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1 分 析 检 测 食 品 科 学 204, Vol.35, No 限 制 性 内 切 酶 酶 切 确 证 河 豚 鱼 成 分 PCR 检 测 结 果 曲 良 苗,2,3,, 陈 文 炳 *, 缪 婷 玉,3, 邵 碧 英,3, 彭 娟,3,3, 江 树 勋 (. 福 建 出 入 境 检 验 检 疫 局 检 验 检 疫 技 术 中 心, 福 建 福 州 35000;2. 福 建 农 林 大 学 食 品 科 学 学 院, 福 建 福 州 );3. 福 建 省 检 验 检 疫 技 术 研 究 重 点 实 验 室, 福 建 福 州 35000) 摘 要 : 动 植 物 成 分 的 聚 合 酶 链 式 反 应 (polymerase chain reaction,pcr) 检 测 往 往 出 现 假 阳 性 结 果, 为 了 有 效 排 除 河 豚 鱼 成 分 检 测 中 出 现 的 假 阳 性 现 象, 提 高 检 测 结 果 的 准 确 性, 应 用 河 豚 鱼 PCR 检 测 引 物 进 行 河 豚 鱼 成 分 的 PCR 检 测 与 限 制 性 内 切 酶 NmeA Ⅲ 酶 切 确 证 实 验 8 个 供 试 样 品 中 3 个 样 品 无 PCR 扩 增 产 物, 判 为 阴 性 结 果,5 个 样 品 初 步 判 为 疑 似 阳 性 应 用 限 制 性 内 切 酶 NmeA Ⅲ 对 疑 似 阳 性 样 品 的 PCR 产 物 进 行 酶 切 与 电 泳 分 析, 电 泳 图 谱 与 河 豚 鱼 阳 性 对 照 不 同 的 2 个 样 品, 判 定 为 假 阳 性 结 果, 电 泳 图 谱 与 阳 性 对 照 相 同 的 4 个 未 知 学 名 的 河 豚 鱼 加 工 样 品, 确 证 为 阳 性 结 果, 即 检 出 河 豚 鱼 成 分,PCR 产 物 序 列 经 GenBank 同 源 性 序 列 查 询 比 对 (BLAST) 予 以 验 证, 建 立 了 简 便 的 河 豚 鱼 成 分 PCR 检 测 结 果 确 证 方 法 关 键 词 : 河 豚 鱼 ;PCR 检 测 ; 限 制 性 内 切 酶 ;DNA 测 序 ; 结 果 确 证 Confirmation of PCR Results for Puffer Fish Components by Restriction Endonuclease Digestion QU Liang-miao,2, CHEN Wen-bing,3, *, MIAO Ting-yu,3, SHAO Bi-ying,3, PENG Juan,3, JIANG Shu-xun,3 (. Technical Center of Inpsection and Quarantine, Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 35000, China; 2. College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou , China; 3. Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research, Fuzhou 35000, China) Abstract: False positive results frequently happen in PCR detection of animal and plant components. In order to exclude the possibility of false positive results, restriction endonuclease digestion was used to confirm the results of PCR for puffer fish components. Eighteen samples were detected, of which 3 samples were sentenced to be negative whereas the remaining 5 samples were suspected positive based on PCR results. Restriction