能力, 從而促使血糖降低 將此胜肽 GHPYYSIKKS 置換到 Human Tyrsine Hydroxlase(HTH)
之中 之後 Transform 到 Yarrowia lipolytica 利用胞外分泌系統來做 HTH 蛋白質大量生產, 並由 Pepsin 分解從中獲得 11 套 GHPYYSIKKS 降血糖性機能胜肽 實驗流程 結果 圖 1. 在 HTH 中設計示意圖
圖 2. 利用 PCR 將胜肽 F R 斷複製出來 圖 3. 利用 overlapping 技術連接 圖 4. 利用 PCR 將連接完成的基因大量複製
圖 5. 將 inster vector 進行酵素切割 圖 6. 利用 PCR 進行篩選 圖 7. 利用酵素進行酵素切 check
圖 8. 送生技公司定序結果 圖 9. 在 pqe30 中構築之位子 圖 10. 在 pylsc-5 胞外分泌系統中插入之區域
圖 11. 轉入酵母菌示意圖 圖 12. 利用營養篩選出轉入菌株 圖 13. 利用抗生素篩選之菌株
圖 14.HTH 定序與 starch binding domain 比對 圖 15.starch binding 吸附蛋白示意圖 圖 16.SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳
圖 17. 胜肽經胃液切割位置示意圖 結論 1. 將 11 套 GHPYYSIKKS 胜肽置換到 HTH 中 2. 先完成 E.coli pqe30 系統中完成構築的動作 3. 完成 82 組 Gentomycin 送入酵母菌 5S-RNA 基因中 4. 將 82 組 Gentomycin 基因置換成 GHP-HTH 5. 利用 Starch binding 回收蛋白,HTH 蛋白大小為 54.5 kda, 因酵母菌分泌時的糖化作用會提升 10 kda, 故最後蛋白大小為 64.5 kda 未來工作 1. 在未來能將 GHP 降血糖機能性胜肽大量生產並純化 2. 通過人體試驗確認無毒無損害的物質, 並以保健食品上市並造福社會大眾 參考文獻 1. Bailey CJ, Day C, Turner SL, Leatherdale BA. Cerasee. A traditional treatment for diabetes. Studies in normal and streptozotocin diabetic mice. Diabetes Research.1985;2, 81 84. 2. Chen,D-C.,Beckerich,J-M.,and Gaillardin,C.One-step transformation of the dimorphic
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