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1 1104 生 物 工 程 学 报 Chinese Journal of Biotechnology DOI: /j.cjb 管 峰 等 / 海 豚 链 球 菌 诱 变 发 酵 法 制 备 透 明 质 酸 及 其 在 动 物 皮 肤 修 复 中 的 应 用 August 25, 2016, 32(8): Chin J Biotech, All rights reserved 组 织 工 程 与 细 胞 培 养 管 峰 1, 金 嘉 长 1, 赵 华 国 1, 洪 磊 1, 沈 志 森 2, 竺 亚 斌 ,,,.., 2016, 32(8): Guan F, Jin JC, Zhao HG, et al. Hyaluronic acid production by Streptococcus iniae and its application in rabbit skin s regeneration. Chin J Biotech, 2016, 32(8): 摘 要 : 透 明 质 酸 (HA) 是 一 种 非 常 重 要 的 生 物 材 料, 是 体 内 广 泛 存 在 的 细 胞 外 基 质 成 分 之 一 为 了 获 得 产 量 分 子 量 及 纯 度 较 高 的 透 明 质 酸, 并 研 究 透 明 质 酸 水 凝 胶 在 动 物 皮 肤 修 复 中 的 潜 在 作 用 通 过 紫 外 诱 变 的 方 法 对 海 豚 链 球 菌 进 行 诱 变, 并 对 此 突 变 菌 发 酵 后 产 物 的 蛋 白 含 量 及 HA 分 子 量 进 行 了 测 定, 通 过 CTAB 法 对 发 酵 产 物 进 行 提 纯, 运 用 物 理 冻 融 法 将 透 明 质 酸 制 成 水 凝 胶 后, 用 于 兔 背 部 全 层 皮 肤 修 复 的 初 探 结 果 表 明 通 过 诱 变 海 豚 链 球 菌 产 透 明 质 酸 的 能 力 从 (82.3±3.3) mg/l 增 加 到 (120±10.6) mg/l, 增 加 了 46.4%; 产 物 经 纯 化 后 蛋 白 含 量 从 (0.178±0.011) mg/l 减 少 到 (0.032±0.017) mg/l, 减 少 了 82.02%; 所 制 得 透 明 质 酸 的 分 子 量 约 为 Da; 透 明 质 酸 水 凝 胶 对 兔 全 层 皮 肤 缺 损 的 修 复 有 较 明 显 的 促 进 作 用, 能 减 轻 炎 症 和 伤 口 瘢 痕 的 形 成 : 海 豚 链 球 菌, 发 酵, 透 明 质 酸, 皮 肤 修 复 Received: December 9, 2015; Accepted: March 17, 2016 Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos , ), Project of Scientific Innovation Team of Ningbo (Nos. 2015B11050, 2012C5015). Corresponding author: Yabin Zhu. Tel: ; zhuyabin@nbu.edu.cn (Nos , ) (Nos. 2015B11050, 2012C5015)

2 管 峰 等 / 海 豚 链 球 菌 诱 变 发 酵 法 制 备 透 明 质 酸 及 其 在 动 物 皮 肤 修 复 中 的 应 用 1105 Hyaluronic acid production by Streptococcus iniae and its application in rabbit skin s regeneration Feng Guan 1, Jiachang Jin 1, Huaguo Zhao 1, Lei Hong 1, Zhisen Shen 2, and Yabin Zhu 1 1 The Medical School, Ningbo University, Ningbo , Zhejiang, China 2 The Lihuili Hospital Affiliated to the Medical School, Ningbo University, Ningbo , Zhejiang, China Abstract: Hyaluronic acid (HA) is an important biomaterial as the extracellular matrix in human body. We produced HA by fermentation of Streptococcus iniae (Strep.). Production of HA by Strep. was evaluated and further improved by strain mutation by ultraviolet. One strain with higher HA yield and lower content of protein was obtained. Its HA yield increased from (82.3±3.3) mg/l to (120±10.6) mg/l, and protein decreased from (0.178±0.011) mg/l to (0.032±0.017) mg/l. The molecular weight (MW) of HA yield from Strep. is about Da. Using the method of freezing and thawing, HA aqueous solution was transferred into hydrogel. This HA hydrogel, casted on sterilized non-woven fabric, was applied to repair rabbit skin with full-thickness defect. The preliminary results of the animal tests displayed that HA hydrogel obviously reduced the inflammation around the wound and promoted the skin regeneration comparing with the control tests. Keywords: Streptococcus iniae, fermentation, hyaluronic acid, skin regeneration (Hyaluronic acid HA) (1 4)-β-D- (1 3)-β-D-N- [1] 1 [2] 1934 Meyer Palmer [3] HA HA HA [4-11] 图 1 透 明 质 酸 的 结 构 式 [2] Fig. 1 The structure scheme of hyaluronic acid [2] cjb@im.ac.cn

