184 涼 季 採 集 之 冷 凍 胚 移 置 改 善 荷 蘭 乳 牛 熱 季 懷 孕 率 緒 言 臺 灣 地 區 之 荷 蘭 乳 牛, 尤 其 5-10 月 份 的 熱 季 中, 受 到 高 環 境 溫 度 濕 度 的 影 響, 導 致 發 情 的 不 明 顯 不 發 情 排 卵 延 遲 等 及

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1 畜 產 研 究 41(3):183~192, 楊 德 威 2008蕭 宗 法 謝 昭 賢 王 治 華 沈 朋 志 李 善 男 劉 炳 燦 183 涼 季 採 集 之 冷 凍 胚 移 置 改 善 荷 蘭 乳 牛 熱 季 懷 (1) 孕 率 (2) 楊 德 威 (4) 沈 朋 志 (2) 蕭 宗 法 (5) 李 善 男 (2) 謝 昭 賢 (4)(6) 劉 炳 燦 (3) 王 治 華 收 件 日 期 :96 年 8 月 30 日 ; 接 受 日 期 :97 年 3 月 14 日 摘 要 台 灣 地 區 熱 季 氣 候 環 境 高 溫 多 濕, 乳 牛 繁 殖 性 能 受 熱 緊 迫 環 境 影 響 而 顯 著 低 落, 本 試 驗 以 涼 季 採 集 之 冷 凍 胚 於 夏 季 進 行 胚 移 置, 探 討 對 提 升 熱 季 乳 牛 繁 殖 性 能 之 可 行 性 冷 凍 胚 於 2003 年 與 2004 年 涼 季 (11 月 至 翌 年 4 月 ) 採 集,42 頭 荷 蘭 乳 牛 經 超 級 排 卵 與 非 外 科 方 法 生 產 275 個 牛 胚, 胚 品 質 屬 於 良 好 的 一 級 胚 (110 個,40%) 及 二 級 胚 (31 個,11.3%) 均 予 以 冷 凍 保 存, 並 於 接 續 的 涼 熱 季 進 行 母 牛 ( 初 產 與 經 產 牛 ) 及 女 牛 之 胚 移 置, 同 時 以 該 期 間 畜 試 所 乳 牛 場 熱 季 發 情 觀 察 與 人 工 授 精 之 繁 殖 成 績 為 對 照 試 驗 結 果 顯 示, 自 每 頭 牛 採 集 之 可 移 置 胚 數 平 均 為 3.4 個, 經 產 牛 與 初 產 牛 間 沒 有 差 異 總 共 移 置 冷 凍 胚 59 頭 次 之 懷 孕 率 為 40.7%, 其 中 涼 季 (11 4 月 ) 與 熱 季 (5-10 月 ) 之 懷 孕 率 分 別 為 39.3%(11/28) 與 41.9%(13/31), 季 節 影 響 不 顯 著 胎 次 亦 不 顯 著 影 響 牛 隻 懷 孕 率, 母 牛 與 女 牛 懷 孕 率 分 別 為 33.3%(9/27) 與 46.9%(15/32) 於 同 期 熱 季 比 較 繁 殖 方 法 之 差 異, 得 知 胚 移 置 與 人 工 授 精 在 母 牛 之 懷 孕 率 分 別 30.8%(4/13) 與 13.6% (6/44), 胚 移 置 可 明 顯 提 升 熱 季 母 牛 懷 孕 率 達 226%; 女 牛 方 面 則 分 別 為 50.0%(9/18) 與 44.9%(22/49), 也 顯 示 了 促 進 效 果 綜 合 試 驗 結 果 顯 示, 季 節 與 胎 次 皆 不 會 影 響 受 胚 牛 的 懷 孕 率 熱 季 移 置 涼 季 冷 凍 胚 的 方 法, 可 能 經 由 避 免 早 期 牛 胚 對 熱 的 高 敏 感 期 間, 促 使 荷 蘭 乳 牛 懷 孕 率 明 顯 提 升, 因 此 可 以 做 為 改 善 夏 季 乳 牛 繁 殖 效 率 的 策 略 關 鍵 詞 : 懷 孕 率 乳 牛 冷 凍 胚 移 置 熱 季 (1) 行 政 院 農 業 委 員 會 畜 產 試 驗 所 研 究 報 告 第 1430 號 (2) 行 政 院 農 業 委 員 會 畜 產 試 驗 所 產 業 組 (3) 行 政 院 農 業 委 員 會 畜 產 試 驗 所 高 雄 種 畜 繁 殖 場 (4) 國 立 屏 東 科 技 大 學 畜 產 系 (5) 行 政 院 農 業 委 員 會 畜 產 試 驗 所 (6) 通 訊 作 者, [email protected]

2 184 涼 季 採 集 之 冷 凍 胚 移 置 改 善 荷 蘭 乳 牛 熱 季 懷 孕 率 緒 言 臺 灣 地 區 之 荷 蘭 乳 牛, 尤 其 5-10 月 份 的 熱 季 中, 受 到 高 環 境 溫 度 濕 度 的 影 響, 導 致 發 情 的 不 明 顯 不 發 情 排 卵 延 遲 等 及 食 慾 的 降 低, 減 少 乾 物 質 的 採 食 量 同 樣 地, 生 殖 內 泌 素 亦 會 受 高 環 境 溫 度 的 影 響, 這 些 環 境 及 生 殖 內 泌 素 之 影 響 因 子, 造 成 荷 蘭 乳 牛 低 發 情 偵 出 率 和 低 懷 孕 率, 導 致 臺 灣 地 區 之 荷 蘭 乳 牛 繁 殖 效 率 低 落 ( 蕭,1987) 牛 隻 受 到 熱 緊 迫 影 響, 以 致 於 發 情 不 明 顯 改 變 卵 巢 濾 泡 波 影 響 卵 子 發 育, 進 而 抑 制 胚 的 生 長 發 育 (Hansen et al., 2001) Putney et al. (1988) 及 Monty and Racowsky(1987) 報 告 指 出, 泌 乳 牛 在 熱 緊 迫 環 境 下, 造 成 大 多 數 胚 在 受 精 後 7 天 內 早 期 死 亡 對 於 熱 緊 迫 牛 隻 的 低 懷 孕 率, 胚 早 期 死 亡 是 一 個 主 要 因 子 之 一 ; 因 此 收 集 非 熱 緊 迫 ( 涼 季 ) 供 胚 牛 的 胚, 移 置 於 一 熱 緊 迫 的 受 胚 牛 發 情 後 7 天 的 體 內, 越 過 胚 初 期 發 育 對 熱 的 敏 感, 亦 