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栖孟
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1 第 38 卷第 2 期 20 年北京化工大学学报 ( 自然科学版 ) Journal of Beijing University of Chemical Technology ( Natural Science) Vol. 38, No 苦豆子生物碱抗菌活性的测定刘军锋摇丁摇泽摇 2 * 欧阳艳摇王摇芳摇邓摇利 (. 北京化工大学生命科学与技术学院, 北京摇 00029; 2. 新疆伊犁师范学院化学与生物科学学院, 新疆伊宁摇 ) 摘摇要 : 采用抑菌圈法测定了槐定碱苦参碱氧化苦参碱氧化槐果碱苦豆子总碱对大肠杆菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌番茄早疫番茄灰霉和辣椒炭疽的抗菌活性试验结果表明,5 种生物碱对 3 种细菌生长均具有显著的抑制作用, 其中槐定碱和苦参碱对大肠杆菌枯草芽孢杆菌和番茄早疫的抗菌效果明显优于其他 3 种生物碱, 苦参碱对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度 (MIC) 达到 2 郾 5 滋 g / ml 5 种生物碱对 3 种真菌的抗菌效果弱于对 3 种细菌的抗菌效果,5 种生物碱对 3 种真菌的 MIC 大于等于 00 滋 g / ml, 氧化苦参碱氧化槐果碱和苦豆子总碱对番茄灰霉菌的 MIC 均达 400 滋 g / ml 在质量浓度为 00 滋 g / ml 时,5 种生物碱中仅槐定碱表现出对辣椒炭疽菌的抑制作用苦豆子总碱抗菌活性影响因素的试验结果表明, 苦豆子总碱具有良好的热稳定性, 在弱碱性条件下 (ph 8 左右 ) 具有更好的抑菌活性, 在至少 2 h 内能够持续稳定的对供试菌产生抑制作用关键词 : 苦豆子 ; 生物碱 ; 抗菌活性 ; 最小抑菌浓度中图分类号 : TQ450 郾 2 引摇言随着化学药物引起的农畜产品污染和环境恶化等问题的日益突出, 高效低毒易分解无残留的生物农药的开发研究, 已受到广泛关注 [ - 3] 苦豆子 (Sophora alopecuroides) 是豆科槐属野生草本植物, 在我国西北的新疆内蒙宁夏甘肃等省区分布广泛苦豆子种子中生物碱含量较高, 约 8 郾 % ( 质量分数 ), 主要有氧化槐果碱氧化苦参碱槐定碱槐果碱苦参碱和金雀花碱等 20 余种 [4] 大量研 [5-8] 究表明, 苦豆子生物碱在抗肿瘤抗菌抗病毒抗心率失常免疫调节等方面具有重要的药理活性和应用前景, 适合开发高效低毒无残留的绿色农药辣椒和番茄是新疆种植面积广产量及出口量大的主要农产品目前, 对苦豆子总碱及单体碱在辣椒和番茄病害防治中的应用研究鲜有报道本文采用抑菌圈法测定了苦豆子生物碱提取物及其主要单体生物碱的抗菌活性及最小抑菌浓度, 收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ); 新疆自治区科技厅科技支疆冶项目 ( ) 第一作者 : 男,976 年生, 讲师 * 通讯联系人 E 鄄 mail: dengli@ mail. buct. edu. cn 并对影响苦豆子总碱抑菌效果的因素进行了研究摇实验部分郾摇材料和菌株苦豆子购自新疆伊宁市药材市场大肠杆菌 (Eschrichia coli) 金黄色葡萄球菌 ( Staphylococcu saureus) 枯草芽孢杆菌 ( Bacillus subtilis) 为北京化工大学生物实验教学中心保存菌种供试真菌番茄早疫 ( Alternaria solani) 番茄灰霉 ( Botrytis cinerea) 和辣椒炭疽 (Vermicularin capsici) 由北京市农业科学院李兴红老师惠赠郾 2 摇试剂和仪器槐定碱苦参碱氧化苦参碱氧化槐果碱, 中国药品生物制品检定所 ; 其他化学试剂均为分析纯 JY92 鄄域型超声波细胞破碎仪, 上海京工实业有限公司 ;Avanti