3 1106 ISSN CN /Q Chin J Biotech August 25, 2016 Vol.32 No.8 HA 1983 [12] HA [13-15] (Streptococcus iniae, Strep.) β [16] [12] HA HA 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 与 试 剂 (Streptococcus iniae Strep.) 16S rrna PCR ( Da) (CTAB aladdin) - (BHI ) NaCl ( ) (HANGWEI ) (SDS Solarbio) 1.2 培 养 基 BHI (100 ml) 1 g 0.5 g 0.25 g 0.2 g 50 ml ph g 100 ml ph min BHI 1.5% BHI min 2 g 2 g 2 g 1 g 0.2 g 0.2 g 100 ml ph min BHI BHI 海 豚 链 球 菌 发 酵 产 物 的 粗 提 和 纯 化 Strep. 15 h 0.1% (SDS W/V) 10 min 10 min (7 000 r/min) min (7 000 r/min) (75% 25% 0.15 mol/l NaCl) 3 2 min ( r/min) [17] CTAB [18-19] 0.1% SDS 10 min CTAB (10% W/W) 15 min NaCl (0.2 mol/l) 3

4 管 峰 等 / 海 豚 链 球 菌 诱 变 发 酵 法 制 备 透 明 质 酸 及 其 在 动 物 皮 肤 修 复 中 的 应 用 min r/min HA [18] 1.4 发 酵 产 物 中 HA 浓 度 的 测 定 HA CTAB [20] HA mg/l 400 nm 150 L 2 ml EP 350 L (0.2 mol/l 0.15 mol/l ph 6.0) 1 ml CTAB min 400 nm HA 1.5 发 酵 产 物 中 蛋 白 质 含 量 的 测 定 及 蛋 白 去 除 率 的 计 算 BCA (Cat:CW0014) (P 0 ) (P 1 ) P 0 = (P 0 P 1 )/P HA 分 子 量 测 定 HA [21] 0.57 mm s 5 lnη r η sp lnη r /c η sp /c c c=0 [η] Mark-Houwink α [ η]= K M η M η K α K= α=0.78 η r =η/η 0 η sp =(η η 0 )/η 0 η η mol/l NaCl c 1.7 海 豚 链 球 菌 的 紫 外 诱 变 Strep. (Ultraviolet UV) 90% HA HA 20 W 30 cm (N 1 ) (N 0 ) N 0 =(N 1 N 0 )/N 0 100% 1.8 培 养 基 的 优 化 BHI (B) (G) B G= r/min 15 h 500 L r/min 10 min 500 L PBS 200 L ( 600 nm) cjb@im.ac.cn

5 1108 ISSN CN /Q Chin J Biotech August 25, 2016 Vol.32 No 透 明 质 酸 应 用 于 兔 子 皮 肤 修 复 HA [22] HA HA 16 mg/ml 3 ml 3.5 cm 3.5 cm 1.5 mm 20 ( ) HA (HA ) 2 d 5 d (White blood cell WBC) 1.10 统 计 分 析 t P<0.05 Graphpad Prism 6.0 SPSS 结 果 与 分 析 2.1 海 豚 链 球 菌 的 生 长 曲 线 Strep. 14 h h 6 10 h 10 h h 9 10 h 2.2 海 豚 链 球 菌 的 紫 外 诱 变 及 培 养 基 优 化 s 5 5 s 50% 30 s 90% 60 s 100% 35 s 图 2 海 豚 链 球 菌 的 生 长 曲 线 Fig. 2 The growth curve of Streptococcus iniae as a function of time. 图 3 海 豚 链 球 菌 的 紫 外 诱 变 致 死 率 曲 线 Fig. 3 The mortality of Streptococcus iniae under UV treatment as a function of time.