是 提 高 母 牛 懷 孕 率 的 方 法 之 一 李 等 (1993) 比 較 自 製 乳 牛 新 鮮 胚 冷 凍 胚 及 美 國 進 口 冷 凍 胚 於 國 內 各 酪 農 場 進 行 胚 移 置 後 之 懷 孕 率, 試 驗 結 果 新 鮮 胚 之 懷 孕 率 為 30% (6/20), 冷 凍 胚 為 32.5%(13/40) Putney et al. (1989) 比 較 熱 緊 迫 下 泌 乳 牛 利 用 新 鮮 胚 移 置 與 人 工 授 精 之 懷 孕 率, 試 驗 結 果 新 鮮 胚 移 置 之 懷 孕 率 29.2%, 人 工 授 精 之 懷 孕 率 13.5%;Drost et al. (1999) 比 較 熱 緊 迫 下 泌 乳 牛 利 用 冷 凍 胚 移 置 與 人 工 授 精 之 懷 孕 率, 試 驗 結 果 冷 凍 胚 移 置 之 懷 孕 率 35.4%, 人 工 授 精 之 懷 孕 率 24.1% 本 試 驗 旨 在 涼 季 時 收 集 供 胚 牛 的 胚, 並 於 熱 季 時 胚 移 置 入 受 胚 牛, 以 避 免 熱 緊 迫 對 受 精 後 0-7 天 牛 胚 之 不 利 影 響, 而 提 升 荷 蘭 乳 牛 熱 季 之 懷 孕 率 材 料 與 方 法 Ⅰ. 供 胚 牛 之 發 情 同 期 化 利 用 涼 季 期 間 (2002 年 11 月 至 2003 年 4 月 及 2003 年 11 月 至 2004 年 4 月 ), 進 行 50 頭 次 荷 蘭 母 牛 ( 初 產 與 經 產 牛 ) 超 級 排 卵 經 直 腸 觸 診 確 定 牛 隻 處 於 動 情 週 期 黃 體 期 間 且 卵 巢 運 作 正 常, 並 每 頭 各 肌 肉 注 射 前 列 腺 素 (Estrumate, Bayer Inc., USA)2 ml(500 μg) 進 行 發 情 同 期 化 的 處 理 同 時, 依 Pryce et al.(2001) 之 方 式 進 行 胖 瘦 度 評 分 (body condition score, BCS), 以 1 分 代 表 極 瘦 3 分 代 表 中 等 5 分 代 表 極 胖, 作 為 乳 牛 營 養 健 康 狀 況 對 胚 品 質 的 影 響 情 形 之 評 估 Ⅱ. 牛 隻 超 級 排 卵 及 非 外 科 胚 採 集 供 胚 牛 於 動 情 週 期 的 第 11 日 起, 連 續 給 予 4 天 的 激 濾 泡 素 (follicular stimulating hormone, FSH)( 川 崎 製 藥 株 式 會 社, 日 本 ) 之 肌 肉 注 射, 前 3 天 每 天 注 射 兩 次, 第 4 天 僅 注 射 一 次, 每 次 間 隔 12 小 時 ; 逐 日 遞 減 每 次 之 劑 量, 其 劑 量 分 別 為 7.5,6.25,5.0 與 2.5 units; 並 於 第 三 天 第 二 劑 注 射 時, 同 時 肌 肉 注 射 2 ml(500 μg) 之 前 列 腺 素 注 射 前 列 腺 素 2 天 後, 觀 察 牛 隻 發 情, 牛 隻 發 情 後 間 隔 12 小 時, 進 行 人 工 授 精 2~3 次 最 後 一 次 授 精 起 第 7 日, 以 法 式 沖 胚 器 具 (ZA135, IMV INT L CORP., USA) 進 行 非 外 科 胚 採 集 術 前 以 直 腸 觸 診 的 方 式, 檢 查 並 記 錄 兩 邊 卵 巢 上 的 黃 體 數, 並 由 卵 巢 黃 體 數 較 多 的 一 側 子 宮 角 先 行 沖 集 ; 每 側 子 宮 角 以 400 ml 沖 集 液 分 三 次 沖 集 ( 第 一 次 及 第 二 次 各 為 150 ml, 第 三 次 為 100 ml) 並 於 立 體 顯 微 鏡 (SMZ800, Nikon, Japan) 下 回 收 沖 集 液 中 之 牛 胚, 鏡 檢 後 將 品 質 屬 於 一 級 及 二 級 之 牛 胚 冷 凍 保 存 Putney et al. (1988) 依 據 胚 細 胞 形 態 學 將 胚 的 品 質 分 等 級 :( ) 優 級, 發 育 完 好 的 胚 ( ) 良 級, 有 些 許 擴 張 開 來 的 細 胞 ( ) 普 通 級, 有 稍 明 顯 擴 張 開 來 的 細 胞 或 些 許 的 退 化 細 胞 ( ) 劣 級, 部 分 的 退 化 細 胞 ( ) 極 劣 級, 極 度 擴 張 或 退 化 的 細 胞 ( ) 未 受 精 卵

3 楊 德 威 蕭 宗 法 謝 昭 賢 王 治 華 沈 朋 志 李 善 男 劉 炳 燦 185 本 試 驗 依 據 胚 細 胞 形 態 學 將 胚 品 質 屬 於 優 級 者, 歸 類 於 一 級 胚 ; 胚 品 質 屬 於 良 級 者, 或 普 通 級 經 體 外 培 養 發 育 良 好 者 歸 類 於 二 級 胚, 而 普 通 級 經 體 外 培 養 發 育 不 佳 者, 不 予 以 冷 凍 (Putney et al., 1988) Putney et al. (1988) 依 據 胚 的 發 育 階 段 分 為 :( ) 小 於 8 細 胞 ( )9-16 細 胞 ( ) 早 期 桑 椹 胚 (morula) ( ) 發 育 完 整 的 桑 椹 胚 ( ) 早 期 囊 胚 ( ) 囊 胚 一 般 屬 於 - 發 育 階 段 的 胚, 可 以 進 行 冷 凍 保 存, 作 為 可 移 置 胚 早 期 桑 椹 胚 則 於 體 外 培 養 1-2 天, 若 發 育 情 形 良 好 者, 亦 可 供 作 可 移 置 胚 Ⅲ. 