J25 高速冷冻离心机, 美国 Beckman 公司 ;RE 鄄 52A 旋转蒸发器, 上海亚荣生化仪器厂 ; DHP20 恒温培养箱, 上海实验仪器厂有限公司 ;O 鄄 lympus 光学显微镜, 日本奥林巴斯株式会社郾 3 摇培养基牛肉膏蛋白胨培养基 : 牛肉膏 3 g / L, 蛋白胨 0 g / L,NaCl 5 g / L, 琼脂 20 g / L; 马铃薯培养基 : 马铃薯 200 g / L, 蔗糖 20 g / L, 琼脂 20 g / L 郾 4 摇苦豆子总碱的提取参考文献 [9] 的稀盐酸浸提法将苦豆子干燥

2 第 2 期摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇刘军锋等 : 苦豆子生物碱抗菌活性的测定 85 后粉碎, 用 4 目筛子筛取苦豆子粉末 500 g, 加 5000 ml 去离子水, 调节 ph 至 3 郾 0, 置入微波提取仪中提取合并浸提液离心, 用 SP825 型大孔树脂吸附纯化, 减压浓缩, 旋转蒸发, 得苦豆子总碱粗品用超纯水配制 mg / ml 的苦豆子总生物碱稀释液, 放入 4 益冰箱待用郾 5 摇菌悬液的制备将活化培养好的菌液分别接入无菌生理盐水中, 依次进行梯度稀释, 使菌悬液中细菌数为 ( ~ 2) 伊 0 8 ml - 真菌孢子数为( ~ 8) 伊 0 6 ml - 郾 6 摇生物碱抗菌活性的测定分别取 0 郾 2 ml 各种菌悬液加入已制备好的培养基平板中, 均匀涂布将灭菌的直径 6 mm 的滤纸片分别浸入配制好的生物碱溶液中, 然后将浸透并晾干的滤纸片置于涂布接种的平板分区内, 以生理盐水浸透的滤纸片作为空白对照细菌于 37 益恒温培养 24 h, 真菌 30 益培养 48 h, 测定各处理及对照菌落抑菌圈直径每个处理重复 3 次, 计算其平均值和标准差最小抑菌浓度以培养基平板上不长菌时的最低生物碱浓度为准 2 摇结果与讨论 2 郾摇不同生物碱的抗菌作用比较抑菌圈法测定 00 滋 g / ml 不同生物碱的抗菌效果如表所示总体来看,5 种生物碱对供试细菌的抑制效果优于真菌与同质量浓度的氧化苦参碱氧化槐果碱和苦豆子总碱相比较, 苦参碱和槐定碱的抑菌效果更明显, 尤其是对大肠杆菌枯草芽孢杆菌和番茄早疫的抑菌效果更显著试验所用 5 种苦豆子生物碱对番茄灰霉菌均无抑制作用, 可能是 [0] 生物碱浓度 (00 滋 g / ml) 过低所致相关研究从电子结构的角度分析表明, 氧化苦参碱的药理活性高于苦参碱, 而本试验中还原型生物碱的抑菌效果 [] 则优于氧化型生物碱, 袁静等的研究结果也表明, 苦参碱的杀虫活性高于氧化苦参碱从电子结构的角度分析药理活性可能还需要试验的验证, 另推测苦参碱的生物活性可能在不同的试验对象上有所差异, 这个问题值得进一步研究和探讨 Table 摇表摇不同生物碱对试验菌的抑制作用 Inhibitory effects of different alkaloids on the growth of trial microorganisms 菌种抑菌圈直径 / mm 槐定碱苦参碱氧化苦参碱氧化槐果碱苦豆子总碱大肠杆菌 2 郾 5 依 0 郾 5 2 郾 8 依 0 郾 2 郾 6 依 0 郾 7 郾 8 依 0 郾 2 0 郾 6 依 0 郾 5 金黄色葡萄球菌依 0 郾 7 郾 6 依 0 郾 2 依 0 郾 5 郾 2 依 0 郾 2 0 依 0 郾 2 枯草芽孢杆菌 2 郾 5 依 0 郾 25 3 郾 6 依 0 郾 3 依 0 郾 7 0 依 0 郾 2 依 0 郾 5 番茄早疫 0 郾 2 依 0 郾 5 0 郾 5 依 0 郾 7 辣椒炭疽 0 依 0 郾 2 番茄灰霉摇摇冶为没有抑菌圈摇摇与单体生物碱比较来看, 苦豆子总碱对供试菌的总体抑制效果较弱, 这可能与苦豆子总碱中主要活性成分的浓度和纯度较低有关 2 郾 2 摇最小抑菌浓度将试验所用生物碱分别稀释成郾 5 和 6 郾 25 滋 g / ml 的系列溶液, 分别加入供试菌菌悬液, 制成培养基平板, 以无菌生长平皿的最低药物浓度定为最小抑菌浓度 (MIC), 