6 管 峰 等 / 海 豚 链 球 菌 诱 变 发 酵 法 制 备 透 明 质 酸 及 其 在 动 物 皮 肤 修 复 中 的 应 用 1109 Strep. 46.4% ( (82.3±3.3) mg/l (120±10.6) mg/l) BHI BHI BHI BG5.5 ( BHI =5 3) BHI BG7.3 ( BG7.3) BHI (P<0.05) 5 BHI 图 5 海 豚 链 球 菌 在 不 同 培 养 基 配 比 下 的 吸 光 度 Fig. 5 Absorbance of Streptococcus iniae (at 600 nm) with a variety of culture media of different ratio of BHI to glucose medium. In picture, BG0.1 stands for the ratio of BHI medium to glucose medium (B:G)=0:1; so are others. CTAB [18-19] HA (0.178±0.011) mg/l (0.032±0.017) mg/l 6 (P<0.05) 82.02% 88.32% [19] HA Da 图 4 海 豚 链 球 菌 2 次 紫 外 诱 变 后 的 HA 产 量 变 化 Fig. 4 The variation of HA s yield of Streptococcus iniae after two times of UV mutation. 图 6 HA 纯 化 前 后 蛋 白 含 量 的 变 化 Fig. 6 The variation of protein content before and after HA purification cjb@im.ac.cn

7 1110 ISSN CN /Q Chin J Biotech August 25, 2016 Vol.32 No.8 情况均明显好于对照 (无凝胶) 组 HA 组与对 FTIR 表征 海豚链球菌发酵产物经纯化后 充分干燥 以 照组的伤口在手术后 2 d 均是湿润的 凝胶及无 溴化钾压片 利用红外光谱仪 (Thermo 美国) 进 纺布上都有血迹 伤口有红肿 HA 组比对照组 行 FTIR 吸收光谱测试 (扫描范围 cm ) 略轻 在术后 5 d 左右二组均有一定程度的化 得到的红外吸收光谱与 HA 标准品进行比较 从 脓 伤口周围红肿但比 2 d 时减轻 相对而言 图 7 可以看出 海豚链球菌发酵产物中 HA 的吸 HA 组化脓情况轻微 红肿不如对照组明显 伤 收峰 (A) 与 HA 标准品的吸收峰 (B) 基本一致 口周围已部分结痂 5 d 后伤口均慢慢缩小 整 1 在 cm 附近有很强的 O-H 伸缩振动的特征 1 吸收 说明存在多羟基结构 在 cm 附近 个伤口部分均结痂变硬 到 18 d 和 27 d 时 二 组的伤口情况已发生明显差异 (图 8 和图 9) 结 1 有-CH2 的伸缩振动 在 cm 附近有 CO- CN-的伸缩振动 说明存在酰胺基结构 cm 1 处为羧基中 O-H 的伸缩振动 以上的 特征吸收峰可以表明 Streptococcus iniae 发酵产 物经纯化后得到的主要为 HA 其含有的多糖羟 基 乙酰氨基及羟羧基结构 与 HA 重复单位 中的乙酰氨基葡萄糖 葡萄糖醛酸一致 综上 所述 采用 Streptococcus iniae 诱变发酵法可以 作为 HA 的微生物发酵制备的菌株 2.4 HA 水凝胶在皮肤修复中的作用初探 兔子背部伤口分别经临床上常规纱布包覆 和采用 HA 水凝胶包覆后伤口修复的外观观察 情况如图 6 所示 18 d 和 27 d 时其伤口的修复 图 7 透明质酸的 FTIR 曲线 Fig. 7 FTIR curve of hyaluronic acid. A: HA fabricated from Strep. Fermentation; B: standard HA. 图 8 兔子背部全层皮肤修复观察 Fig. 8 Overview of wound skin repairing on rabbit s back. a: control group; b: HA group.1: day 0 post-operation; 2: day 5 post-operation; 3: day 18 post-operation; 4: day 27 post-operation; 5: day 40 post-operation.