沖 洗 液 配 製 以 mpbs(modified phosphate-buffered saline) 溶 液 為 沖 洗 液,2000 ml 沖 洗 液 配 製 之 步 驟 : ( ) 取 Dulbecoo s phosphate-buffered saline (DPBS, Invitrogen Corporation, USA) 19.2 g 溶 於 1800 ml 滅 菌 去 離 子 蒸 餾 水 中 ( ) 取 calcium chloride(sigma-aldrich Inc., USA) 0.2 g 溶 於 20 ml 滅 菌 去 離 子 蒸 餾 水 中 ( ) 將 上 述 兩 項 溶 液 攪 拌 混 合 ( ) 加 入 penicillin units (Sigma-Aldrich Inc., USA) streptomycin sulfate units (Sigma-Aldrich Inc., USA) 酚 紅 0.010g(Sigma-Aldrich Inc., USA) 及 胎 犢 血 清 (Fetal Bovine Serum, Invitrogen Corporation, USA)20 ml ( ) 以 滅 菌 去 離 子 蒸 餾 水 定 量 至 2000 ml 調 整 ph 7.0(Ryan et al., 1993) Ⅳ. 胚 之 冷 凍 牛 胚 冷 凍 前, 先 將 胚 置 於 含 1.5 M 之 乙 基 乙 二 醇 (ethylene glycol, EG, Sigma-Aldrich Inc., USA) 20% 胎 犢 血 清 及 0.1 M sucrose(sigma-aldrich Inc., USA) 之 DPBS 溶 液 中 平 衡 ( 平 衡 約 10 分 鐘 左 右 ) 然 後 以 0.25 ml 之 塑 膠 麥 管 (straw) 將 牛 胚 及 冷 凍 溶 液 吸 入 特 定 位 置, 胚 之 兩 側 並 各 以 一 小 段 空 氣 與 Medium-199( 含 20% 胎 犢 血 清 ) 之 溶 液 隔 開, 此 等 每 管 裝 有 一 個 牛 胚 之 塑 膠 麥 管 經 以 封 口 粉 封 口 後, 準 備 進 行 胚 之 降 溫 處 理 於 進 行 牛 胚 冷 凍 操 作 之 前, 預 先 將 程 式 控 制 冷 凍 降 溫 儀 (West-2050, Firstek Scientific, Taiwan) 開 機, 使 溫 度 降 至 -6 備 用 牛 胚 冷 凍 之 降 溫 方 式 係 先 將 包 裝 好 之 含 胚 麥 管, 放 入 程 式 控 制 冷 凍 降 溫 儀 內 之 -6 酒 精 液 面 之 下, 維 持 5 分 鐘, 然 後 進 行 植 冰 (seeding) 植 冰 之 進 行 係 以 一 先 前 置 於 液 態 氮 中 預 冷 之 不 銹 鋼 鑷 子, 直 接 於 酒 精 液 面 之 下 夾 住 麥 管 壁 之 特 定 部 位, 持 續 數 秒 鐘 後 即 可 見 冰 粒 開 始 形 成, 並 漸 漸 往 下 擴 展 植 冰 完 成 後 之 含 胚 麥 管 仍 被 維 持 於 該 植 冰 溫 度 (-6 )5 分 鐘, 其 後 以 每 分 鐘 下 降 0.5 的 速 率, 直 到 溫 度 降 到 -32 後, 即 可 將 麥 管 直 接 置 入 液 態 氮 (-196 ) 中 保 存 ( 宋,1999) Ⅴ. 胚 移 置 於 熱 季 (5-10 月 ) 選 擇 發 情 後 第 7 日 之 母 牛 女 牛 採 一 步 驟 之 方 法 (Voelkel and Hu, 1992) 進 行 冷 凍 胚 解 凍 與 直 接 胚 移 置 亦 即 將 麥 管 自 液 態 氮 中 取 出 後, 於 空 氣 中 停 留 5 秒, 再 浸 置 於 25 溫 水 中, 解 凍 25 秒 將 麥 管 取 出 並 拭 乾, 再 以 圓 形 剪 剪 開 封 口 後, 將 麥 管 裝 入 移 胚 器 (ZA035, IMV INT L CORP., USA) 中 並 儘 速 將 胚 移 置 於 牛 隻 子 宮 角 內 胚 移 置 前, 先 以 直 腸 觸 診 的 方 式, 確 認 受 胚 牛 之 卵 巢 黃 體 發 育 情 形 良 好 胚 移 置 為 利 用 非 外 科 移 胚 法, 將 移 胚 器 順 沿 受 胚 牛 陰 道 通 過 子 宮 頸 (cervix) 進 入 具 卵 巢 黃 體 之 側 的 子 宮 角 末 端, 隨 即 將 胚 注 入, 移 出 移 胚 器 完 成 胚 移 置 的 操 作 胚 移 置 50 ± 5 天 後 以 直 腸 觸 診 方 式 進 行 牛 隻 懷 孕 診 斷 Ⅵ. 資 料 分 析 利 用 SAS(1999) 電 腦 套 裝 軟 體 進 行 統 計 分 析, 以 平 均 值 ± 標 準 偏 差 (mean ± SD) 表 示 之 ; 以 單 因 子 變 異 數 分 析 (analysis of variance; ANOVA) 比 較 初 產 與 經 產 牛 及 牛 隻 胖 瘦 度 對 其 胚

