miprofile mirna qpcr Primer Manual and Validation Report For quantitative detection of mature mirna with All-in-One mirna qrt-pcr Detection Kit Catalog number: HmiRQP9071 GeneCopoeia, Inc. 广州复能基因有限公司 地 址 广州高新技术产业开发区广州科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器D区8楼 定购热线 4006 020 200 技术支持 020-32068595 传 真 020-32052877 网 址 www.genecopoeia.com.cn www.fulengen.com E-Mail sales@fulengen.com support@fulengen.com 邮 编 510663 For Research Use Only
Primer Manual and Validation Report I. 概述 II. 产品信息 III. 推荐的配套使用试剂 IV. 产品使用流程 V. 产品应用 VI. miprofile mirna qpcr Primer 验证报告 I. 概述 microrna mirna 是一类由大约22个核苷酸组成的单链非编码小分子RNA 参与多个生理活动过 程的调控 但由于长度太短 一般难以检测 miprofile mirna qpcr Primer是特异mature mirna的qpcr检测上游引物 其需配合All-in-One mirna qrt-pcr Detection Kit 主要应用于mature-miRNA的定量检测 公司推出的miProfile mirna qpcr Primer都经过以cDNA为模板的qPCR实验验证 II. 产品信息 Catalog# Primer ID HmiRQT0001 Mature_Acc Mature_ID PCR size (bp) Positive Control cdna Mix Package Conc. Package size 10 Mix 3 rxn 储存条件: -20 C 保存 避免反复冻融 III. 推荐的配套使用试剂 GeneCopoeia All-in-One mirna qrt-pcr Detection Kit (Cat Nos. AOMD-Q020 or AOMD-Q050) IV. 产品使用流程 1. 客户收到本产品时 需在离心机上12000rpm 离心30sec 使其液体完全流到离心管底部 2. 本产品为特异mature mirna 的检测上游引物, 已用灭菌ddH2O稀释到使用浓度2µM 即为10 Primer 包装, 使用时客户仅需参考其PCR反应体系的大小 吸取一定量的本产品 使其终浓度达整个反应体系的1 量 即终浓度为0.2µM 即可 3. 使用时客户仅需参考其PCR反应体系的大小 吸取一定量的该产品引物, 使其终浓度为0.2µM即可 该产品需推荐配合All-in-One mirna qrt-pcr Detection Kit使用 具体使用方法敬请参考 miprofile mirna qpcr Primer验证报告 中Page6的 mature mirna的qpcr检测 部分 4. 产品中附有公司进行产品验证的Positive cdna Mix 模板 客户如需要, 可参考 mirna qpcr Primer 验证报告 中Page 6的 mature mirna的qpcr 检测 部分对本产品进行质检 5. 本产品需配合含SYBR Green 的qPCR 试剂使用 不一定适合探针法检测 1/9
6. 本产品中配有的Positive Control cdna Mix是采用All-in-One mirna qrt-pcr Detection Kit中特异的oligo-dT adaptor 引物进行反转录合成的, 其检测需配合miRNA qrt-pcr Detection Kit中的universal Adaptor PCR primer, 所以此cDNA不能应用于其它同类miRNA qrt-pcr Detection Kit V. 产品应用 miprofile mirna qpcr Primer为应用于mature mirna表达量检测的引物 其配合All-in-One mirna qrt-pcr Detection Kit可对mature mirna进行定性 定量的qPCR检测 VI. miprofile mirna qpcr Primer 验证报告 A 材料和方法 1. 验证实验仪器 iq5 Real Time PCR Detection System: Bio-Rad 2. 验证的实验材料及试剂 All-in-One mirna qrt-pcr Detection Kit ( Catalog Nos. AOMD-Q020 或AOMD-Q050) 验证模板 人源十个不同的组织所制备的cDNA B. 验证流程 RNA抽提 1 样品处理 取一定量的十个不同的人源组织标本至冷冻的研钵中 加入液氮研磨至细粉 最后转移至有1ml TRIzol的离心管中 反复振荡约5min 如为细胞样品 则取约106~107左右的细胞数至1ml TRIzol中 反复吹打至裂解 2 相分离 室温放置10min左右后 每1ml TRIzol 中加入氯仿为200µl 盖上盖子 剧烈振荡约1min 室温静置2 5min 然后12000g 冷冻离心15min 6 C 小心取出样品 通过观察可以发现样品分三层 其中最上层含有RNA样品 3 RNA沉淀 小心吸取上清液约450µl 每1ml TRIzol 的吸取量 至含有600µl冷冻异丙醇的新离心管中 混匀 -20 C放置约10min 12000g 冷冻离心10min 6 C 2/9
