药敏试验的临床应用和解释 Charles W. Stratton 临床医学博士 美国范德堡大学医学院 田纳西州纳什维尔市 1
芝加哥论坛报 : 感染性流行病占据死亡主因 2
泛耐药 (PDR) 革兰氏阴性菌所致感染的报道 系列报道 6 例泛耐药革兰氏阴性菌感染病例 肺炎克雷伯氏杆菌, 鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌 对以下抗生素耐药 : 抗假单胞菌青霉素, 头孢菌素类, 碳青霉烯类, 单内酰环类, 喹诺酮类, 氨基糖苷类, 多粘菌素 6 例患者中有 4 例以粘菌素和 β- 内酰胺类抗生素治疗获得成功 3
泛耐药 (PDR) 革兰氏阴性菌 : 揭开后抗生素时代的序幕? 4
美国传染病学会关于新型抗生素研发的观点 恶细菌, 无药物 (2004) 耐药性在不断增长 抗生素种类有限, 面临 黔驴技穷 之境 政府需出台相关政策并采取行动 对国会 FDA 和 NIAID 的建议 如果没有新的政策和额外的财政支持, 治疗耐药和危险微生物的抗生素种类将日益减少, 而这些微生物正在威胁美国及全球的安全 5
美国传染病学会关于新型抗生素研发的观点 文中提出 33 项建议 对于这些建议, 制药界 FDA 及美国国会尚无相关的承诺 回应或认同态度 6
新型耐药机制引发的挑战性问题 社区获得性甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌 (CA-MRSA) 金黄色葡萄球菌对万古霉素敏感性下降 产超广谱 β- 内酰胺酶 (ESBL) 的肠杆菌科细菌 肺炎克雷伯氏菌产生的碳青霉烯酶 (KPC) β- 内酰胺类抗生素耐药的肺炎链球菌 7
社区获得性甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌 在英国 欧洲和美国出现的一株新的社区获得性甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌 可形成边界清晰的皮肤损害, 并导致坏死性肺炎 具有独特的抗菌谱 ; 仅对 β- 内酰胺类抗生素耐药 表皮可形成脓肿, 需切开引流 表皮损害可门诊治疗, 常用治疗药物为磺胺甲氧苄啶或强力霉素 8
金黄色葡萄球菌的生理学特性和耐药机制 金葡菌为人类致病菌, 并能够对一系列毒力因素或毒素进行整合 1961 年首次发现甲氧西林耐药现象, 是由可遗传 meca 基因所致, 该基因最早发现于能够移动的葡萄球菌染色体基因盒 mec (SCCmec) 上 基因分析表明, meca 基因传递给金葡菌已有 20 多年, 主要形成 5 种遗传谱系 携带 meca 基因的金葡菌株已对医院或社区环境相当适应, 产生了 2 种主要的 MRSA 类型 : 医院相关性 MRSA 社区获得性 MRSA WTA=wall teichoic acid( 胞壁磷壁酸 ); PVL=Panton- Valentine leukocidin(v 杀白细胞毒素 ); CHIP=chemotaxis inhibitory protein( 趋化抑制蛋白 ). Zetola N et al. Lancet Infect Dis. 2005;5:275-286. Deresinski S. Clin Infect Dis. 2005;40:562-573. Foster TJ. J Clin Invest. 2004;114:1693-1696. 9
社区获得性 MRSA 1990 年至今, 由于一些传统的卫生保健设施具有的高危因素, 院内 MRSA 感染现象逐渐增多 ; 而通过不断发表的关于 MRSA 爆发的报道 ( 其中包括皮肤和肺部感染的爆发 ), 我们对社区获得性 MRSA 感染的认识也在过去 20 年中逐渐得到增强 但是对于这些感染, 有哪些传统的高危因素涉及其中, 目前尚不知晓 儿童 确认为高危因素 监狱和拘留所人群 1980 Mid 1990s Late 1990s 2000 2003 底特律爆发 2/3 患者为静脉用药 1998 运动员人群 1999 美国本土人群 坏死性肺炎, 欧美地区 IVDU=intravenous drug users. Naimi TS et al. JAMA. 2003;290:2976-2984. Zetola N et al. Lancet Infect Dis. 2005;5:275-286. Levine DP et al. Ann Intern Med. 1982;97:330-338. CDC. Morb Mortal Wkly Rep. 2003;52:793-795. Groom AV et al. JAMA. 2001;286:1201-1205. Herold BC et al. JAMA. 1998;279:593-598. CDC. Morb Mortal Wkly Rep. 2001;50:919-922. Gillet Y et al. Lancet. 2002;359:753-759. CDC. Morb Mortal Wkly Rep. 1999;48:707-710. 10
金黄色葡萄球菌对万古霉素的敏感性下降 对于 MRSA 严重感染, 万古霉素仍是目前的标准疗法 以往大多数野生型金葡菌对万古霉素的 MIC 是 0.25 或 0.5 ug/ml 目前 E-test 方法检测的 MIC 多为 1 或 1.5ug/ml 已经发现 MIC 值中敏 (VISA) 或耐药 (VRSA) 的变异金葡菌株 - 对万古霉素的耐药机制涉及胞壁结构的改变和 / 或某些酶的合成 11
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糖肽耐药的转座子 屎肠球菌和粪肠球菌中, vana 及其相关基因位于一个质粒的转座子 Tn1546 上 耐药机制与一系列位于转座子上的基因 (vanhax 基因簇, vans, vanr, vanx 和 vanz) 有关 这些转座子转移到金葡菌中成为 VRSA 14
金黄色葡萄球菌对万古霉素的敏感性下降 令人关注的是, 金葡菌对万古霉素的总体 MIC 值正在升高 Wang, G., J. F. Hindler, K. W. Ward and D. A. Bruckner. 2006. 5 年中一家大学医院临床分离的金葡菌对万古霉素 MIC 值逐渐升高. J. Clin. Microbiol. 44:3883-3886. 在 2000-2004 年间, 共收集 6002 株临床分离的金葡菌菌株 平均 MIC 值自 2001 年起开始升高 70% 金葡菌目前 MIC 值为 1.0 MIC 值为 2 的金葡菌目前仍非常少见, 但这一现象能维持多久? MIC 值升高这一现象在 MSSA 菌株中较 MRSA 菌株更为常见 15
金黄色葡萄球菌对万古霉素的敏感性下降 两项研究结果表明,MIC 值达到 1 或 2 时, 万古霉素对金葡 菌感染的控制率下降 ; 而加大万古霉素的用药剂量又会增加其毒性 Sakoulas, G. et al. 2004. MIC 与万古霉素在治疗 MRSA 感染时杀菌活性之间的关系 J. Clin. Microbiol. 42:2398-2402. Soriano, A., et al. 2008. 万古霉素 MIC 对治疗 MRSA 感染的影响. CID 46:193-200. 可否这样认为, 针对万古霉素的 MIC 达到 1 时即表明耐药? 对于 MRSA 感染, 哪一类抗生素可作为万古霉素的替代药物? 16
可选择的治疗药物 2008 上市药物 利奈唑酮 (Zyvox 公司 ) 奎奴普丁 / 达福普汀 (Synercid 公司 ) 达托霉素 (Cidecin) 一种环状脂肽, 可破坏细菌的细胞膜 - 替加环素 一种甘氨酰环素, 具有蛋白抑制作用 在研药物 雷莫拉宁 ( 一种脂糖缩酚酸肽 ) 具有毒性, 可望用作局部治疗 17
超广谱 β- 内酰胺酶 (ESBLs) ESBLs 是革兰氏阴性菌产生的一种 β- 内酰胺酶, 可以使一些新型的青霉素类和头孢霉素类抗生素失活 因 MIC 值并非一直处于耐药水平, 故难以被检测到 具有重要临床意义, 因其易导致治疗失败 临床医师须知道, 怀疑 ESBL 存在时, 应当考虑换药, 常用的选择是碳青霉烯类抗生素 18