4 186 涼 季 採 集 之 冷 凍 胚 移 置 改 善 荷 蘭 乳 牛 熱 季 懷 孕 率 收 集 數 胚 品 質 之 差 異 顯 著 性, 並 以 卡 方 分 析 比 較 受 胚 母 牛 及 女 牛 懷 孕 率 之 差 異 顯 著 性 結 果 與 討 論 本 試 驗 於 2002 年 11 月 至 2003 年 4 月 及 2003 年 11 月 至 2004 年 4 月, 共 進 行 母 牛 超 級 排 卵 50 頭 次, 進 行 非 外 科 胚 採 集 乳 牛 42 頭 次, 共 收 集 牛 胚 275 個 其 中 可 供 冷 凍 進 行 移 置 之 胚 數 141 個, 包 括 一 級 胚 110 個 及 二 級 胚 31 個, 佔 總 胚 數 的 51.3%(141/275); 退 化 胚 89 個 及 未 受 精 45 個, 佔 總 收 集 胚 數 的 48.7%(134/275) 每 頭 母 牛 收 集 到 可 移 置 胚 數 平 均 為 3.4 個 涼 季 期 間 初 產 與 經 產 牛 的 胚 收 集 數 與 胚 品 質 情 形 如 表 1 所 示 因 初 產 與 經 產 牛 個 體 上 的 差 異, 胚 收 集 的 結 果 變 異 亦 大 ; 且 因 初 產 與 經 產 牛 於 組 內 頭 數 不 均 (8 頭 vs. 34 頭 ), 在 胚 收 集 數 或 胚 品 質 方 面, 本 試 驗 無 法 檢 測 出 組 間 的 差 異 性 表 1. 涼 季 期 間 初 產 與 經 產 牛 的 胚 回 收 數 與 胚 品 質 Table 1. Distributions of the number of embryos recovered and morphological quality distribution from primiparous and multiparous cows in the cool season Cows Corpus luteum Embryos recovered Excellent + Good Retarted + Unfertilized Primiparous cows (n=8) * 9.8 ± ± ± ± 2.8 Multiparous cows (n=34) 12.2 ± ± ± ± 4.4 *mean ± SD. 涼 季 期 間, 不 同 胖 瘦 度 評 分 牛 隻 之 收 集 胚 與 胚 品 質 情 形 如 表 2 所 示 由 資 料 顯 示 黃 體 數 隨 母 牛 BCS 值 的 增 加 而 有 逐 漸 增 加 的 趨 勢 (P>0.05), 惟 因 牛 隻 個 體 上 的 差 異, 不 同 的 胖 瘦 度 評 分 之 母 牛 於 胚 收 集 的 結 果 變 異 亦 大 ; 且 因 不 同 的 胖 瘦 度 評 分 組 內 之 頭 數 不 均, 如 : BCS 值 有 8 頭 有 28 頭 有 6 頭, 因 此 胚 收 集 數 或 胚 品 質 方 面, 組 間 無 法 於 5% 顯 著 水 準 下 檢 測 出 差 異 性 (P>0.05) 表 2. 涼 季 期 間 不 同 胖 瘦 度 評 分 母 牛 的 胚 回 收 數 與 胚 品 質 Table 2. Distributions of the number of embryos recovered and morphological quality distribution from the donor cows with different body condition score in the cool season Body condition score (n=8) (n=28) (n=6) *mean ± SD. Corpus luteum Embryos Retarted + Excellent + Good recovered Unfertilized *11.0 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 3.1

5 楊 德 威 蕭 宗 法 謝 昭 賢 王 治 華 沈 朋 志 李 善 男 劉 炳 燦 187 所 收 集 的 可 移 置 胚 共 141 個, 均 予 以 冷 凍, 保 存 於 -196 的 液 態 氮 中 於 涼 熱 季 期 間, 共 移 置 冷 凍 胚 59 頭 次, 每 頭 牛 均 移 置 一 個 胚 ; 其 中 35 頭 受 胚 牛 回 復 發 情, 另 24 頭 經 直 腸 觸 診 確 認 懷 孕, 總 計 懷 孕 率 為 40.7%(24/59) 其 中 涼 季 (11-4 月 ) 母 牛 及 女 牛 共 移 置 28 頭, 懷 孕 11 頭 ( 母 牛 懷 孕 5 頭 ; 女 牛 懷 孕 6 頭 ), 懷 孕 率 39.3%(11/28), 分 娩 仔 牛 7 頭 (7/11), 懷 孕 損 失 部 分 母 牛 2 頭 流 產 1 頭 母 牛 因 傷 重 無 法 起 立 而 流 產, 女 牛 1 頭 早 死 產 熱 季 (5-10 月 ) 移 置 31 頭, 懷 孕 13 頭 ( 母 牛 懷 孕 4 頭 ; 女 牛 懷 孕 9 頭 ), 懷 孕 率 41.9%(13/31), 分 娩 仔 牛 10 頭 (10/13), 懷 孕 損 失 的 部 分 母 牛 1 頭 流 產, 女 牛 2 頭 流 產 受 胚 母 牛 及 女 牛 之 懷 孕 率 於 涼 熱 季 期 間, 經 檢 測 組 間 並 無 差 異 性 (P>0.05) 涼 季 期 間 受 胚 母 牛 懷 孕 率 35.7%(5/14), 受 胚 女 牛 懷 孕 率 42.9%(6/14) 熱 季 期 間 受 胚 母 牛 懷 孕 率 30.8%(4/13), 受 胚 女 牛 懷 孕 率 50.0%(9/18) 受 胚 母 女 牛 之 懷 孕 率, 經 檢 測 並 無 差 異 性 (P>0.05), 母 牛 女 牛 為 受 胚 牛 於 涼 熱 季 進 行 胚 移 置 結 果 如 表 3 所 示 表 3. 