8 管 峰 等 / 海 豚 链 球 菌 诱 变 发 酵 法 制 备 透 明 质 酸 及 其 在 动 物 皮 肤 修 复 中 的 应 用 d 10 6 d (Ctrl) HA 图 9 伤 口 面 积 的 大 小 变 化 (cm 2 ), 第 18 及 27 天 时, Ctrl 及 HA 组 的 伤 口 面 积 差 异 有 显 著 性 (P<0.05) Fig. 9 The variation of area of scars (cm 2 ), the area of scars of Ctrl and HA groups are different significantly at the 18 th and 27 th days (P<0.05). 图 10 术 后 20 d 内 对 照 组 与 HA 组 血 液 中 白 细 胞 相 对 含 量 的 变 化 Fig. 10 Relative values of WBC in blood of Ctrl and HA groups in 20 days post-operation. HA 6 d 20 d HA 3 讨 论 1937 Kendall [23] β Streptococcus iniae HA γ [24] γ [25] γ cjb@im.ac.cn

9 1112 ISSN CN /Q Chin J Biotech August 25, 2016 Vol.32 No.8 HA [26-30] HA HA BHI BHI BHI BHI HA [31-32] HA [31,33] HA HA HA HA ( HA ) HA 4 结 论 Streptococcus iniae 46% Streptococcus iniae BHI ( ) HA HA REFERENCES [1] Weissman B, Meyer K. The structure of hyalobiuronic acid and of hyaluronic acid from umbilical cord. J Am Chem Soc, 1954, 76(7): [2] Luan T. Study on the molecular characterization, rheological properties and physical cryogel of mucopolysaccharide hyaluronan [D]. Shanghai: Shanghai Jiao Tong University, 2011 (in Chinese).. [D]. :

10 管 峰 等 / 海 豚 链 球 菌 诱 变 发 酵 法 制 备 透 明 质 酸 及 其 在 动 物 皮 肤 修 复 中 的 应 用 1113, [3] Meyer K, Palmer JW. The polysaccharide of the vitreous humor. J Biolog Chem, 1934, 107(3): [4] Almeida PV, Shahbazi MA, Mäkilä E, et al. Amine-modified hyaluronic acid-functionalized porous silicon nanoparticles for targeting breast cancer tumors. Nanoscale, 2014, 6(17): [5] Back JH, Cho WJ, Kim JH, et al. Application of hyaluronic acid/sodium alginate-based microparticles to prevent tissue adhesion in a rabbit model. Surg Today, 2016, 46(4): [6] Laffleur F, Dachs S. Development of novel mucoadhesive hyaluronic acid derivate as lubricant for the treatment of dry eye syndrome. Ther Deliv, 2015, 6(10): [7] Li L, Wang N, Jin X, et al. Biodegradable and injectable in situ cross-linking chitosan-hyaluronic acid based hydrogels for postoperative adhesion prevention. Biomaterials, 2014, 35(12): [8] Park JH, Cho HJ, Yoon HY, et al. Hyaluronic acid derivative-coated nanohybrid liposomes for cancer imaging and drug delivery. J Control Release, 2014, 174: [9] Shen J, Xu ZW. Combined application of acellular bovine pericardium and hyaluronic acid in prevention of postoperative pericardial adhesion. Artif Organs, 2014, 38(3): [10] Taub AF. Cheek augmentation improves feelings of facial attractiveness. J Drugs Dermatol, 2012, 11(9): [11] Vasi AM, Popa MI, Butnaru M, et al. Chemical functionalization of hyaluronic acid for drug delivery applications. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, 2014, 38: [12] Guo XP, Ling PX, Wang CX, et al. Production of hyaluronic acid. Pharm Biotechnol, 2000, 7(1): (in Chinese).,,,.., 2000, 7(1): [13] Blank LM, McLaughlin RL, Nielsen LK. Stable production of hyaluronic acid in Streptococcus zooepidemicus chemostats operated at high dilution rate. Biotechnol Bioeng, 2005, 90(6): [14] Don MM, Shoparwe NF. Kinetics of hyaluronic acid production by Streptococcus zooepidemicus considering the effect of glucose. Biochem Eng J, 2010, 49(1): [15] Sae-Jin K, Sung-Yurb P, Chan-Wha K. A novel approach to the production of hyaluronic acid by Streptococcus zooepidemicus. J Micobiol Biotechnol, 2006,16(12): [16] Shen ZH. Isolation, identification, pathogenicity and detection of streptococcus iniae isolated from red drum sciaenops ocellatus [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2005 (in Chinese).. [D]. :, [17] Jeong E, Shim WY, Kim JH. Metabolic engineering of Pichia pastoris for production of hyaluronic acid with high molecular weight. J Biotechnol, 2014, 185: [18] Chen YH. Study on preparation of hyaluronic acid by fermentation and its composite modification [D]. Wuxi: Jiangnan University, 2010 (in Chinese).. [D]. :, [19] Sheng RT, Tan TW. Separating hyaluronic acid from fermentation broth with CTAB. J Beijing Univ Chem Technol, 2006, 33(3): (in Chinese).,.., 2006, 33(3): [20] Wen C, Yu HM, Sun YP, et al. Efficient quantification of hyaluronic acid in fermentation broth by modified CTAB method. China Biotechnol, 2010, 30(2): (in Chinese).,,,. CTAB., 2010, 30(2): [21] Young RJ, Lovell PA. Introduction to Polymers. 3rd ed. Boca Raton: CRC Press Taylor & Francis Group, cjb@im.ac.cn