endonuclease (NmeA Ⅲ) digestion and agarose gel electrophoresis were used to analyze the PCR products of the suspected positive puffer fish component. The electrophoresis patterns of PCR fragments digested by NmeA Ⅲ were different from the positive results of puffer fish in 2 non-puffer fish samples, which were judged as false positive. The electrophoresis patterns of 4 samples of processed puffer fish with unknown scientific names agreed with those of the puffer fish positive samples and were therefore confirmed. The PCR products were verified by GenBank DNA sequence homology sequence query (BLAST). In conclusion, a simple method to confirm PCR results of puffer fish ingredients has been established in this study. Key words: puffer fish; polymerase chain reaction (PCR) detection; restriction endonuclease; DNA sequence; results confirmation 中 图 分 类 号 :S97.4;Q783. 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 : (204) doi:0.7506/spkx 自 980 年 代 聚 合 酶 链 式 反 应 (polymerase chain reaction,pcr) 技 术 发 明 以 来, 已 被 广 泛 应 用 于 食 品 中 的 动 植 物 成 分 鉴 别 [-8], 在 鱼 制 品 鱼 类 成 分 的 鉴 别 中 的 应 用 也 越 来 越 多 [9-],DNA 分 子 标 记 技 术 在 河 豚 鱼 种 类 鉴 别 及 遗 传 分 析 方 面 也 有 不 少 报 道 [2-22] 但 普 通 PCR 方 法 存 在 扩 增 结 果 出 现 假 阳 性 的 可 能, 如 果 PCR 扩 增 所 使 用 的 引 物 序 列 与 非 目 的 物 种 的 某 段 DNA 的 序 列 有 部 分 互 补 性, 就 会 扩 增 出 与 目 的 物 种 大 小 相 似 的 PCR 产 物, 仅 靠 凝 胶 电 泳 图 谱 判 断, 可 能 因 假 阳 性 结 果 而 产 生 误 判 [23], 因 此 有 必 要 采 取 确 证 措 施 加 以 排 除 目 前 常 用 的 PCR 检 测 结 果 的 确 证 方 法 主 要 有 DNA 限 制 性 内 切 酶 技 术 与 DNA 测 序 方 法 [24-25] 我 国 海 域 广 阔, 河 豚 鱼 种 类 繁 多, 鱼 类 加 工 食 品 中 因 混 有 河 豚 鱼, 使 得 消 费 者 误 食 而 中 毒 的 事 件 时 有 发 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 质 量 监 督 境 检 验 检 疫 总 局 科 技 计 划 项 目 (2008IK75; 203IK49) 作 者 简 介 : 曲 良 苗 (988 ), 女, 硕 士 研 究 生, 研 究 方 向 为 食 品 生 物 技 术 @qq.com * 通 信 作 者 : 陈 文 炳 (962 ), 男, 研 究 员, 博 士, 研 究 方 向 为 农 产 品 食 品 分 子 生 物 学 检 测 技 术 [email protected]