结果如表 2 所示从表 2 可以看出, 试验所用 5 种生物碱对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均有较强的抑制作用, 尤其苦参碱对上述两种细菌的 MIC 达到 2 郾 5 滋 g / ml 摇摇表 2 摇不同生物碱对试验菌的 MIC 测定 Table 2 摇 Minimum inhibitory concentration of different alkaloids on the growth of trial microorganisms 最小抑菌浓度 / 滋 g ml - 菌种氧化苦氧化槐苦豆子槐定碱苦参碱参碱果碱总碱大肠杆菌 2 郾 5 2 郾金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌 25 2 郾番茄早疫辣椒炭疽番茄灰霉

3 86 北京化工大学学报 ( 自然科学版 ) 摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇 20 年 5 种生物碱对供试真菌的抑菌效果弱于对细菌的抑菌效果, 除槐定碱对番茄早疫和辣椒炭疽以及苦参碱对番茄早疫的 MIC 为 00 滋 g / ml 外, 氧化苦参碱氧化槐果碱和苦豆子总碱对番茄早疫和辣椒炭疽的 MIC 均达 200 滋 g / ml, 对番茄灰霉的 MIC 达 400 滋 g / ml 虽然氧化苦参碱对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的 MIC 都是 25 滋 g / ml, 但在氧化苦参碱浓度为 2 郾 5 滋 g / ml 时, 大肠杆菌的生长明显比枯草芽孢杆菌旺盛, 这说明氧化苦参碱对枯草芽孢杆菌的抑制效果更好苦豆子总碱对细菌确有较强的抗菌活性, 对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的 MIC 均为 25 滋 g / ml, 对金黄色葡萄球菌的 MIC 为 50 滋 g / ml, 而对番茄早疫菌和辣椒炭疽菌的 MIC 为 200 滋 g / ml, 对番茄灰霉的 MIC 达 400 滋 g / ml 这表明, 由于抗菌有效成分浓度和纯度较低, 需用较高浓度的苦豆子总碱才能对 [2] 蔬菜病原真菌起到较好的抑菌效果冯俊涛等使用 0 郾 g / ml( 质量浓度 ) 的苦豆子丙酮提取物, 对 [6] 番茄灰霉菌的抑制率达 96 郾 6%, 李瑞等的研究结果也支持上述结论 2 郾 3 摇影响苦豆子总碱抗菌活性的因素 2 郾 3 郾摇 ph 分别选择枯草芽孢杆菌和辣椒炭疽菌为代表菌, 考察 ph 对苦豆子总碱 (500 滋 g / ml) 抗菌活性的影响, 结果如表 3 所示在 ph 4 ~ 0 范围内, 苦豆子总碱的抗菌活性呈现出有规律的变化, 苦豆子总碱在弱碱性条件下 ( ph 8 左右 ) 表现出最佳抗菌效果同样,pH 对苦豆子总碱抑制辣椒炭疽菌生长的影响非常明显 : 只有 ph 在中性和弱碱性时, 抑菌作用才有所体现 ; 在酸性和强碱条件下, 抑菌圈消失 Table 3 摇表 3 摇 ph 对苦豆子总碱抑菌活性的影响 Effect of ph on the antibacterial activity of total alkaloids in Sophora alopecuroides 菌种抑菌圈直径 / mm ph 4 ph 5 ph 6 ph 7 ph 8 ph 9 ph 0 枯草芽孢杆菌 9 郾 5 依 0 郾 5 0 郾 3 依 0 郾 2 郾 5 依 0 郾 25 2 郾 6 依 0 郾 3 郾 9 依 0 郾 2 0 郾 8 依 0 郾 5 辣椒炭疽 9 郾 3 依 0 郾 5 0 依 0 郾 2 9 郾 5 依 0 郾 2 摇摇分析 ph 对苦豆子总碱抗菌活性的影响, 可能与 ph 影响菌体细胞膜的稳定性膜表面蛋白活性及菌体对营养物质的吸收有关苦豆子总碱在弱碱性 (ph 8) 条件下抗菌效果最佳, 推测与苦豆子总碱的碱性性质和供试菌种生长的最适 ph 有关 ( ph 7 左右 ) 2 郾 3 郾 2 摇加热处理将灭菌的滤纸片放入 500 滋 g / ml 苦豆子总碱液浸泡并分别置于益的水浴中加热处理 2 h, 以枯草芽孢杆菌和辣椒炭疽菌为代表菌, 分别测定抑菌圈大小, 比较不同温度下加热处理对苦豆子总碱抑菌活性的影响, 结果如图所示从图可以看出, 随着处理温度的升高, 苦豆子总碱对两种供试菌的抑菌效果逐步提高结果表明, 苦豆子总碱具有较好的热稳定性, 可以在较高温度条件下稳定的发挥抗菌作用推测苦豆子总碱的热稳定性与其各单体碱的理化性质有关 2 郾 3 郾 3 摇作用时间以枯草芽孢杆菌和辣椒炭疽菌为代表菌, 使用 500 滋 g / ml 苦豆子总碱作用于以上两种供试菌, 然后测定不同作用时间对苦豆子总碱抗菌活性的影 Fig. 摇图摇加热处理对苦豆子总碱抑菌活性的影响 Effect of heat treatment on the antibacterial activity of total alkaloids in Sophora alopecuroides 响, 结果如图 2 所示从图 2 中可以看出, 在相同的作用时间, 苦豆子总碱对枯草芽孢杆菌的抗菌效果明显优于辣椒炭疽菌同时, 随着苦豆子总碱对供试菌作用时间的延长, 苦豆子总碱的抑菌效果也逐步提高虽然本试验没有测定更长作用时间的抑菌效果, 但结合相 [6,] 关研究结果, 苦豆子总碱能够在较长一段时间内持续稳定的发挥抗菌作用苦豆子总碱的抗菌稳定性为其在农业病虫害防治方面的应用提供了重

4 第 2 期摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇刘军锋等 : 苦豆子生物碱抗菌活性的测定 87 bei Agricultural Science, 2008, 2 ( 3 ): ( in Chinese) [4] 摇李艳艳, 冯俊涛, 张兴, 等. 苦豆子化学成分及其生物活性研究进展 [ J]. 西北农业学报, 2005, 4(2): Li Y Y, Feng J T, Zhang X, et al. Advance in research of chemical ingredients from Sophora alopecuroides L. and its bioactivities [ J]. Acta Agriculturae Boreali 鄄 occiden 鄄 talis Sinica, 2005, 4(2): ( in Chinese) [5] 摇周娅, 杨志伟, 赵建宁, 等. 苦豆子总碱的体外抗菌图 2 摇作用时间对苦豆子总碱抑菌活性的影响活性研究 [ J]. 宁夏医学院学报, 2000, 22 (2): 79 - Fig. 2 摇 Effect of acting time on the antibacterial activity of total alkaloids in Sophora alopecuroides 8. Zhou Y, Yang Z W, Zhao J N, et al. A study on anti 鄄要依据 bacte rial activity of total alkaloids of Sophora alopecu 鄄 3 摇结论苦豆子生物碱对供试细菌的抑制效果优于供试真菌其中, 槐定碱和苦参碱对大肠杆菌枯草芽孢杆菌和番茄早疫菌的抗菌效果明显优于其他 3 种生物碱, 苦参碱对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度 (MIC) 达到 2 郾 5 滋 g / ml 试验所用 5 种生物碱对 3 种真菌的 MIC 大于等于 00 滋 g / ml, 氧化苦参碱氧化槐果碱和苦豆子总碱对番茄灰霉菌的 MIC 均达 400 滋 g / ml 在质量浓度为 00 滋 g / ml 时,5 种生物碱中仅槐定碱表现出对辣椒炭疽菌的抑制作用苦豆子总碱具有良好的热稳定性, 在弱碱性条件下 (ph 8 左右 ) 能更好地发挥其抑菌作用, 并且能够在较长时间内持续稳定的对供试菌产生抑制作用参考文献 : [] 摇邱德文. 