超广谱 β- 内酰胺酶 (ESBLs) 美国实验室近年来一直在大肠埃希菌 克雷伯菌和奇异变形杆菌中检测 ESBLs 令人困扰的是, 肠杆菌科的其它一些细菌中也发现了 ESBLs 一些商品化的药敏系统可发现潜在产酶菌 CLSI 目前未推荐对其它的细菌种类进行筛选或确认, 但很多专家认为有此必要 头孢泊肟对 ESBLs 非常敏感 19
ESBLs 的检测 阿莫西林 / 克拉维酸 头孢他啶 头孢他啶克拉维酸 头孢他啶 减少量 3 个稀释度 20
ESBL 感染的治疗 大部分产 ESBL 的菌株都为多重耐药 产 ESBL 菌感染的一线治疗是选择碳青霉烯类抗生素 目前已出现碳青霉烯类抗生素耐药现象 AmpC 酶和外膜蛋白缺失致肺炎克雷伯耐药 肺炎克雷伯菌产碳青霉烯酶 (New York) 替加环素和多粘菌素是目前最具杀菌活性的抗生素 近来已有多粘菌素耐药的报道 21
肺炎克雷伯杆菌产碳青霉烯酶 (KPC) 碳青霉烯酶水解范围最为广泛, 它能破坏碳青霉烯抗生素中的 β- 内酰胺环, 而其它 β- 内酰酶则很少有此功能 分为两类 金属酶 含有锌离子, 可被 EDTA 破坏 主要由革兰阳性菌, 假单胞菌和不动杆菌产生 丝氨酸碳青霉烯酶,A 类酶, 包括 KPC 活性部位含有一个丝氨酸 主要由肠杆菌, 沙雷菌和克雷伯菌产生 KPCs 可使所有 β- 内酰胺类抗生素失活 其作用活性为厄他培南 < 美罗培南 < 亚胺培南 < 多尼培南 22
产 KPC 肺炎克雷伯杆菌的泛耐药 KPC 类 β- 内酰胺酶 (K. pneumoniae carbapenemase) 对所有 β- 内酰胺类抗生素耐药! 包括所有青霉素类, 先锋霉素类, 单环 β- 内酰胺类, 复合制剂, 碳青霉烯类 可被克拉维酸抑制 ( 但并不恒定 ) Bush 分类属 2f 组 /A 类 丝氨酸碳青霉烯酶 质粒介导 质粒还通常有其他耐药机制 ( 喹诺酮, 甲氧苄氨嘧啶 / 磺胺甲基异恶唑 ) 23
KPCs: 全球性播散的潜在危险令人关注 纽约发生数次爆发流行之后, 在美国东部出现快速播散 (KPC-2 和 KPC-3) 2001 年首先由南卡罗莱纳州报道 ; 随后美国 20 个州 欧 亚 南美洲相继报道 一旦发现产 KPC 菌株, 应当立即采取控制措施 死亡率很高 ( 任何因素均可导致死亡, 最高达 47%) 采用多粘菌素 B 和 / 或替加环素 ( 可增加一种氨基糖苷类药物 ) 进行治疗 实验室应作好检测这些药物的准备 24
产 KPC 菌株 肠杆菌科 肺炎克雷伯菌 ( 最为常见 ) 产酸克雷伯菌 大肠埃希菌 肠杆菌属 弗氏柠檬酸杆菌 沙门菌属 沙雷菌属 铜绿假单胞菌 25
实验室存在的问题 自动药敏检测系统不一定能检测出亚胺培南或美罗培南耐药的临床分离菌株 ( 某些系统效果较好 ) 亚胺培南和美罗培南的 MIC 值可能会落在敏感范围 厄他培南是检测 KPC 最为敏感的药物 ( 但特异性较差 ) 常规检测板或系统并非都包括厄他培南 ESBL 检测在下述情况时可能阳性 如果 KPC 未被检测到, 而该菌株对碳青霉烯类药物敏感 对患者的治疗具有深远影响 注意 : 多尼培南是一种新的碳青霉烯类药物, 但同样可被 KPC 作用而失活 26
改良 Hodge 法 neg neg pos neg neg 1. 将大肠杆菌 ATCC 25922 涂布至平板上 (McF 0.5 的 1:10 稀释 ) 2. 将亚胺培南纸片贴到平板中央 3. 从纸片边缘向平板边缘划待测菌 4. 孵育过夜 5. 观察大肠埃希菌在待测菌周围的生长情况 - 提示有碳青霉烯类水解酶 该示意盘由 Janet Hindler 和 Jean Patel 惠赠 惠赠 48 27