2 70 204, Vol.35, No.08 生 2007年发生了由于出口美国的鮟鱇鱼混有河豚鱼 表2 鱼源性成分与河豚鱼成分的PCR检测用的引物序列与退火温度 Table 2 导致顾客误食而中毒的事件 这些事件对我国食品出口 贸易造成负面影响 同年日本食品检验部门在我国南方 引物名称 引物序列 扩增片段长度/bp 退火温度/ FISH FISH F 5 - TAAGAGGGCCGGTAAAACTC-3 FISH R 5 - GTG GGGTATCTAATCCCAG HT- HT- F 5 -TGCCTCAACTACAAGAACCTAATGG-3 HT- R 5 -GGGAAGGACATAGCCCACGA-3 62 某食品有限公司出口的马面鲀鱼干中检出河豚鱼成分 为了保证消费者的健康与权益 保障水产加工制品的质 量与安全 急需一种能够在食品中快速检测出河豚鱼成 分的方法 本研究基于作者于20年建立的河豚鱼成分 检测PCR方法 [22]检测河豚鱼与其他样品 发现在金枪鱼 与鲈鱼中也能扩增出与河豚鱼DNA片段大小 接近的PCR产物 产生了假阳性结果 因此 本实验应用 限制性内切酶与DNA测序方法 分析了3 种河豚鱼样品 与2 种非河豚鱼 金枪鱼与鲈鱼 的PCR结果的差别 建 立了有效的排除假阳性结果的方法 并将PCR产物测序结 果在GenBank中进行DNA同源性查询比对 BLAST 加以 确证 为准确鉴定河豚鱼成分提供科学依据. 方法.3. DNA提取 PCR扩增 限制性内切酶消化 参照文献[2]优化确立的DNA提取CTAB方法与 PCR引物 扩增体系和温度程序 进行DNA提取 PCR扩增 PCR产物凝胶水平电泳与凝胶成像 每个 PCR重复3 次 按照产品使用说明书规定 在0 µl 的PCR产物中 加入2.0 µl 0 Cutsmart Buffer.0 µl限制性内切酶nmea Ⅲ 0.05 µl S-腺苷甲硫胺 水6.95 µl使总体积达到20 µl 在37 条件下消化 材料 9 个已知物种名称的河豚鱼样品 4 个种类的 河豚鱼样品 5 个非河豚鱼样品 表 搜集自福建省莆 田 厦门 福州等地水产养殖场 农贸市场和超市 表.3 酸 S-adenosylmethionine SMA 溶液 再加纯净 材料与方法 Table Primer sequences and annealing temperatures for PCR detection of fish components and puffer fish component 6 8 h 然后进行琼脂糖凝胶电泳与成像拍照.3.2 DNA碱基序列测定 PCR产物通过凝胶电泳后 检出阳性结果的PCR扩增 产物委托上海生工生物技术有限公司进行克隆 测序.3.3 序列比对与酶切位点确定 8 个河豚鱼及其他鱼类供试样品 应用DNAMAN 5.2.2版软件对各个样品PCR产 Eighteen samples of puffer fish and other fishes 序号 中文学名 拉丁学名 Lagocephalus inermis 黑鳃兔头鲀 Lagocephalus lagocephalus 2 兔头鲀 Takifugu fasciatus 3 暗纹东方鲀 Takifugu xanthopterus 4 黄鳍东方鲀 Gastrophysus spadiceus 5 棕斑腹刺鲀 Takifugu rubripes 6 红鳍东方鲀 Gastrophysus gloveri 7 暗鳍腹刺鲀 Gastrophysus lunaris 8 月腹刺鲀 Takifugu oblongus 9 横纹东方鲀 0 河豚鱼加工鲜肉 河豚鱼干 Lateolabrax japonicus 2 鲈鱼 3 河豚鱼干2 4 河豚鱼干3 Thunnus albacares 5 金枪鱼 Pseudosciaena crocea 6 大黄鱼 Muraenesox cinereus 7 鳗鱼 Trichiurus haumela 8 带鱼 来源 福建厦门 福州出口产品 物序列进行整理分析 结果以MASED Document/ DNAMAN格式输出 同时在GenBank中进行BLAST分 析 应用NEBcutter 2.0软件进行限制性内切酶NmeA Ⅲ 酶切位点分析 2 结果与分析 2. 鱼类内源基因PCR扩增 00 bp M CK bp M. DNA markerⅠ CK.空白对照 ddh2o.黑腮兔头鲀 2.兔头鲀 3.暗纹东方鲀 4.黄鳍东方鲀 5.