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1 食品中動物用藥殘留量檢驗方法 - 胺基醣苷類抗生素之檢驗 ( 二 ) 修正總說明 為加強食品中動物用藥殘留之管理, 並依據食品安全衛生管理法第三十八條規定 : 各級主管機關執行食品 食品添加物 食品器具 食品容器或包裝及食品用洗潔劑之檢驗, 其檢驗方法, 經食品檢驗方法諮議會諮議, 由中央主管機關定之, 爰擬具 食品中動物用藥殘留量檢驗方法 - 胺基醣苷類抗生素之檢驗 ( 二 ), 其修正要點如下 : 一 修正 移動相溶液 B 之配置溶劑 二 修正 移動相溶液 之梯度條件
2 食品中動物用藥殘留量檢驗方法 - 胺基醣苷類抗生素之檢驗 ( 二 ) 修正對照表修正規定現行規定說明 1. 適用範圍 : 本檢驗方法適用於蜂蜜及乳汁中安痢黴素 (apramycin) 等 7 品項抗生素 ( 品項見表一 ) 之多重殘留分析 2. 檢驗方法 : 檢體經萃取及淨化後, 以液相層析串聯質譜儀 (liquid chromatograph/tandem mass spectrometer, LC/MS/MS) 分析之方法 2.1. 裝置 : 液相層析串聯質譜儀 : 離子源 : 電灑離子化正離子 (positive ion electrospray ionization, ESI+) 層析管柱 :Agilent ZORBAX eclipse plus C18,1.7 μm, 內徑 2.1 mm 5 cm, 或同級品 離心機 (Centrifuge): 可控溫達 10 以下 振盪器 (Shaker) 均質機 (Homogenizer) 氮氣蒸發裝置 (Nitrogen evaporator) 固相真空萃取裝置 (Solid phase extraction vacuum manifolds) 旋渦混合器 (Vortex mixer) 2.2. 試藥 : 乙腈採用液相層析級 ; 氨水 ( 約 25%) 七氟丁酸 (heptafluorobutyric acid) 磷酸二氫鉀 (KH2PO4) 鹽酸 三氯醋酸 (trichloroacetic acid) 及乙二胺四乙酸二鈉 (disodium ethylene diamine tetraacetate, EDTA) 均採用試藥特級 ; 去離子水 ( 比電阻於 25 可達 18 MΩ cm 以上 ); 安痢黴素硫酸鹽 1. 適用範圍 : 本檢驗方法適用於蜂蜜及乳汁中安痢黴素 (apramycin) 等 7 品項抗生素 ( 品項見表一 ) 之多重殘留分析 2. 檢驗方法 : 檢體經萃取及淨化後, 以液相層析串聯質譜儀 (liquid chromatograph/tandem mass spectrometer, LC/MS/MS) 分析之方法 2.1. 裝置 : 液相層析串聯質譜儀 : 離子源 : 電灑離子化正離子 (positive ion electrospray ionization, ESI+) 層析管柱 :Agilent ZORBAX eclipse plus C18,1.7 μm, 內徑 2.1 mm 5 cm, 或同級品 離心機 (Centrifuge): 可控溫達 10 以下 振盪器 (Shaker) 均質機 (Homogenizer) 氮氣蒸發裝置 (Nitrogen evaporator) 固相真空萃取裝置 (Solid phase extraction vacuum manifolds) 旋渦混合器 (Vortex mixer) 2.2. 試藥 : 乙腈採用液相層析級 ; 氨水 ( 約 25%) 七氟丁酸 (heptafluorobutyric acid) 磷酸二氫鉀 (KH2PO4) 鹽酸 三氯醋酸 (trichloroacetic acid) 及乙二胺四乙酸二鈉 (disodium ethylene diamine tetraacetate, EDTA) 均採用試藥特級 ; 去離子水 ( 比電阻於 25 可達 18 MΩ cm 以上 ); 安痢黴素硫酸鹽 一 修正 移動相溶液 B 之配置溶劑 二 修正 移動相溶液 之梯度條件
