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梁施甄富
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1 1646 南方医科大学学报 J South Med Univ 212;32(11) 基础研究细菌内毒素体外刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌一氧化氮实验模型的条件优化黄利夏鸿伦玉宁余传林张群陈娜娜雷林生南方医科大学药学院广东广州 5515 摘要目的优化细菌内毒素刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生 NO 实验模型的条件方法采用 Hank's 液灌洗小鼠腹腔收集腹腔留居巨噬细胞利用铜绿假单胞菌脂多糖作为内毒素刺激巨噬细胞产生 NO 以 Griess 法检测培养上清液中 NO 的浓度考察细胞浓度浓度刺激时长培养液体积等因素对巨噬细胞产生 NO 的影响优化实验条件并用已知药物验证模型的 96 孔板中每孔 μl 可靠性结果本实验条件下细胞浓度对 NO 的产生具有关键性影响最适浓度为 6 6 个细胞/ml 浓度<1 μg/ml 时 NO 的产生随浓度的增加而增加 P<.1 浓度>1 μg/ml 时 NO 的增加的幅度明显下降当浓度为 μg/ml 时 NO 产生达到峰值 NO 的产生随刺激时间的延长其含量相应增加 24 与 48 h 之间的增加幅度大于 48 h 与 72 h 之间的增加幅度 P<.5 培养上清中 NO 的含量与培养液的体积有一定关系 μl 时的 NO 含量最高阿司匹林(1 mmol/l) 地塞米松( μmol/l) 环孢霉素 A( μmol/l)均能明显抑制刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生 NO P<.1 结论巨噬细胞浓度浓度刺激时长是建立内毒素刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌一氧化氮实验模型的主要影响因素推 μl/孔浓度 μg/ml 刺激时长24 h或48 h 培养液体积~2 μl 荐方案为巨噬细胞浓度5 6 个细胞/ml 关键词巨噬细胞内毒素脂多糖一氧化氮实验模型中图分类号 R967 文献标志码 A 文章编号 doi:.3969/j.issn Optimization of a lipopolysaccharidestimulated nitric oxide production model in mouse peritoneal macrophages HUANG Li, XIA Hong, LUN Yuning, YU Chuanlin, ZHANG Qun, CHEN Nana, LEI Linsheng School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, Guangzhou 5515, China Abstract: Objective To optimize the experimental model of nitric oxide (NO) production in mouse peritoneal macrophages in response to lipopolysaccharides () stimulation. Methods Mouse resident peritoneal macrophages were collected by lavaging the peritoneal cavity of mice with Hank's solution and stimulated with Pseudomonas aeruginosa for NO production. NO concentration in the culture supernatants was measured with Griess Reagent. The influences of cell density, concentration, stimulation duration and culture medium volume on NO production were investigated. Finally, the feasibility of the model was confirmed with specific antiinflammatory drugs. Results The density of macrophages produced the most significant effect on NO production (P<.1), and optimal results were obtained at the macrophage density of 6 6 cells/ml with a volume of μl in each well in 96well plate. At a concentration below 1 μg/ml, NO production increased proportionally with the increment of concentration (P<.1), but the increment of NO production declined obviously at concentrations beyond 1 μg/ml, and the peak NO production occurred at