母 牛 與 女 牛 於 涼 熱 季 進 行 胚 移 置 結 果 Table 3. Conception rate of cow and heifer after embryo transfer in the hot and cool seasons Hot season Cool season Cow Heifer Cow Heifer Conception rate % (no. of conception/no. of recipient) 30.8 (4/13) 50.0 (9/18) 35.7 (5/14) 42.9 (6/14) 將 涼 季 時 所 收 集 的 牛 胚, 於 熱 季 時 移 置 於 受 熱 緊 迫 之 牛 隻, 為 胚 移 置 好 處 之 一 (Rutledge, 2001) 本 試 驗 主 要 於 涼 季 進 行 荷 蘭 母 牛 超 級 排 卵 及 胚 的 收 集, 於 熱 季 (5-10 月 ) 選 擇 母 牛 女 牛 為 受 胚 牛, 於 發 情 後 第 7 日 進 行 胚 移 置 母 牛 女 牛 於 熱 季 進 行 胚 移 置 試 驗 相 較 於 同 場 同 期 間 觀 察 發 情 而 人 工 授 精 的 繁 殖 管 理 資 料 顯 示, 胚 移 置 於 受 胚 母 牛 之 懷 孕 率 為 30.8%, 觀 察 發 情 而 人 工 授 精 懷 孕 率 為 13.6%; 胚 移 置 於 受 胚 女 牛 之 懷 孕 率 為 50.0%, 觀 察 發 情 而 人 工 授 精 懷 孕 率 為 44.9% 由 試 驗 結 果 顯 示, 荷 蘭 乳 牛 應 用 胚 移 置 的 方 式 似 有 越 過 授 精 後 0-7 天 牛 胚 對 熱 的 敏 感 期 之 效 果 乳 牛 的 卵 及 早 期 分 裂 階 段 的 胚 對 熱 緊 迫 是 相 當 敏 感 及 脆 弱 的, 但 當 超 過 3 日 齡 的 胚 是 有 較 高 的 忍 受 度 (Edwards and Hansen, 1997; Ealy et al., 1993; Putney et al., 1988) 熱 緊 迫 危 害 胚 生 長 發 育 的 機 制, 似 乎 是 多 重 因 子 影 響 所 造 成 的 結 果, 夏 季 期 間 泌 乳 牛 暴 露 於 高 溫 環 境 下, 使 直 腸 溫 度 上 升, 而 影 響 到 胚 的 生 長 發 育 直 腸 溫 度 上 升 所 反 映 的 母 體 受 熱 緊 迫, 很 可 能 是 危 害 胚 生 長 發 育 的 主 要 因 子 (Rivera and Hansen, 2001) 報 告 指 出 胚 發 育 對 熱 緊 迫 最 敏 感 的 時 期, 為 開 始 分 裂 到 形 成 囊 胚 之 間 (Dutt, 1963 ; Alliston et al., 1961) Putney et al. (1988) 利 用 荷 蘭 種 女 牛 (n=29) 研 究 熱 緊 迫 對 胚 受 精 後 7 天 的 影 響, 將 女 牛 置 於 20 環 境 氣 候 室 9 天, 自 動 情 週 期 第 9 天 開 始 進 行 超 級 排 卵 處 理, 女 牛 於 發 情 後 進 行 人 工 授 精, 牛 隻 在 開 始 發 情 的 第 30 小 時 置 於 適 溫 環 境 (20 ) 或 熱 緊 迫 ( 每 天 暴 露 在 30,16 小 時 及 42 下,8 小 時 )7 天 發 情 後 第 7 天 以 非 外 科 手 術 收 集 胚 及 由 形 態 學 評 估 胚 發 育 的 階 段 和 品 質 結 果 顯 示, 熱 緊 迫 女 牛 無 論 在 胚 品 質, 或 在 胚 分 級 歸 類 於 好 至 優 良 等 級 的 百 分 率 (23.2% vs 57.3%) 皆 極 顯 著 低 於 對 照 組 (P<0.001) 由 熱 緊 迫 女 牛 所 收 集 的 胚 歸 類 為 早 期 發 育 階 段 之 退 化 胚, 顯 著 多 於 由 對 照 組 所 收 集 的 胚 (P<0.05) 由 熱 緊 迫 女 牛 所 收 集 的 胚, 估 計 的 平 均 細 胞 數 亦 極 顯 著 少 於 對 照 組 的 胚 (P<0.001) 由 正 常 胚 畸 形 胚 退 化 胚 及 未 受 精 卵 來 分 類, 熱 緊 迫 處 理 組 與 對 照 組 間 有 極 顯 著 的 差 異 (P<0.001) 由 熱 緊 迫

6 188 涼 季 採 集 之 冷 凍 胚 移 置 改 善 荷 蘭 乳 牛 熱 季 懷 孕 率 女 牛 收 集 的 82 個 胚, 只 有 20.7% 正 常 胚, 相 較 於 由 對 照 組 女 牛 收 集 的 68 個 胚, 則 有 51.5% 正 常 胚, 顯 示 由 發 情 開 始 後 的 30 小 時 至 7 天 的 熱 緊 迫 增 加 超 級 排 卵 的 女 牛, 有 更 多 不 正 常 延 遲 發 育 的 胚 牛 隻 受 孕 最 初 的 2 天, 因 母 體 受 熱 緊 迫, 使 輸 卵 管 子 宮 溫 度 的 升 高 而 直 接 改 變 受 熱 緊 迫 胚 之 代 謝 能 力, 導 致 多 數 的 胚 發 育 延 遲 或 被 吸 收 彼 等 以 新 鮮 胚 移 置 的 田 間 試 驗 之 結 果, 顯 示 有 高 比 例 的 胚 損 失 發 生 在 7 小 時 至 7 天 之 間 同 樣 亦 有 報 告 指 出, 牛 隻 授 精 後 的 前 幾 天, 直 腸 和 子 宮 溫 度 的 上 升, 會 增 加 畸 形 胚 的 比 率, 而 減 低 牛 隻 懷 孕 率 (Gwazdauskas et al., 1973 ; Dunlap and Vincent, 1971 ; Ulberg and Burfening, 1967); 泌 乳 牛 在 熱 緊 迫 環 境 下, 造 成 大 多 數 胚 發 育 的 前 7 天 早 期 死 亡 (Putney et al., 1988 ; Monty and Racowsky, 1987) 綜 合 上 述, 對 於 熱 緊 迫 造 成 乳 牛 的 低 懷 孕 率, 胚 早 期 死 亡 是 一 個 主 要 因 子 李 等 (1993) 比 較 國 產 荷 蘭 乳 牛 新 鮮 胚 冷 凍 胚 及 美 國 進 口 冷 凍 胚 於 國 內 各 酪 農 場 進 行 胚 移 置 後 之 懷 孕 率, 試 