我国生物农药现状分析与发展趋势 [ J]. 植物保护, 2007, 33(5): Qiu D W. Current situation and prospects of bio 鄄 pesti 鄄 cides in China[ J]. Plant Protection, 2007, 33(5): (in Chinese) [2] 摇金轶伟, 柴一秋, 厉晓腊, 等. 生物农药的应用现状及其前景 [J]. 河北农业科学, 2008, 2(6): Jin Y W, Chai Y Q, Li X L, et al. Application status and prospect of biopesticide[ J]. Journal of Hebei Agri 鄄 cultural Sciences, 2008, 2(6): ( in Chinese) [3] 摇田志环. 我国生物农药发展现状及对策 [ J]. 河北农业科学, 2008, 2(3): Tian Z H. The current status and countermeasures on de 鄄 velopment of bio 鄄 pesticides in China[ J]. Journal of He 鄄 roides in vitro[ J]. Journal of Ningxia Medical College, 2000, 22(2): ( in Chinese) [6] 摇李端, 周立刚, 王敬国, 等. 苦豆子提取物对黄瓜和番茄病原菌的抑制作用 [J]. 西北植物学报, 2006, 26 (3): Li D, Zhou L G, Wang J G, et al. Inhibitory effects of Sophora alopecuroides extract to pathogens on cucumber and tomato [J]. Acta Botany Boreali 鄄 occidentalia Sinica, 2006, 26(3): ( in Chinese) [7] 摇侯东耀, 田平芳, 谭天伟. 四种中药提取物对蔬菜病原真菌的抑制作用 [ J]. 北方园艺, 2008 (2): Hou D Y, Tian P F, Tan T W. Fungistasis of 4 kinds of Chinese Herb extracts to vegetable pathogenic [ J ]. Northern Horticulture, 2008 ( 2 ): ( in Chi 鄄 nese) [8] 摇李弟灶, 潘显道, 吴松. 苦参碱类生物碱研究进展 [J]. 医学研究通讯, 2005, 34(): Li D Z, Pan X D, Wu S. Advance in research of Alka 鄄 loids from Sophora alopecuroides [ J]. Bulletin Medicine Research, 2005, 34(): ( in Chinese) [9] 摇张为民, 蒲鹏, 张德刚, 等. 从苦豆子种子中提取生物碱的方法研究 [J]. 中国农学通报, 2005, 2(2): 7-9. Zhang W M, Pu P, Zhang D G, et al. Studies on extrac 鄄 tion of alkaloids in seeds of Sophora alopecuroides L. [ J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2005, 2 (2): 7-9. (in Chinese) [0] 赵宝中, 荣大奇, 王秀军. 苦参碱和氧化苦参碱电子结构与药性的关系 [ J]. 分子科学学报, 2000, 6 (2): Zhao B Z, Rong D Q, Wang X J. Relationship of activity with electron structure for matrine and oxymatrine [ J].