a concentration of μg/ml. NO production also increased significantly with the prolongation of stimulation (P<.5), and the increments were greater within 2448 h than those in 4872 h. NO content in the culture supernatant was associated with the medium volume, and the highest level occurred in a system volume of μl. Aspirin (1 mmol/l), dexamethasone ( μmol/l), and cyclosporin A ( μmol/l) all significantly inhibited stimulated production of NO in mouse resident peritoneal macrophages (P<.1). Conclusions Macrophage density, concentration, and the duration of stimulation are the main factors affecting stimulated NO production in mouse resident peritoneal macrophages. The optimal results can be obtained with a macrophage density of 5 6 cells/ml ( μl per well), concentration of μg/ml, stimulation duration of 24 h or 48 h, and a culture medium volume of to 2 μl. Key words: macrophages; endotoxin; lipopolysaccharides; nitric oxide; experimental models 收稿日期基金项目广东省自然科学基金 S 高等学校博士学科点专项科研基金作者简介黄利在读硕士研究生电话 huangli12.6@163.com 通讯作者雷林生博士博士生导师教授电话 lls@fimmu.com 一氧化氮(NO) 是由L精氨酸胍基氮在一氧化氮合酶的催化下发生氧化而产生 NO 既是第二信使又是神经递质还是效应分子介导和调节多种生理和病理 1 过程在炎症发展的过程中 NO扮演了重要的角色有证据表明一些非甾体抗炎药和甾体抗炎药具有抑制 NO 产生的作用 24 提示抑制 NO 的产生的化合物可能

2 第 11 期黄利, 等. 细菌内毒素体外刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌一氧化氮实验模型的条件优化 1647 具有抗炎作用巨噬细胞在细菌内毒素 () 的刺激下可诱导产生 NO, 小鼠腹腔巨噬细胞是来源方便而易得的研究材料, 因此, 一般采用刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生 NO 作为筛选药物或研究药物作用机制的实验 [5] 模型但是, 该模型所诱导产生的 NO 的量受多种因素的影响, 如 : 巨噬细胞的浓度的浓度刺激时间的长短等, 如果条件掌握不好, 有时达不到实验所需要求为此, 本文对该模型的各种条件进行了探索, 为相关学者提供最优方案设计参考 1 材料 1.1 实验动物健康 SPF 级 KM 小鼠 (SCXK( 粤 )2115), 雌雄兼用,8~ 周龄, 体质量 (2±2)g, 由南方医科大学实验动物中心提供, 动物经适应性饲养 2 周, 体质量达到 3 g 以上, 用于实验 1.2 药品试剂 NO 检测试剂盒 ( 碧云天生物技术研究所 );DMEM 培养基 (GIBCO); 新生牛血清 ( 杭州四季青生物工程材料有限公司 ); 内毒素 (, 铜绿假单胞菌脂多糖, Sigma); 阿司匹林 (Sigma); 环孢霉素 A(Santa cruz); 地塞米松磷酸钠注射液 ( 广州白云山天心制药股份有限公司 ), 其他试剂均为分析纯 2 方法 2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的制备及培养取小鼠 2~4 只, 眼球放血处死,75% 酒精消毒腹部皮肤, 用外科剪剪一小口, 撕开皮肤充分暴露腹壁, 用 ml 或 5 ml 玻璃注射器 ( 一定用 9 号针头 ) 向腹腔内注入 4 m1 无菌 Hank's 液, 用手指轻揉腹壁, 然后回抽灌洗液, 离心收集细胞 (15 r/min,3 min), 集中所有腹腔渗出细胞, 计数, 根据实验要求用完全培养液 ( 全培 ) 配成相应浓度的细胞悬液 ( 观察细胞浓度影响时配成最高浓度个细胞 /ml, 然后倍比稀释成不同浓度 ; 其他实验配成 6 6 个细胞 /ml), 置于小烧杯中, 然后往 96 孔板中每孔加入上述细胞悬液 µ1, 边吹打边加入为了减少因加入细胞前后顺序不同而造成的误差, 实验分组为纵向设置, 加入细胞时按横向方向依次加入细胞置培养箱中在饱和湿度 5% CO 2 37 条件下培养 24 h, 让其充分贴壁 24 h 后, 观察到细胞有明显变形伸展现象, 细胞贴壁密度在 7%~9% 之间时, 说明细胞状态良好, 可用于下一步实验吸弃上清, 并用 37 预温的 Hank's 液清洗掉未贴壁细胞根据实验要求加入相应的试剂或药物 2.2 细胞浓度对 NO 