两类碳青霉烯酶均可以用改良 Hodge 试验 金属 β- 内酰胺酶 B 类 β- 内酰胺酶 可由铜绿假单胞菌和不动杆菌属产生 北美少见 丝氨酸碳青霉烯酶 A 类 β- 内酰胺酶 偶尔由肠杆菌 (IMI & NMC) 和沙雷氏菌产生 (SME) 目前 KPC 的流行主要发生在肺炎克雷菌 Hodeg 试验结果阴性时, 对碳青霉烯类抗生素耐药还有哪些机制呢 ( 在美国 )? ESBL+ 孔蛋白缺失或 AmpC + 孔蛋白缺失 Anderson, KF et al. 2007. 在肠杆菌中鉴定 KPC 的方法评价 JCM 45: 2723-2725. 28
肺炎链球菌耐药现象的出现 肺炎链球菌与金葡菌一样, 都用青霉素治疗 25 年来没有耐药报道 近 15 年来, 快速出现了青霉素类耐药 继之发生了多重耐药 青霉素类耐药的机制为口腔链球菌的 DNA 转化 2008: 约 45% 临床分离的肺链菌株对青霉素类不敏感 29
肺炎链球菌青霉素结合蛋白 30
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西班牙来源的菌株 冰岛在 1988 年以前未见肺炎链球菌耐药的报道 至 1992 年, 17% 的分离菌株出现多重耐药现象 70% 的分离菌株属血清型 6B 该型耐药菌株在西班牙相当常见 为什么它们会在冰岛出现? 怎么来的? 32
西班牙来源的菌株 冰岛家庭在西班牙度假 冰岛儿童可能从西班牙儿童处获得该菌株 经常使用四环素和磺胺可能导致其选择压力 大部分耐药菌株来自雷克雅未克周边地区 25 万人群中, 雷克雅未克地区占据 57% 80%2-6 岁的患儿被送入日托中心 33
美国青霉素耐药肺炎链球菌 Percent 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Resistant (MICs >2) Intermediate (MICs 0.12-1) 1979-87 1988-89 1990-91 1992-93 1994-95 1997-98 1999-00 2001-02 2002-03 5589 487 524 799 1527 1601 1531 1940 1828 35 15 17 19 30 34 33 45 44 1980 s 1990 s 34 2000 s
多重耐药的肺炎链球菌 25 Percentage 20 15 10 5 0 1988-89 1992-93 1994-95 1997-98 1999-00 2001-02 2002-03 Year 35
氟喹诺酮的使用和肺炎球菌耐药的出现 5 4 3 2 1 0 Age 15-64y Age >65y FQ Scripts 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 Year Chen DK, et al. N Engl J Med. 1999;341(4):233-239. 6 5 4 3 2 1 0 36 Pneumococci with Reduced Susceptibility to Fluoroquinolones (%) No. of Prescriptions per 100 Persons No. of Prescriptions per 100 Persons
左氧氟沙星耐药的肺炎球菌 感染治疗失败 加拿大的 4 例患者 经验性治疗 2 例患者在治疗时出现耐药现象 2 例患者的菌株在分离之时即已耐药 Davidson et al. NEJM.346: 747-750.2002 37
香港地区多重耐药的肺炎链球菌 的氟喹诺酮耐药 14 12 Percent (%) 10 8 6 4 2 0 Ho, et al. AAC. 1999. Ho, et al. JAC. 2001. 1995 1998 2000 Year 38
结 论 新型的细菌耐药机制不断出现, 药敏试验面临着全新挑战 使用一些相对传统的方法, 很难检测到不断涌现的新型耐药机制 目前正在研发的新型抗生素极少 临床医师在这一领域应不断更新知识, 才能有效救治患者, 并与临床微生物实验室保持良好沟通 针对不断改变的致病微生物, 临床微生物实验室应当尽量提供准确 有用的药敏试验结果 39