棕斑腹刺鲀 6.红鳍东方鲀 7.暗鳍腹刺鲀 8.月腹刺鲀 9.横纹东方鲀 0.河豚鱼加工鲜肉.河豚鱼干 2.鲈鱼 3.河豚鱼干2.2 4.河豚鱼干3 5.金枪鱼 6.大黄鱼 7.鳗鱼 8.带鱼 试剂与引物 限制性内切酶NmeA Ⅲ 2000 U/mL 北京纽英 伦生物技术有限公司 其他参照文献[22] 按照文献[2] 由上海生工生物工程有限公司合成鱼 源性成分检测引物 FISH 与河豚鱼成分引物 HT- 图 8 种河豚鱼与非河豚鱼样品的鱼成分内源基因PCR扩增电泳图 Fig. PCR amplification results of 8 fish samples using primers targeting FISH components 通过样品的鱼类内源基因PCR扩增 监控DNA质 引物碱基序列 PCR产物片段长度与适合的退火温度 量 3 个河豚鱼样品与5 个非河豚鱼样品的鱼类特异性 Tm值 见表2 基因 线粒体DNA 的PCR扩增结果见图 8 个鱼类

3 204, Vol.35, No.08 7 样品均能扩增出大小为224 bp的鱼成分pcr产物 说明各 除2 个非河豚鱼的假阳性结果 图3A与图3B中所有疑似阳 样品的DNA提取是成功的 适合于PCR扩增 性样品的PCR产物酶切后残留PCR产物片段条带位置都高 2.2 于未经酶切处理的原PCR产物条带 出现该现象的原因是 河豚鱼特异基因PCR扩增 应用河豚鱼PCR检测引物 HT- 对3 个河豚鱼样 加入的限制性内切酶 蛋白 与DNA结合 使得分子质 品与5 个非河豚鱼样品提取的DNA进行河豚鱼线粒体特 异性基因 Cyt b PCR扩增 结果见图2 3 个河豚鱼 明 经内切酶消化酶切后切断的与未切断残留的DNA片 样品与2 个非河豚鱼样品 金枪鱼与鲈鱼 共5 个样品 段 因结合了内切酶 其大小都比实际的DNA片段大 检出PCR产物 为疑似阳性结果 另外3 种非河豚鱼类的 2.4 量比原来纯DNA片段更大 毛细管电泳结果 本文略 表 大黄鱼 鳗鱼 带鱼与空白对照 ddh 2O 均未扩增出 DNA条带 判为阴性结果 PCR产物的DNA序列与酶切位点分析 本实验所用的河豚鱼成分PCR检测正向引物25 个碱 基 反向互补20 个碱基 表2 结果正向引物有20 个 M 连续碱基 反向互补有0 个连续碱基与7 个连续碱基分 300 bp.黑腮兔头鲀 2.兔头鲀 3.暗纹东方鲀 4.黄鳍东方鲀 5.棕斑腹刺鲀 别与金枪鱼Cyt b部分片段序列两端互补 鲈鱼中也存在 类似情况 于是在2 个非河豚鱼样品中也能扩增出PCR产 物 出现假阳性现象. 6.红鳍东方鲀 7.暗鳍腹刺鲀 8.月腹刺鲀 9.横纹东方鲀 0.河豚鱼加工 鲜肉.河豚鱼干 2.鲈鱼 3.河豚鱼干2 4.河豚鱼干3 5.金枪鱼 6.大黄鱼 7.鳗鱼 8.带鱼 9.空白对照 ddh2o M. DNA markerⅠ 图2 Fig.2 引物HT-对河豚鱼成分的PCR扩增结果 PCR amplification results of 8 fish samples with HT- primers targeting puffer fishes component TGCCTCAACT ACAAGAACCT AATGGCCAGC CTACGCAAAT CGCATCCCCT CATGAAAATT 6 GTAAACGACA TAGTCATTGA TTTACCAACC CCCTCAAACA TCTCTGCATG GTGAAACTTT 2 GGCTCACTAC TAGGACTATG CCTTATCGCA CAAATCCTAA CAGGACTCTT CCTGGCAATA 8 CACTACACCT CTGATATTGC CACGGCCTTC TCCTCAGTCG CCCACATCTG CCGAGATGTC 24 AACTACGGCT GACTAATTCG AAACCTGCAT GCAAATGGAG CCTCCTTCTT CTTCATTTGT 30 ATTTACCTTC ATATTGGACG TGGCCTATAC TATGGCTCAT TCCTTAACAA AGAAACATGA 36 AACGTAGGAG TAATCCTCCT GCTCTTAGTA ATAGCCACAG CCTTCGTGGG CTATGTCCTT PCR产物酶切图谱分析 00 bp M bp CCC M Tthĉ PflFĉ SfaNĉ Hpy88ċ BspHĉ BtsCĉ Fokĉ Mscĉ Eaeĉ A B Bfaĉ Hphĉ NlaČ Mseĉ BseRĉ Mwoĉ *BmgBĉ BsaJĉ BspMĉ Btgĉ BfuAĉ Hpyl88ĉ Mslĉ BstNĉ Sphĉ Earĉ Nspĉ #ScrFĉ Taqĉ #StyD4ĉ #BssKĉ *BstBĉ NmeAċ #PspGĉ Hinfĉ HineĊ BspCNĉ Mlyĉ Pleĉ Xcmĉ 下划线部分与HT-引物 表2 部分同源 框 内 碱 基 G C C G A G + N 9 N N 为 酶 切 位 点 M. DNA markerⅠ 2.黑腮兔头鲀 3 4.兔头鲀 5 6.暗纹东 图4 河豚鱼 兔头鲀 Cyt b部分片段pcr产物碱基序列与限制性内 方鲀 7 8.黄鳍东方鲀 9 0.棕斑腹刺鲀 2.红鳍东方鲀 3 4.暗鳍腹刺鲀 5 6.月腹刺鲀 7 8.横纹东方鲀 9 20.河豚鱼加工鲜肉 2 22.河豚鱼干 鲈鱼 河豚 切酶NmeAⅢ酶切位点NEB cutter分析图 Fig.4 Partial sequences of the Cyt b gene of puffer fish and NmeAⅢ cleavage sites 鱼干 河豚鱼干 金枪鱼 奇数号泳道为酶切消化 后的产物电泳图谱 偶数号泳道为未经酶切的PCR产物电泳图谱 图3 Fig.3 PCR产物及其酶切结果电泳图谱 Electrophoresis patterns of PCR products of puffer fishes with and without restriction endonuclease digestion 应用NEB cutter 2.0软件对3 种河豚鱼与2 种非河 豚鱼 鲈鱼及金枪鱼 样品的PCR产物碱基序列进行 限制性内切酶酶切位点分析 结果表明 NmeA Ⅲ酶切 位点为5...GCCGAG N 2N...3 或3... CGGCTC N 9 5 个检出河豚鱼成分疑似阳性结果的样品PCR产物 N...5 河豚鱼样品的PCR产物均为 个碱基 仅出 及其经酶切消化后的产物电泳图谱见图3 图3A与图3B 中9 个已知学名与4 个学名的的河豚鱼样品 在奇数 示兔头鲀序列 其他种类河豚鱼DNA序列资料略 NmeA Ⅲ酶切位点都只有 个 图4 在5 端起的第 号泳道均检出酶切产物 各样品图谱相同 均有2 条新的 256/254碱基位置 被切成2 段 即电泳图出现的2 条 片段较小的条带 分别在300 bp与的下方 由图3B 新带 图3 大小为256/254 bp与67/69 bp 金枪 可知 23 24号泳道分别为鲈鱼酶切与未经酶切的PCR 鱼PCR产物为422 个碱基 NmeA Ⅲ酶切位点有2 个 图 产物 前者无新的条带出现 29 30号泳道为金枪鱼的 5 分别在5 端起的第339/337 碱基与252/250碱基的位 酶切与未经酶切的PCR产物 酶切的电泳图谱出现4 条新 的条带 图谱与河豚鱼明显不同 可见 应用限制性内 置 被切成4 段 大小为339/337 83/85 bp与252/250 70/72 bp 图3B 第29泳道 鲈鱼PCR产物为个碱 切酶NmeA Ⅲ酶切可以区别河豚鱼与非河豚鱼 进而排 基 其序列无NmeA Ⅲ限制性内切酶酶切位点 图6

4 72 204, Vol.35, No.08 NEB cutter 2.0软件无法生成酶切分析图 电泳结果无新条 DQ 同源性为99% 39/392 图8 可见 带出现 图3B 二者结果吻合 2 个非河豚鱼PCR产物不是河豚鱼成分 验证了限制性内 2 个非河豚鱼样品中也能扩增出与河豚鱼相似的 切酶NmeA Ⅲ的酶切结果 可有效排除假阳性误判 PCR产物 出现假阳性现象 原因是 河豚鱼成分PCR 检测所用的正向引物25 个碱基 反向互补20 个碱基 表 2 结果正向引物有20 个连续碱基 反向互补有0 个 连续碱基与7 个连续碱基分别与金枪鱼Cyt b部分片段序 列两端互补 鲈鱼中也存在类似情况 TCAACTACAA GAACCTAATG GCAAGCCTCC GAAAAACTCA CCCGCTACTA AAAATCGCTA 6 ACGACGCACT AGTTGACCTT CCTACCCCCT CTAATATCTC TGCATGATGA AACTTTGGCT 2 CACTACTTGG CCTTTGCCTT ATTTCTCAAA