驗 結 果 新 鮮 胚 之 懷 孕 率 為 30%(6/20), 而 冷 凍 胚 為 32.5%(13/40) Putney et al. (1989) 及 Drost et al. (1999) 於 熱 緊 迫 下, 利 用 新 鮮 胚 與 冷 凍 胚 進 行 胚 移 置 與 人 工 授 精 之 懷 孕 率 比 較 分 別 為 29.2% vs. 13.5% 與 35.4 vs. 24.1% 顯 示 收 集 非 熱 緊 迫 ( 涼 季 ) 供 胚 牛 的 胚, 移 置 於 發 情 後 7 天 之 熱 緊 迫 受 胚 牛, 似 可 越 過 胚 初 期 發 育 對 熱 的 敏 感, 增 加 熱 緊 迫 乳 牛 的 懷 孕 率 胚 移 置 的 操 作 中, 胚 本 身 之 品 質 新 鮮 或 冷 凍 冷 凍 貯 存 之 條 件 經 產 牛 同 期 化 發 情 移 置 方 法 及 經 產 牛 的 營 養 狀 況 等 因 子, 均 直 接 影 響 受 胚 牛 之 懷 孕 率 (Sreenan et al., 1987) Lindner et al. (1983) 由 胚 外 觀 評 鑑 胚 品 質 為 特 優 優 良 中 等 及 下 等 四 級 經 進 行 胚 移 置 後, 懷 孕 率 分 別 為 45% 44% 27% 及 20%, 顯 示 胚 品 質 之 優 劣 幾 乎 可 視 為 胚 移 置 成 功 與 否 的 主 要 指 標 彼 等 亦 指 出 受 胚 牛 動 情 週 期 之 日 數 與 胚 發 育 階 段 之 同 期 化 的 配 合, 較 單 純 供 胚 牛 與 受 胚 牛 之 同 期 化 發 情 來 得 重 要 冷 凍 胚 的 應 用, 雖 具 有 方 便 性, 但 冷 凍 胚 之 製 備 與 解 凍 技 術, 以 及 胚 之 品 質 優 劣 評 鑑 仍 是 提 高 置 入 胚 成 功 懷 孕 率 之 要 件 ( 李 等,1993) 結 論 涼 季 期 間 初 產 與 經 產 母 牛 或 不 同 的 胖 瘦 度 評 分 之 母 牛, 因 牛 隻 個 體 上 的 差 異, 胚 收 集 的 結 果 變 異 亦 大 ; 且 因 組 內 頭 數 不 均, 無 論 在 胚 收 集 數 或 胚 品 質 方 面, 組 間 並 無 顯 著 差 異 性 受 胚 母 牛 之 懷 孕 率 於 涼 熱 季 期 間 分 別 為 35.7% 和 30.8%, 兩 者 間 並 無 顯 著 差 異 ; 受 胚 女 牛 之 懷 孕 率 於 涼 熱 季 期 間 分 別 為 42.9% 和 50%, 兩 者 間 無 顯 著 差 異 同 期 母 牛 女 牛 於 熱 季 觀 察 發 情 而 人 工 授 精, 母 牛 懷 孕 率 為 13.6%, 女 牛 懷 孕 率 44.9% 顯 示 收 集 非 熱 緊 迫 ( 涼 季 ) 供 胚 牛 的 胚, 移 置 於 發 情 後 7 天 之 熱 緊 迫 受 胚 母 牛, 似 可 越 過 胚 初 期 發 育 對 熱 的 敏 感, 提 高 熱 緊 迫 乳 牛 的 懷 孕 率 誌 謝 謝 本 試 驗 承 本 所 生 理 組 許 義 明 產 業 組 黃 金 山 及 蔡 新 興 先 生 的 協 助, 試 驗 得 以 順 利 完 成, 謹 此 誌

7 楊 德 威 蕭 宗 法 謝 昭 賢 王 治 華 沈 朋 志 李 善 男 劉 炳 燦 189 參 考 文 獻 李 善 男 蕭 振 文 徐 炘 松 楊 振 榮 許 登 造 1993 乳 牛 胚 之 移 置 研 究 (Ⅱ) 新 鮮 胚 及 冷 凍 胚 之 田 間 應 用 畜 產 研 究 26(4): 宋 麗 英 1999 牛 胚 體 外 生 產 技 術 之 開 發 及 其 在 基 因 轉 殖 研 究 之 應 用 國 立 台 灣 大 學 畜 牧 學 研 究 所 碩 士 論 文 蕭 宗 法 1987 涼 熱 兩 季 內 乳 用 經 產 牛 生 殖 周 期 中 類 固 醇 內 泌 素 之 變 化 國 立 台 灣 大 學 畜 牧 學 研 究 所 碩 士 論 文 Alliston, G. W. and L. C. Ulberg Early pregnancy loss in sheep at ambient temperatures of 70 and 90 as determined by embryo transfer. J. Anim. Sci. 20: Drost, M., J. D. Ambrose, M. J. Thatcher, C. K. Cantrell, K. E. Wolfsdorf, J. F. Hasler and W. W. Thatcher Conception rates after artificial insemination or embryo transfer in lactating dairy cows during summer in Florida. Theriogenology 52: Dunlap, S. E. and C. K. Vincent Influence of postbreeding thermal stress on conception rate in beef cattle. J. Anim. Sci. 32: Dutt, R. H Critical period for early embryo mortality in ewes exposed to high ambient temperature. J. Anim. Sci. 22: Ealy, A. D., M. Drost and P. J. Hansen Developmental changes in embryonic resistance to adverse effects of maternal heat