11 1114 ISSN CN /Q Chin J Biotech August 25, 2016 Vol.32 No.8 [22] Okamoto A, Miyoshi T. A biocompatible gel of hyaluronan//kennedy JF, Phillips GO, Williams PA, Eds. Hyaluronan. Cambridge: Woodhead Publishing, [23] Kendall FE, Heidelberger M, Dason MH. A serologically inactive polysaccharide streptococcus. J Biological Chem, 1937, 118(1): [24] Shi YL, Guo XP, Luan YH. Survey on mutation breeding of HA-producing strains. Food Drug, 2006, 8(10A): (in Chinese).,,.., 2006, 8(10A): [25] Zhuge J, Li HZ. Microbiology. 2nd ed. Beijing: Science Press, 2009: (in Chinese).,.. 2. :, 2009: [26] Armstrong DC, Johns MR. Culture conditions affect the molecular weight properties of hyaluronic acid produced by Streptococcus zooepidemicus. Appl Environ Microbiol, 1997, 63(7): [27] Duan XJ, Yang L, Zhang X, et al. Effect of oxygen and shear stress on molecular weight of hyaluronic acid. J Microbiol Biotechnol, 2008, 18(4): [28] Liu L, Sun J, Xu WB, et al. Modeling and optimization of microbial hyaluronic acid production by Streptococcus zooepidemicus using radial basis function neural network coupling quantum-behaved particle swarm optimization algorithm. Biotechnol Prog, 2009, 25(6): [29] Pires AMB, Eguchi SY, Santana MHA. The influence of mineral ions on the microbial production and molecular weight of hyaluronic acid. Appl Biochem Biotechnol, 2010, 162(8): [30] Zhang JF, Ding X, Yang LY, et al. A serum-free medium for colony growth and hyaluronic acid production by Streptococcus zooepidemicus NJUST01. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 72(1): [31] Wu ZZ, Tang Y, Fang HD, et al. Decellularized scaffolds containing hyaluronic acid and EGF for promoting the recovery of skin wounds. J Mater Sci Mater Med, 2015, 26(1): [32] Sabadotto M, Theunis J, Black D, et al. In vivo assessment of the effect of a cream containing Avena Rhealba extract and hyaluronic acid on the restoration of the skin barrier in de-epidermised skin produced with an erbium-yag laser. Eur J Dermatol, 2014, 24(5): [33] Shimizu N, Ishida D, Yamamoto A, et al. Development of a functional wound dressing composed of hyaluronic acid spongy sheet containing bioactive components: evaluation of wound healing potential in animal tests. J Biomater Sci Polym Ed, 2014, 25(12): ( 本 文 责 编 陈 宏 宇 )

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