TCCTTACAGG ACTATTCCTC GCAATACACT 8 ACACCCCTGA TGTCGAATCA GCCTTCGCCT CAGTAGCCCA CATTTGCCGA GATGTCAACT 24 TCGGTTGACT CATCCGGAAC CTCCACGCAA ACGGGGCCTC TTTCTTCTTT ATCTGCATCT 30 ACTTCCACAT CGGCCGAGGA CTTTACTACG GCTCTTACCT ATACAAGGAA ACATGAAACA 36 TCGGAGTAGT ACTCCTACTC CTAGTTATGA TGACCGCCTT CGTGGGCTAG GGTTCCCTTC 42 CC 422 *Aciĉ Hpy88ĉ 图5 Nlaċ CviAĊ HpyCH4č Fatĉ *Hinfĉ *Aciĉ Hpy88ĉ Nlaċ CviAĊ Fatĉ NmeAċ NmeAċ HpyCH4č Hinfĉ 图7 金枪鱼Cyt b部分片段pcr产物碱基序列与限制性内切酶nmeaⅢ 酶切位点NEB cutter分析图 Partial sequences of the Cyt b gene of tuna and NmeAⅢ cleavage sites Fig.5 金枪鱼样品序列 Query 与GenBank数据库中的Thunnus albacares 金枪鱼 Cyt b基因部分序列 JN 比对结果图 Fig.7 BLAST results between sequences (Query) of tuna sample and partial sequences JN of the Cyt b gene of Thunnus albacares in GenBank CTACAAGAAC CTAATGGCAA GCCTTCGAAA AACCCACCCC CTACTAAAAA TCGCAAACGA 6 CGCACTAGTC GACCTCCCTG CCCCCTCAAA CATCTCAGTC TGATGAAATT TTGGTTCCCT 2 TCTTGGCCTT TGCTTGATTA CTCAAATCCT CACAGGGCTA TTCCTTGCAA TACACTACAC 8 CTCAGATGTT GCCACCGCCT TCTCGTCCGT GGCACATATT TGCCGCGACG TAAACTACGG 24 CTGACTAATT CGAAATGTTC ACGCCAACGG CGCATCCTTC TTCTTCATCT GCATTTACAT 30 ACATATTGGG CGGGGTCTTT ACTACGGCTC CTACCTTTAC AAAGAGACCT GAAACATCGG 36 AGTAGTCCTG CTCCTATTAA TTATAATGAC TGCCTTCGTG GGCTATTATC CCTTCCCACA 42 AAA Cac8ĉ Haeċ *HincĊ *8AccĉApoĉ *Salĉ *Hgaĉ *Drdĉ Bfaĉ Speĉ *Bcgĉ 图6 Fig BsaXĉ BsmAĉ Psiĉ *Fauĉ BcoDĉ Mseĉ Bsaĉ Aseĉ SfaNĉ *Hhaĉ BtsCĉ *HinPĉ Fokĉ *HpyCH4Č *BstUĉ *Fnu4Hĉ BsaJĉ Btgĉ 鲈鱼Cyt b部分片段pcr产物碱基序列 Partial sequences of the Cyt b gene of weever PCR产物碱基序列的GenBank查询比对与同源性分析 3 个河豚鱼样品与2 个非河豚鱼 金枪鱼与鲈鱼 图8 对 BLAST 结果表明 3 个河豚鱼的序列与GenBank 数据库中河豚鱼线粒体b基因 Cyt b 的部分序列 序 鲈鱼样品序列 Query 与GenBank中的鲈鱼 Lateolabrax japonicus Cyt b基因部分序列 DQ 比对结果图 样品的PCR产物碱基序列在GenBank数据库中进行查询比 Fig.8 BLAST results between sequences (Query) of weever sample and partial sequences (DQ35530.) of the Cyt b gene of Lateolabrax japonicus in GenBank 列号有多个 略 同源性在98% 00%之间 其中有 9 个样品为00% 3 个为99% 个为98% 金枪鱼与鲈 鱼的序列BLAST结果表明 金枪鱼序列422 个碱基中有 408 个与数据库中的Thunnus albacares 金枪鱼 Cyt b 3 结论与讨论 部分序列 JN 同源性为99% 408/40 普通PCR方法的缺陷之一是有时会出现假阳性现 图7 鲈鱼的序列 个碱基中有39 个与数据库 中的Lateolabrax japonicus 鲈鱼 Cyt b部分序列 象 除了实验环境与试剂可能受污染以及PCR反应退火 温度不恰当外 引物特异性不够强是主要原因 而引物