5 88 北京化工大学学报 ( 自然科学版 ) 摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇 20 年 Journal of Molecular Science, 2000, 6(2): ( in Chinese) [] 袁静, 吕良忠, 丛斌, 等. 苦参生物碱杀虫生物活性测定 [J]. 农药, 2004, 43(6): Yuan J, Lv L Z, Cong B, et al. Biological activity of al 鄄 kaloids from Sophora flavescens ait to pests [ J]. Chinese Journal of Pesiticides, 2004, 43(6): (in Chi 鄄 nese) [2] 冯俊涛, 祝木金, 于平儒, 等. 西北地区植物源杀菌剂初步筛选 [J]. 西北农林科技大学学报 : 自然科学版, 2002, 30(6): Feng J T, Zhu M J, Yu P R, et al. Screening on the re 鄄 sources of botanical fungicides in Northwest China [ J]. Journal of Northwest Sci 鄄 Tech University of Agriculture and Forestry: National Science, 2002, 30 ( 6 ): (in Chinese) Antimicrobial activity of Sophora alopecuroides alkaloids LIU JunFeng 摇 DING Ze 摇 OUYANG Yan 2 摇 WANG Fang 摇 DENG Li (. College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 00029; 2. College of Chemical and Life Science, Yili Normal University, Yili Xinjiang , China) Abstract: The biological activity of sophoridine, matrine, oxymatrine, oxysophocarpine and total alkaloids from So 鄄 phora alopecuroides against Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Alternaria solani, Botrytis ci 鄄 nerea and Vermicularia capsici have been tested using the inhibition zone method. The results showed that all the al 鄄 kaloids exhibited excellent inhibitory activities against the three types of bacteria. The inhibitory effects of sophori 鄄 dine and matrine against Escherichia coli, Bacillus subtilis and Alternaria solani were greater than that of the other alkaloids. The minimum inhibitory concentration ( MIC) of matrine with Escherichia coli and Bacillus subtilis was 2 郾 5 滋 g / ml. Fungistasis of the five types of alkaloids with the three types of vegetable pathogenic fungi had lower activities than that in the case of the three types of bacteria. The MIC of the five types of alkaloids for the three types of fungi were all 逸 00 滋 g / ml, and the MIC of oxymatrine, oxysophocarpine and Sophora alopecuroides total alkaloids for Botrytis cinerea reached 400 滋 g / ml. At a concentration of 00 滋 g / ml, only sophoridine showed an in 鄄 hibitory effect against Alternaria solani. The total alkaloids from Sophora alopecuroides showed good thermal stability and optimum antibacterial activity under weakly alkaline conditions ( about ph 8), and showed a sustained and steady inhibitory effect on trial bacteria within 2 hours. Key words: Sophora alopecuroides; alkaloids; antimicrobial activity; minimum inhibitory concentration ( MIC)

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第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析第卷第期年月食品与生物技术学报响应面优化绿色木霉菌培养基黄雪莲于新仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州利用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化通过测量不同营养条件下绿色木霉菌落生长直径研究其生物学特性在单因素实验的基础上选定葡萄糖添加量丙氨酸添加量和磷酸二氢钾添加量个因素进行中心组合实验建立二次回归方程并应用响应面分析法进行优化结果表明绿色木霉菌最佳培养基为葡萄糖