3 (apramycin sulfate) 雙氫鏈黴素硫酸鹽 (dihydrostreptomycin-sesquisulfate) 健牠黴素硫酸鹽 (gentamicin sulfate) 康黴素硫酸鹽(kanamycin sulfate) 新黴素硫酸鹽(neomycin sulfate) 觀黴素 (spectinomycin-5h2o) 及鏈黴素硫酸鹽 (streptomycin sulfate) 對照用標準品 2.3. 器具及材料 : 離心管 :15 ml 及 50 ml,pp 固相萃取匣 (Solid phase extraction cartridge):oasis HLB cartridge,6 ml,500 mg, 或同級品 濾膜 : 孔徑 0.22 μm,pvdf 容量瓶.. 10 ml 2.4. 試劑之調製 : % 三氯醋酸緩衝溶液 : 取三氯醋酸 50 g 及磷酸二氫鉀 1.36 g, 以去離子水溶解使成 1000 ml M EDTA 溶液 : 取乙二胺四乙酸二鈉 7.5 g, 以去離子水溶解使成 100 ml M 七氟丁酸溶液 : 取七氟丁酸 1.3 ml, 加去離子水使成 100 ml 沖提液 : 取 0.1 M 七氟丁酸溶液與乙腈以 2: 8 (v/v) 比例混勻 mm 七氟丁酸溶液取七氟丁酸 0.13 ml, 加去離子水使成 100 ml 2.5. 移動相溶液之配製 : 移動相溶液 A: 取七氟丁酸 1.3 ml, 加去離子水使 (apramycin sulfate) 雙氫鏈黴素硫酸鹽 (dihydrostreptomycin-sesquisulfate) 健牠黴素硫酸鹽 (gentamicin sulfate) 康黴素硫酸鹽(kanamycin sulfate) 新黴素硫酸鹽(neomycin sulfate) 觀黴素 (spectinomycin-5h2o) 及鏈黴素硫酸鹽 (streptomycin sulfate) 對照用標準品 2.3. 器具及材料 : 離心管 :15 ml 及 50 ml,pp 固相萃取匣 (Solid phase extraction cartridge):oasis HLB cartridge,6 ml,500 mg, 或同級品 濾膜 : 孔徑 0.22 μm,pvdf 容量瓶.. 10 ml 2.4. 試劑之調製 : % 三氯醋酸緩衝溶液 : 取三氯醋酸 50 g 及磷酸二氫鉀 1.36 g, 以去離子水溶解使成 1000 ml M EDTA 溶液 : 取乙二胺四乙酸二鈉 7.5 g, 以去離子水溶解使成 100 ml M 七氟丁酸溶液 : 取七氟丁酸 1.3 ml, 加去離子水使成 100 ml 沖提液 : 取 0.1 M 七氟丁酸溶液與乙腈以 2: 8 (v/v) 比例混勻 mm 七氟丁酸溶液取七氟丁酸 0.13 ml, 加去離子水使成 100 ml 2.5. 移動相溶液之配製 : 移動相溶液 A: 取七氟丁酸 1.3 ml, 加去離子水使
4 成 1000 ml, 以濾膜過濾, 取濾液供作移動相溶液 A 移動相溶液 B: 取七氟丁酸 1.3 ml, 加乙腈使成 1000 ml, 以濾膜過濾, 取濾液供作移動相溶液 B 2.6. 標準溶液之配製 : 取相當於含胺基醣苷類抗生素對照用標準品各約 10 mg, 精確稱定, 分別以去離子水溶解並定容至 10 ml, 作為標準原液, 移入 15 ml 離心管中, 於 -20 貯存 臨用時分別取適量標準原液混合, 以去離子水稀釋至 0.05~3.0 μg/ml, 供作標準溶液 註 : 由於胺基醣苷類抗生素易帶正電荷, 可能與玻璃器皿表面產生吸附, 應使用 PP 材質塑膠器皿, 或經 1 N 鹽酸溶液浸泡 10 分鐘, 取出並以去離子水沖洗附著之鹽酸, 乾燥備用之玻璃器皿, 以避免吸附問題 2.7. 檢液之調製 : 萃取 : 將檢體混勻後, 取蜂蜜檢體約 5 g, 精確稱定, 或精確量取乳汁 5 ml, 置於 50 ml 離心管中, 加入 5% 三氯醋酸緩衝溶液 25 ml 和 0.2 M EDTA 溶液 1 ml, 旋渦混合 1 分鐘, 振盪 5 分鐘, 以 3200 g 離心 10 分鐘, 取上清液 加入 0.1 M 七氟丁酸溶液 5 ml, 旋渦混合 1 分鐘, 以 3200 g 離心 5 分鐘, 上清液以氨水調整 ph 值至 4.0, 供淨化用 淨化 : 取 節供淨化用溶液, 注入預先以乙腈 5 ml 去離子水 5 ml 及 10 mm 七氟丁酸溶液 5 ml 潤洗之固相萃取匣, 棄流出液 以去離子水 5 ml 成 1000 ml, 以濾膜過濾, 取濾液供作移動相溶液 A 移動相溶液 B: 取七氟丁酸 1.3 ml, 加去離子水使成 1000 ml, 以濾膜過濾, 取濾液供作移動相溶液 B 2.6. 