4 RNA洗涤 去上清 加入500µl冷冻的75 乙醇 弹起沉淀后 12000g 冷冻离心5min 6 C 去上清 再稍离 吸去上清液 5 RNA溶解 风干约5 10min 注意不能风太干 只需要沉淀泛白即可 加入DEPC水约30µl 贴上标签后-80 C 保存 6 RNA浓度测定 吸取1µl 抽提的RNA 用DEPC水稀释10倍后 在Nanodrop上测定RNA浓度 以DEPC水做空白对照 同时记录RNA浓度及其A 260/OD280 7 RNA电泳检测 7.1 变性胶制备 取1g Agarose + 75ml 去离子水煮沸 冷却至70 C左右加入10ml 10 Mops和15ml 甲醛及EB 倒胶至宽口梳子的胶板上 盖上盖子 7.2 电泳缓冲液配制(1 Mops) 取50ml 10 Mops 用去离子水稀释至500ml 倒入电泳槽中 再在电泳缓冲液中添加EB. 7.3 RNA样品处理 取RNA样品3µl 补充DEPC水至18µl 65 C变性10min后立即冷却 加入2µl 10 RNA loading buffer 即可电泳 7.4 RNA电泳 先把RNA胶放入电泳槽中 100V作用电泳约5min 再在点样孔中点入处理过的RNA样品 100V左右 电泳至溴酚蓝至胶的1/3处 取胶拍照 8 RNA 检测结果 3/9
8.1 十个不同组织的RNA电泳图 取各3µl RNA 样品 各泳道所对应的样品信息见下表8.2 8.2 RNA电泳的各泳道所对应的样品及其样品浓度和A260/OD280 泳道 组织 Concentration (ng/µl) OD A260/A280 1 脑 2385 1.9 2 肺 2430 1.94 3 肝 2521 1.91 4 肾 3444 1.94 5 乳腺 2785 1.87 6 睾丸 2972 1.9 7 胎盘 3515 1.91 8 脾 3344 1.91 9 心脏 3394 1.91 10 胰腺 3101 1.91 Note: 抽提的RNA必须含有小分子RNA才能进行miRNA的检测 所以所选的试剂盒必须为总RNA抽提试剂盒或小 分子RNA抽提试剂盒 同时RNA抽提的质量是进行下游实验的关键 敬请严格按照所使用的RNA抽提试剂盒要求进行抽提 抽提 结束后 敬请电泳检测RNA抽提质量 mirna 反转录反应 1. 融解miRNA反转录所需的试剂 上下轻微颠倒混匀 短暂离心后放置冰上待用 2. mirna反转录反应液的配制 在冰上的预冷RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积25µl 4/9
试剂组分 体积 终浓度 Total RNA 2 µg 2.5 U/µl Poly A Polymerase 1 µl RTase Mix 1 µl 5X Reaction Buffer 5 µl ddh2o (RNase/DNase free) 补至25µl 2.5 U 1X Note:在反应中使用的total RNA必须含有小分子RNA; Total RNA使用量可在1ng 5µg之间调整, 如使用纯化的小分子RNA 其使用量可在0.1ng 1µg之间调整 3.反转录反应 混匀配制的反应mix 短暂离心后在37 C反应60min 结束后再进行85 C 5min灭活处理 所得的反转录产物可用灭菌水稀释5倍进行下游qPCR实验 混匀配制的反应mix 短暂离 心后在37 C反应60min 结束后再进行85 C 5min灭活处理 所得的反转录产物可用灭菌水稀释5倍进行下游qPCR实验 Mature mirna 的qPCR 检测 1. 融解All-in-One mirna qrt-pcr Detection Kit中的2 All-in-One qpcr mix上下轻微颠倒混匀 短暂离心后放置冰上待用 2. 冰上进行qPCR反应液的配制 所有miRNA进行复孔测试 同时进行单孔NTC No template control 测试 试剂组分 体积 终浓度 2 All-in-One qpcr Mix 10 µl 1 miprofile mirna qpcr Primer (2 µm) 2 µl 0.2 µm Universal Adaptor PCR Primer (2 µm) 2 µl 0.2 µm 1 strand cdna (5倍稀释液) 2 µl ddh2o 4 µl Final Volume 20 µl st Note 在实验中设计了NTC No Template Control 其为阴性对照 即用水来代替模板cDNA 其它试剂不变 从而来质控是否体系有污染 实验 中如需更改反应体积 敬请保持最适条件下各组分的比例 试剂盒中的50 Rox Reference Dye 使用在需用Rox 校正的仪器 如ABI的定量PCR仪 3. 充分混匀qPCR反应液 添加至PCR反应管中 短暂离心 确保所有试剂到反应管底部 4. qpcr 反应 使用标准的三步法进行检测 以Bio-Rad 的iQ5进行实验的设计 5/9
循环数 步骤 温度 时间 检测 1 预变性 95 C 10min 否 变性 95 C 10sec 否 退火 参考结果 20sec 否 延伸 72 C 10sec 是 40 反应结束后 立即进行融解曲线分析 检测温度范围 升温速率 恒温时间 检测 66 C ~ 95 C 0.5 C/ 次 6 sec/ 次 是 30 sec 否 30 C Note 以上的反应条件主要参考的为Bio-Rad 的iQ5定量PCR仪器 如使用的为不同公司的定量PCR仪 请按照不同的仪器要求 调整qPCR反应的延伸时 间及其融解曲线分析的条件 各miRNA的退火温度可能例有差别 具体请参考测试结果部分 C.引物验证结果 1. SNORD68 (hsnrna U68 primer) 推荐退火温度为60 C 6/9
SNORD68 Amplification curve SNORD68 melting analysis curve 7/9
Electrophoresis Result in lane 17-18-19-20 (contains two positive controls and two NTC)(5 µl of the PCR of products, run on 3% agarose gel) 8/9
该产品仅限于实验科学研究用 若有任何单位或个人将该产品用于临床诊断 治疗等其他国家专门规定 的特殊用途 本公司概不承担任何责任 GeneCopoeia Products are for Research Use Only Copyright 2016 GeneCopoeia, Inc Trademarks: iq5 (Bio-Rad); GeneCopoeia, OmicsLink, All-in-One, (GeneCopoeia Inc.); Trizol (Invitrogen); NanoDrop (Thermo Scientific) AOPM1309 9/9