产生影响按前述方法获得小鼠腹腔巨噬细胞后先配成最高浓度的细胞悬液个细胞 /ml, 然后依次倍比稀释, 得 4 个细胞浓度, 即 :1.2,.6,.3,.15 7 个细胞 /ml 细胞从高浓度加起, 边吹打边加入, 每个浓度做 6 个复孔 ( 刺激组与空白对照组各 3 孔 ) 按前述方法置培养箱中培养贴壁及清洗未贴壁细胞后, 刺激组每孔加 ( μg/ml) μl, 空白对照组每孔加全培 μl 加后 48 h 收集上清, 测定 NO 含量 2.3 浓度对 NO 产生影响按前述方法获得小鼠腹腔巨噬细胞后, 用全培配制成 6 6 个细胞 /ml 的细胞悬液, 每孔加 μl, 每个浓度做 3 个复孔按前述方法置培养箱中培养贴壁及清洗未贴壁细胞后, 刺激组每孔加不同浓度的全培稀释液 μl, 空白对照孔加全培 μl 终浓度分别为 μg/ml 加后 48 h 收集上清, 测定 NO 含量 2.4 刺激时间对 NO 产生影响方法同前, 小鼠腹腔巨噬细胞浓度为 6 6 个细胞 /ml, 每孔加 μl 按前述方法置培养箱中培养贴壁及清洗未贴壁细胞后进行实验, 终浓度为 μg/ml, 每个时间点做 6 个复孔 ( 刺激组与空白对照组各 3 孔 ), 分别于刺激后 h 收集培养上清, 测定 NO 含量 2.5 培养液体积对 NO 产生影响方法同前, 小鼠腹腔巨噬细胞浓度为 6 6 个细胞 /ml, 每孔加 μl 按前述方法置培养箱中培养贴壁及清洗未贴壁细胞后进行实验, 终浓度为 μg/ml, 每个培养液体积点做 6 个复孔 ( 刺激与空白对照各 3 孔 ), 体积分别为 15 2 μl, 于刺激后 48 h 取上清, 测定 NO 含量 2.6 已知阳性药物验证实验方法同前, 小鼠腹腔巨噬细胞浓度为 6 6 /ml, 每孔加 μl 按前述方法置培养箱中培养贴壁及清洗未贴壁细胞后进行实验, 终浓度为 μg/ml, 培养液体积 μl, 刺激时长 48 h, 每组设 6 个复孔阿司匹林地塞米松环孢霉素 A 终浓度分别为 : μmol/l 2.7 NO 检测严格按试剂盒说明书操作, 每孔分别加样品或标准品 5 μl 室温平衡后的 Griess Reagent Ⅰ 和 Ⅱ 试剂各 5 μl, 反应 5 min, 用酶标仪在 54 nm 波长处测定吸光度, 以 NaNO 2 标准品作为参考, 然后通过标准曲线方程换算成实际含量 (μmol/l) 2.8 统计学处理结果以均数 ± 标准差表示, 统计分析采用 SPSS13. 软件多个样本均数比较, 经方差齐性检验后进行单因素方差分析方差齐性时, 采用 LSD 方法进行组间两

3 1648 南方医科大学学报 J South Med Univ 两比较方差不齐时用Dunnett's T3 方法进行组间两两比较第 32 卷 3 结果 3.1 细胞浓度对NO产生的影响由图 1 可见小鼠腹腔巨噬细胞在的刺激下 NO 的分泌量明显增加而未经刺激的对照组细胞产生 NO 的量非常少说明在本条件下 NO 主要由诱导型一氧化氮合酶 inos 催化而产生细胞浓度对 NO的产生具有明显影响各浓度组之间的差异具有统计学意义 P<.1 细胞最适浓度为6 6个细胞/ml μl/孔细胞数再增加 NO的产生反而下降浓度 μg/ml 图2 浓度对NO产生的影响 Fig.2 Effect of concentration on NO production 细胞浓度 /ml 图1 巨噬细胞浓度对NO产生的影响在96孔板中, 每孔加入图中标注浓度的小鼠腹腔巨噬细胞悬液 μl Fig.1 Effect of macrophage density on NO production (Mean ± SD, n=3). 3.2 浓度对NO产生的影响由图 2 可见很少在的刺激下 NO 的分泌量明显增加 P<.1 当浓度在 1 μg/ml 以下时 NO 的产生随浓度的增加而增加浓度依赖关系明显各浓度组之间的差异具有统计学意义 P<.1 当浓度在 1 μg/ml 以上时 NO 的增加的幅度明显下降当浓度为 μg/ml时 NO产生达到峰值之后反而下降 3.3 刺激时长对NO产生的影响由图 3 可见很少在的刺激下 NO的分泌量明显增加 NO的产生随刺激时间的延长其含量相应增加 24 与 48 h之间的增加幅度大于48 h与72 h之间的增加幅度各时间点NO浓度之间的差异具有统计学意义 P< 培养液体积对NO产生的影响由图 4 可见很少在的刺激下 NO的分泌量明显增加培养上刺激时长 h 图3 刺激时长对NO产生的影响 Fig.3 Effect of stimulation duration on NO production 清中 NO 的含量与培养液的体积有一定关系总体上看 μl 时 NO 的含量最高但 15 2 μl 条件下上清中NO含量之间的差别不是很大因此可根据实验时加入试剂种类多少的需要选择其中之一即可 3.5 已知阳性药物对小鼠腹腔巨噬细胞NO产生的影响由表 1 可见很少在的刺激下 NO 的分泌量显著增加 P<.1 阿司匹林 1 mmol/l 地塞米松( µmol/l) 环孢霉素 A( µmol/l)均能降低诱导的小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO的水平 P<.1 P<.1 P<.1 4 讨论 NO是一种广泛存在于生物体内的重要信使分子而且还是效应分子和免疫调节分子 NO 由 L精氨酸的胍基氮在一氧化氮合酶的催化下发生氧化而产生 NO对于机体的生理或病理效应取决于产生它的环境和浓度创伤病毒细菌感染等刺激激活单核巨噬细胞