標準溶液之配製 : 取相當於含胺基醣苷類抗生素對照用標準品各約 10 mg, 精確稱定, 分別以去離子水溶解並定容至 10 ml, 作為標準原液, 移入 15 ml 離心管中, 於 -20 貯存 臨用時分別取適量標準原液混合, 以去離子水稀釋至 0.05~3.0 μg/ml, 供作標準溶液 註 : 由於胺基醣苷類抗生素易帶正電荷, 可能與玻璃器皿表面產生吸附, 應使用 PP 材質塑膠器皿, 或經 1 N 鹽酸溶液浸泡 10 分鐘, 取出並以去離子水沖洗附著之鹽酸, 乾燥備用之玻璃器皿, 以避免吸附問題 2.7. 檢液之調製 : 萃取 : 將檢體混勻後, 取蜂蜜檢體約 5 g, 精確稱定, 或精確量取乳汁 5 ml, 置於 50 ml 離心管中, 加入 5% 三氯醋酸緩衝溶液 25 ml 和 0.2 M EDTA 溶液 1 ml, 旋渦混合 1 分鐘, 振盪 5 分鐘, 以 3200 g 離心 10 分鐘, 取上清液 加入 0.1 M 七氟丁酸溶液 5 ml, 旋渦混合 1 分鐘, 以 3200 g 離心 5 分鐘, 上清液以氨水調整 ph 值至 4.0, 供淨化用 淨化 : 取 節供淨化用溶液, 注入預先以乙腈 5 ml 去離子水 5 ml 及 10 mm 七氟丁酸溶液 5 ml 潤洗之固相萃取匣, 棄流出液 以去離子水 5 ml
5 流洗固相萃取匣, 棄流出液, 再以沖提液 5 ml 沖提, 收集沖提液, 於 60 水浴中以氮氣濃縮至約 1 ml, 再以 10 mm 七氟丁酸溶液定容至 2 ml, 經濾膜過濾, 供作檢液 2.8. 基質匹配檢量線之製作 : 取空白檢體依 2.7. 節萃取淨化及氮氣濃縮後, 分別添加不同濃度標準溶液 1 ml, 以 10 mm 七氟丁酸溶液定容至 2 ml, 經濾膜過濾後, 依下列條件進行液相層析串聯質譜分析 就各抗生素之波峰面積, 與對應之各抗生素添加濃度, 分別製作基質匹配檢量線 ( 註液相層析串聯質譜測定條件 ) : 層析管柱 :Agilent ZORBAX eclipse plus C18,1.7 μm, 內徑 2.1 mm 5 cm 移動相溶液 :A 液與 B 液以下列條件進行梯度分析時間 (min) A (%) B (%) 移動相流速 :0.3 ml/min 注入量 :5 μl 毛細管電壓 (Capillary voltage):5.5 kv 溶媒揮散溫度 (Desolvation temperature):550 氣簾氣體流速 (Curtain gas flow):20 psi 霧化氣體 (Ion source gas 1):50 psi 加熱氣體 (Ion source gas 2):55 psi 流洗固相萃取匣, 棄流出液, 再以沖提液 5 ml 沖提, 收集沖提液, 於 60 水浴中以氮氣濃縮至約 1 ml, 再以 10 mm 七氟丁酸溶液定容至 2 ml, 經濾膜過濾, 供作檢液 2.8. 基質匹配檢量線之製作 : 取空白檢體依 2.7. 節萃取淨化及氮氣濃縮後, 分別添加不同濃度標準溶液 1 ml, 以 10 mm 七氟丁酸溶液定容至 2 ml, 經濾膜過濾後, 依下列條件進行液相層析串聯質譜分析 就各抗生素之波峰面積, 與對應之各抗生素添加濃度, 分別製作基質匹配檢量線 ( 註液相層析串聯質譜測定條件 ) : 層析管柱 :Agilent ZORBAX eclipse plus C18,1.7 μm, 內徑 2.1 mm 5 cm 移動相溶液 :A 液與 B 液以下列條件進行梯度分析時間 (min) A (%) B (%) 移動相流速 :0.3 ml/min 注入量 :5 μl 毛細管電壓 (Capillary voltage):5.5 kv 溶媒揮散溫度 (Desolvation temperature):550 氣簾氣體流速 (Curtain gas flow):20 psi 霧化氣體 (Ion source gas 1):50 psi 加熱氣體 (Ion source gas 2):55 psi