5 分 析 检 测 食 品 科 学 204, Vol.35, No 的 特 异 性 也 不 是 绝 对 的, 只 要 所 使 用 的 引 物 序 列 与 非 目 的 物 种 的 某 段 DNA 的 序 列 有 部 分 互 补 性, 就 会 扩 增 出 与 目 的 片 段 大 小 相 似 的 PCR 产 物, 凝 胶 电 泳 图 谱 与 阳 性 结 果 接 近 或 相 同, 肉 眼 无 法 判 别 而 出 现 假 阳 性 现 象 [23], 导 致 结 果 误 判 本 实 验 应 用 文 献 [2] 建 立 的 河 豚 鱼 成 分 ( 部 分 Cyt b 基 因 特 异 序 列 )PCR 检 测 方 法 检 测 3 个 河 豚 鱼 样 品 与 5 个 非 河 豚 鱼 样 品, 结 果 发 现, 在 金 枪 鱼 与 鲈 鱼 2 个 非 河 豚 鱼 样 品 中 也 能 扩 增 出 片 段 大 小 与 河 豚 鱼 接 近 或 相 同 的 PCR 产 物, 出 现 假 阳 性 现 象 目 前 常 用 的 排 除 PCR 检 测 假 阳 性 结 果 的 确 证 方 法 主 要 有 DNA 限 制 性 内 切 [24-25] 酶 技 术 与 DNA 测 序 方 法 [22], 本 研 究 应 用 这 两 种 方 法 对 河 豚 鱼 成 分 PCR 检 测 结 果 加 以 确 证 金 枪 鱼 及 鲈 鱼 的 PCR 产 物 碱 基 序 列 经 与 GenBank 数 据 库 DNA 序 列 比 对, 分 别 确 认 为 Thunnus albacares( 金 枪 鱼 ) 与 Lateolabrax japonicus( 鲈 鱼 ), 表 明 2 个 非 河 豚 鱼 PCR 产 物 不 是 河 豚 鱼 成 分, 验 证 了 NmeA Ⅲ 限 制 性 内 切 酶 酶 切 结 果, 可 见 该 方 法 可 用 于 河 豚 鱼 成 分 PCR 检 测 结 果 的 确 证 为 了 验 证 本 实 验 建 立 的 NmeA Ⅲ 限 制 性 内 切 酶 方 法 是 否 具 有 广 泛 的 适 用 性, 将 进 一 步 在 更 多 的 其 他 鱼 类 中 可 能 出 现 的 假 阳 性 结 果 进 行 确 证 应 用, 为 该 方 法 的 推 广 应 用 提 供 更 丰 富 的 科 学 依 据 参 考 文 献 : [] 陈 文 炳, 邵 碧 英, 廖 宪 彪, 等. 加 工 食 品 中 若 干 动 物 成 分 的 PCR 检 测 技 术 应 用 研 究 [J]. 食 品 科 学, 2005, 26(8): [2] 陈 文 炳, 邵 碧 英, 江 树 勋, 等. 食 品 中 若 干 植 物 源 性 成 分 的 PCR 检 测 [J]. 食 品 科 学, 2006, 27(): [3] 陈 颖, 钱 增 敏, 徐 宝 梁, 等. 保 健 品 中 牛 羊 源 性 成 分 的 PCR 检 测 [J]. 食 品 科 学, 2004, 25(0): [4] 才 华, 栾 凤 侠, 关 学 佳, 等. 马 铃 薯 番 茄 内 源 基 因 PCR 检 测 引 物 设 计 及 特 异 性 分 析 [J]. 食 品 科 学, 20, 32(22): [5] 张 驰, 邱 皓 璞, 张 筠. 荧 光 定 量 PCR 检 测 肉 制 品 中 鸭 源 性 成 分 [J]. 食 品 科 学, 203, 34(8): [6] 李 富 威, 张 舒 亚, 叶 军, 等. 实 时 荧 光 聚 合 酶 链 式 反 应 检 测 食 品 中 香 蕉 成 分 [J]. 食 品 科 学, 203, 34(2): [7] 范 丽 丽, 李 培, 傅 春 玲, 等. 食 品 中 鸡 源 性 成 分 实 时 荧 光 PCR 检 测 方 法 的 建 立 [J]. 