4 第 11 期黄利, 等. 细菌内毒素体外刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌一氧化氮实验模型的条件优化培养液体积 15 2 μl 图 4 培养液体积对 NO 产生的影响 Fig.4 Effect of culture medium volume on NO production 表 1 阿司匹林地塞米松环孢霉素 A 对刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生 NO 的抑制作用 Tab.1 Inhibitory effect of aspirin, dexamethasone and cyclosporin A on stimulated NO production in mouse peritoneal macrophages (Mean±SD, n=6) 组别空白对照组组阿司匹林组地塞米松组环孢霉素 A 组浓度 (µmol/lµg/ml) NO (µmol/l) 4.±.4*** 71.2± ±3.9** 33.6±2.2*** 4.6±3.4*** Dunnett's T3 检验, 与组比较,***P<.1,**P<.1 等细胞内信号传递系统, 诱导 inos 表达合成适量的 NO 是机体防御外来微生物的侵入杀菌抗炎的重要免疫因子 [6] 但当刺激因素不能及时清除, 持续生成的大量 NO 也会造成细胞毒性, 形成广泛的组织损伤 [7] 研究证明是诱导产生炎症介质的最有效刺激物, 单核巨噬细胞则是产生多种炎症介质的主要细胞当与单核细胞巨噬细胞内皮细胞等多种细胞膜上相应受体作用后, 启动胞内信号传导系统, 通过激活核转录因子 κb(nfκb), 引起 NO 等多种细胞因子和炎症介质的表达和释放 [89] 有实验表明, 能够诱导小鼠腹腔巨噬细胞 NO 分泌增加, 并呈量效时效关系 [] 巨噬细胞是机体免疫系统的重要细胞成份, 采用刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生 NO 是筛选或研究抗炎药物作用和作用机制的常用实验模型, 该实验模型具有简便快速经济等优点但是, 该实验模型的各种参数在不同文献中的报道很不一致, 为进一步探索和优化其实验条件, 本文对该方法的主要影响因素进行了分项考察, 获得了一些关键影响因素, 为优化实验方案提供了有力的参考信息巨噬细胞浓度对 NO 的产生具有明显影响, 是该模型的关键影响因素, 在本实验条件下, 最适细胞浓度为 6 6 个细胞 /ml, 每孔 μl 由于采用计数板方式进行细胞计数的误差比较大, 为了防止实际的细胞量过多或偏少, 建议实验所用理论细胞浓度为 5 6 个细胞 /ml, μl/ 孔的浓度是影响 NO 产生的另一重要因素, 实验发现, 当浓度在 1 μg/ml 以下时,NO 的产生随浓度的增加而增加, 浓度依赖关系明显 ; 当浓度在 1~ μg/ml 之间时均能得到满意的刺激活性, 在此范围内,NO 产生的量差别不是很大, 最适浓度为 μg/ml; 考虑到在配制过程中存在一定的误差, 为了保证有足够的刺激活性, 建议实验所用浓度为 μg/ml 刺激时长与 NO 产生十分密切, 鉴于细胞计数通常存在较大误差, 因此, 刺激时长可根据 24 h 后细胞贴壁密度来做相应调整, 当在显微镜下发现细胞贴壁密度在 8% 以上时, 刺激 24 h 就足够了 ; 当细胞贴壁密度在 8% 以下时, 可考虑刺激 48 h 培养上清中 NO 的含量与培养液的体积亦有一定关系, 总体上看, μl 时,NO 的含量最高, 但 15 2 μl 条件下的上清中 NO 含量之间差别并不大, 均能满足实验要求, 因此, 可根据实验时不同试剂和药物的需要选择其中之一即可在实验中发现, 相对于大肠杆菌脂多糖而言, 铜绿假单胞菌脂多糖的水溶性更好, 在生理盐水蒸馏水培养液中均能良好溶解, 配制起来更为方便, 故推荐选用铜绿假单胞菌脂多糖本文选用 KM 小鼠腹腔巨噬细胞作为实验材料是因为 KM 小鼠体型大, 获得的巨噬细胞多选用纯种小鼠 BALB/c 或 C57BL/6j 也能达到同样的目的, 只是这些小鼠体型小, 每次实验所需要的动物数量要多一些小鼠腹腔巨噬细胞的提取方法一般都是通过灌洗腹腔, 收集含巨噬细胞的灌洗液, 但具体操作也略有差异有学者先注入刺激剂 ( 如淀粉肉汤培养基液体石蜡等 ), 以产生大量的巨噬细胞进入腹腔, 同时采用打开 [11] 腹腔的方式收集灌洗液此法虽然能收集到大量的巨噬细胞, 但收集的巨噬细胞已不再是原腹腔留居巨噬细胞的功能基础, 而且还混杂有其他炎症细胞, 有时会出现血性腹水, 在一定程度上影响了巨噬细胞的纯度本实验直接用 Hank's 液灌洗小鼠腹腔, 采用 9 号针头从小鼠腹腔吸出灌洗液, 亦能得到大量的腹腔留居细胞, 一只 KM 种小鼠的腹腔用 4 ml Hank's 液分两次灌洗大约能得到 8 6 个细胞, 免去了准备和注入抗原物质的繁琐工作, 同时又避免了注入的大分子抗原物质对巨噬细胞功能的影响本文选用了阿司匹林地塞米松环孢霉素 A 三种