stress in cows. J. Dairy Sci. 76: Edwards, J. L. and P. J. Hansen Differential responses of bovine oocytes and preimplantation embryos to heat shock. Mol. Reprod. Dev. 46: Gwazdauskas, F. C., W. W. Thatcher and C. J. Wilcox Physiological, environmental, and hormonal factors at insemination which may affect conception. J. Dairy Sci. 56: Hansen, P. J., M. Drost, R. M. Rivera, F. F. Paula-Lopesa, Y. M. Al-Katanania, C. E. Krininger III and C. C. Chase, Jr Adverse impact of heat stress on embryo production: causes and strategies for mitigation. Theriogenology 55: Lindner, G. M. and R. W. Wright Bovine embryo morphology and evaluation. Theriogenology 20: Monty, D. E. and C. Racowsky In vitro evaluation of early embryo viability and development in summer heat-stressed superovulated dairy cows. Theriogenology 28: Pryce, J. E., M. P. Coffey and G. Simm The Relationship Between Body Condition Score and Reproductive Performance. J. Dairy Sci. 84: Putney, D. J., M. Drost and W. W. Thatcher Embryonic development in superovulated dairy cows exposed to elevated ambient temperatures between Days 1 to 7 post insemination. Theriogenology 30: Putney, D. J., M. Drost and W. W. Thatcher Influence of heat stress on pregnancy rates of lactating dairy cattle following embryo transfer or artificial insemination. Theriogenology 31: Rivera, R. M. and P. J. Hansen Development of cultured bovine embryos after exposure to increased temperatures in the physiological range. Reproduction 121: Rutledge, J. J Use of embryo transfer and IVF to bypass effects of heat stress. Theriogenology 55:

8 190 涼 季 採 集 之 冷 凍 胚 移 置 改 善 荷 蘭 乳 牛 熱 季 懷 孕 率 Ryan, D. P., J. F. Prichard, E. Kopel and R. A. Godke Comparing early embryo mortality in dairy cows during hot and cool seasons of the year. Theriogenology 39: SAS SAS User s Guide: Statistics, 6.12 ed., SAS Inst., Cary, NC. USA. Sreenan, J. M. and M. G. Diskin Factors affecting pregnancy rate following embryo transfer in the cow. Theriogenology 27: Ulberg, L. C. and P. J. Burfening Embryo death resulting from adverse environment on spermatozoa or ova. J. Anim. Sci. 26: Voelkel, S. A. and Y. X. Hu Direct transfer of frozen-thawed bovine embryo. Theriogenology 37:

9 楊 德 威 Taiwan 蕭 宗 法 Livestock 謝 昭 賢 Res. 王 治 41(3):183~192, 華 沈 朋 志 李 善 2008 男 劉 炳 燦 191 Improvement of conception rate of Holstein cows in summer by transfer of embryos fertilized in cool seasons (1) Der-Wei Yang (2) Tzong-Faa Shiao (2) Chao-Hsien Hsieh (2) Chih-Hua Wang (3) Perng-Chin Shen (4) Shan-Nan Lee (5) and Bing-Tsan Liu (4)(6) Received : Aug. 30, 2007 ; Accepted : Mar. 14, 2008 Abstract In summer, high temperature and humidity environment significantly decrease the conception rate of Holstein cows in Taiwan. This study aimed to improve the summer conception rate of cows by transferring the frozen embryos collected from the cool season. A total of 275 embryos were collected from 42 donors by super-ovulation and non-surgical flushing process from Nov. to April in 2003 and Excellent embryos (110, 40%) and good embryos (31, 11.3%) were frozen and transferred to both heifers and cows in the next year. Meanwhile, summer conception rate from traditional heat detection and artificial insemination (AI) of the same herd were recorded for comparison. The results indicated that average number of transferable embryos collected per cow was 3.4, with no significant difference between the primiand multiparous cows. A total of 59 cows undergoing embryo transfer process had conception rates up to 40.7%. There was no seasonal effect. Conception rate in cool (Jan. to April) and summer season (May to Oct.) were 39.3% (11/28) and 41.9% (13/31), respectively. Parity effect was also not influential, conception rate of cows and heifers were 33.3% (9/27) and 46.9% (15/32), respectively. However, summer conception rate was improved by embryo transfer when compared with AI program. Conception rates for cows of both programs were 30.8% (4/13) and 13.6% (6/44), respectively, indicating a 226% improvement, and for heifers: 50.0% (9/18) and 44.9% (22/49), respectively. In conclusion, both season and parity would not affect the conception rate of embryo-transferred dairy cows. Transferring cool-season embryos to dairy cows in hot season could be an effective strategy to improve the reproduction performance. Key words : Conception rate, Dairy cows, Frozen embryo transfer, Hot season.

10 192 涼 Taiwan 季 採 集 之 Livestock 冷 凍 胚 移 Res. 置 改 41(3):183~192, 善 荷 蘭 乳 牛 熱 季 懷 2008 孕 率 (1) Contribution No from Livestock Research Institute, Council of Agriculture, Executive Yuan. (2) Animal Industry Division, COA-LRI, Hsinhua, Tainan, Taiwan 712, R.O.C. (3) Kaohsiung Animal Propagation Station, COA-LRI, Pingtung, Taiwan, R.O.C. (4) Department of Animal Science, National Pingtung University of Science and Technology, Pingtung, Taiwan, R.O.C. (5) Livestock Research Institute, COA, Hsinhua, Tainan, Taiwan 712, R.O.C. (6) Corresponding author,