6 偵測模式 : 多重反應偵測 (multiple reaction monitoring, MRM) 偵測離子對 去集簇電壓 (declustering potential) 與碰撞能量 (collision energy) 如表一 註 : 上述測定條件分析不適時, 可依所使用之儀器, 設定適合之測定條件 2.9. 鑑別試驗及含量測定 : 精確量取檢液及標準溶液各 5 μl, 分別注入液相層析串聯質譜儀中, 依 2.8. 節條件進行分析 就檢液與標準溶液所得波峰之滯留時間及多重反 ( 註 ) 應偵測相對離子強度鑑別之, 並依下列計算式, 求出檢體中各抗生素之含量 (ppm): 檢體中各抗生素之含量 (ppm) C V = M C: 由基質匹配檢量線求得檢液中各抗生素之濃度 (μg/ml) V: 檢體最後定容之體積 (ml) M: 取樣分析檢體之重量 (g) 或體積 (ml) 註 : 相對離子強度由定性離子對與定量離子對之波峰面積比而得 ( 100%), 容許範圍如下 : 相對離子強度 (%) 容許範圍 (%) >50 ±20 >20~50 ±25 >10~20 ±30 10 ±50 附註 :1. 本檢驗方法之定量極限如表二 2. 食品中有影響檢驗結果之物質時, 應自行探討 偵測模式 : 多重反應偵測 (multiple reaction monitoring, MRM) 偵測離子對 去集簇電壓 (declustering potential) 與碰撞能量 (collision energy) 如表一 註 : 上述測定條件分析不適時, 可依所使用之儀器, 設定適合之測定條件 2.9. 鑑別試驗及含量測定 : 精確量取檢液及標準溶液各 5 μl, 分別注入液相層析串聯質譜儀中, 依 2.8. 節條件進行分析 就檢液與標準溶液所得波峰之滯留時間及多重反 ( 註 ) 應偵測相對離子強度鑑別之, 並依下列計算式, 求出檢體中各抗生素之含量 (ppm): 檢體中各抗生素之含量 (ppm) C V = M C: 由基質匹配檢量線求得檢液中各抗生素之濃度 (μg/ml) V: 檢體最後定容之體積 (ml) M: 取樣分析檢體之重量 (g) 或體積 (ml) 註 : 相對離子強度由定性離子對與定量離子對之波峰面積比而得 ( 100%), 容許範圍如下 : 相對離子強度 (%) 容許範圍 (%) >50 ±20 >20~50 ±25 >10~20 ±30 10 ±50 附註 :1. 本檢驗方法之定量極限如表二 2. 食品中有影響檢驗結果之物質時, 應自行探討
7 表一 安痢黴素等 7 品項抗生素之多重反應偵測模式參數 分析物 離子對 去集簇 項次前驅離子 (m/z)> 電壓英文名中文名產物離子 (m/z) (V) 1 Apramycin 安痢黴素 540 > 217* > Dihydrostreptomycin 雙氫鏈黴素 584 > 263 * > Gentamicin 健牠黴素 Gentamicin C1a Gentamicin C1 Gentamicin C2a/b Kanamycin 康黴素 5 Neomycin 新黴素 6 Spectinomycin 觀黴素 7 Streptomycin 鏈黴素 * 定量離子對 450 > 322 * 450 > > 322* 478 > > 322* 464 > > 163* 485 > > 161* 615 > > 333* 351 > > 263* 582 > 碰撞能量 (ev) 表二 安痢黴素等 7 品項抗生素之定量極限分析物 定量極限 (ppm) 英文名中文名蜂蜜乳汁 Apramycin 安痢黴素 Dihydrostreptomycin 雙氫鏈黴素 Gentamicin 健牠黴素 Kanamycin 康黴素 Neomycin 新黴素 Spectinomycin 觀黴素 Streptomycin 鏈黴素
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