5 165 南方医科大学学报 (J South Med Univ) 第 32 卷不同种类的具有抗炎作用的药物对该模型进行了验证, 阿司匹林属于非甾体类抗炎药, 地塞米松属于甾体类抗炎药, 环孢霉素 A 属于免疫抑制剂结果发现, 阿司匹林地塞米松环孢霉素 A 对诱导小鼠腹腔留居巨噬细胞产生 NO 的能力均有不同程度的抑制作用, 与文 [1214] 献报道相符, 说明模型有效参考文献 : [1] Hirst DG, Robson T. Nitric oxide physiology and pathology[j]. Methods Mol Biol, 211, 74: 113. [2] KepkaLenhart D, Chen LC, Morris SM Jr. Novel actions of aspirin and Sodium salicylate: discordant effects on nitric oxide synthesis and induction of nitric oxide synthase mrna in a murine macrophage cell line[j]. J Leukoc Biol, 1996, 59(6): 846. [3] Qureshi AA, Tan X, Reis JC, et al. Inhibition of nitric oxide in stimulated macrophages of young and senescent mice by δtocotrienol and quercetin[j]. Lipids Health Dis, 211, : 239. [4] Strestíková P, Otová B, Filipec M, et al. Inhibitory effect of FK 56 and cyclosporin A on nitric oxide production by treated cultured rat macrophages[j]. Physiol Res, 2, 49(6): [5] Min HY, Kim MS, Jang DS, et al. Suppression of lipopolysaccharidestimulated inducible nitric oxide synthase (inos) expression by a novel humulene derivative in macrophage cells[j]. Int Immunopharmacol, 29, 9(78): [6] Bogdan C. Nitric oxide and the immune response[j]. Nat Immunol, 21, 2(): [7] Feihl F, Waeber B, Liaudet L. Is nitric oxide overproduction the target of choice for the management of septic shock[j]. Pharmacol Ther, 21, 91(3): [8] Ho FM, Lai CC, Huang LJ, et al. The antiinflammatory carbazole, LCY2CHO, inhibits lipopolysaccharideinduced inflammatory mediator expression through inhibition of the p38 mitogenactivated protein kinase signaling pathway in macrophages[j]. Br J Pharmacol, 24, 141(6): [9] Kim SH, Johnson VJ, Shin TY, et al. Selenium attenuates lipopolysaccharideinduced oxidative stress responses through modulation of p38 MAPK and NFkappaB signaling pathways[j]. Exp Biol Med (Maywood), 24, 229(2): [] 李小琼, 金徽, 陶凤, 等. 脂多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞 TNFα mrna, inos mrna 的表达 [J]. 遵义医学院学报, 29, 32(5): [11] 高鹏, 石磊, 张润玲. 小鼠腹腔巨噬细胞的提取与鉴别方法探讨 [J]. 中国医学检验杂志, 24, 5(5): 42. [12]Bonaterra GA, Heinrich EU, Kelber O, et al. Antiinflammatory effects of the willow bark extract STW 33I (Proaktiv( )) in activated human monocytes and differentiated macrophages [J]. Phytomedicine, 2, 17(14): [13]Qureshi AA, Tan X, Reis JC, et al. Suppression of nitric oxide induction and proinflammatory cytokines by novel proteasome inhibitors in various experimental models[j]. Lipids Health Dis, 211, : 177. [14]Yang Z, Huang XY, Zeng YY. Effects of red clover extract on the activation and proliferation of mouse T lymphocytes and the NO secretion of mouse macrophages[j]. Yao Xue Xue Bao, 28, 43 (): ( 编辑 : 吴锦雅 ) 欢迎投稿南方医科大学学报本刊不收审稿费优质的国家级基金资助论文 3 月内发表优质的全英文论文 3 月内发表 PubMed 全文收录只需登录网站注册后投稿 :

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