食 品 科 学, 204, 35(2): [8] 李 富 威, 张 舒 亚, 叶 军, 等. 食 品 中 木 瓜 成 分 实 时 荧 光 PCR 检 测 方 法 [J]. 食 品 研 究 与 开 发, 203, 34(): [9] REHBEIN H, KRESS G, SCHMIDT T. Application of PCR-SSCP to species identification of fishery products[j]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 997, 74: [0] LIN Wenfeng, HWANG D F. A multiplex PCR assay for species identification of raw and cooked bonito[j]. Food Control, 2008, 9: [] 李 进 波, 李 想, 谌 鸿 超, 等. 实 时 荧 光 PCR 法 鉴 定 食 品 中 鲑 亚 科 鱼 成 分 [J]. 食 品 科 学, 203, 34(20): [2] 陈 超, 石 拓, 孙 曙 光, 等. 应 用 RAPD 标 记 对 东 方 豚 属 进 行 种 类 鉴 别 及 其 聚 类 分 析 [J]. 海 洋 水 产 研 究, 200, 22(3): [3] 邵 爱 华, 郑 峰, 吴 胜, 等. 暗 纹 东 方 豚 mtdna 的 分 离 与 纯 化 及 其 细 胞 色 素 b 基 因 的 分 子 克 隆 [J]. 中 国 水 产 科 学, 2005, 24(5): 4-7. [4] 邵 爱 华, 朱 江, 陈 葵, 等. 暗 纹 东 方 豚 粒 体 细 胞 色 素 b 及 其 侧 翼 trna 基 因 的 克 隆 与 序 列 分 析 [J]. 中 国 水 产 科 学, 2005, 2(6): [5] 邵 爱 华, 朱 江, 陈 葵, 等. 暗 纹 东 方 豚 线 粒 体 COⅡ 及 两 侧 trna 基 因 的 克 隆 和 序 列 分 析 [J]. 动 物 学 杂 志, 2005, 40(6): -8. [6] 邵 爱 华, 朱 江, 陈 葵, 等. 暗 纹 东 方 豚 线 粒 体 CO Ⅰ 及 其 侧 翼 trna 基 因 的 克 隆 与 序 列 分 析 [J]. 遗 传, 2006, 28(8): [7] 邵 爱 华, 朱 江, 史 全 良, 等. 暗 纹 东 方 豚 线 粒 体 COⅢ 克 隆 及 序 列 分 析 [J]. 水 产 科 学, 2006, 25(8): [8] 邵 爱 华, 薛 峰, 陈 葵, 等. 暗 纹 东 方 豚 线 粒 体 ND 及 其 侧 翼 trna 基 因 的 克 隆 及 序 列 分 析 [J]. 苏 州 科 技 学 院 学 报 : 自 然 科 学 版, 2007, 24(4): [9] 邵 爱 华, 杜 建, 陈 葵, 等. 暗 纹 东 方 豚 线 粒 体 DNA 6S rrna 基 因 克 隆 测 序 与 在 分 子 系 统 发 育 分 析 中 的 应 用 [J]. 江 苏 农 业 科 学, 2009(2): 5-9. [20] 邵 爱 华 杜 建, 陈 葵, 等. 暗 纹 东 方 豚 线 粒 体 ATPase8 和 ATPase6 基 因 的 克 隆 与 序 列 分 析 [J]. 苏 州 科 技 学 院 学 报 : 自 然 科 学 版, 200, 2(7): [2] 陈 文 炳, 赵 晨, 邵 碧 英, 等. PCR 方 法 检 测 河 豚 鱼 的 引 物 筛 选 及 反 应 体 系 的 优 化 [J]. 食 品 科 学, 20, 3(20): [22] 陈 文 炳, 林 少 华, 邵 碧 英, 等. 河 豚 鱼 Cyt b 基 因 的 部 分 DNA 序 列 分 析 与 应 用 [J]. 食 品 科 学, 202, 33(20): [23] 梁 国 栋. 最 新 分 子 生 物 学 实 验 技 术 [M]. 北 京 : 科 学 出 版 社, 200: [24] 王 波, 郭 勇, 鲜 灵. 一 种 野 生 蘑 菇 的 鉴 定 [J]. 西 南 农 业 学 报, 203, 26(2): [25] 郝 旭 光, 孙 寓 娇, 鲜 灵. PCR- 酶 切 技 术 在 石 油 烃 降 解 菌 筛 选 鉴 定 中 的 应 用 [J]. 环 境 工 程 学 报, 200(0):