国家外专局农业引智推广示范网建设

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1 福 建 农 业 生 物 技 术 通 讯 1 项 目 管 理 * 应 用 EndNote 和 维 普 期 刊 库 实 现 中 文 文 献 管 理 * 林 营 志, 苏 明 星, 刘 波 ( 福 建 省 农 业 科 学 院 生 物 技 术 中 心, 福 州 ) 摘 要 : 维 普 期 刊 网 是 中 国 最 大 的 文 献 数 据 库 之 一,EndNote 是 美 国 ISI 开 发 的 科 研 文 献 管 理 软 件 通 过 设 计 制 作 格 式 转 换 软 件 和 导 入 模 板, 将 从 维 普 期 刊 网 上 检 索 获 得 的 中 文 文 献 导 入 EndNote, 构 建 了 个 人 中 文 文 献 数 据 库, 同 时 设 计 制 作 了 符 合 中 文 学 术 论 文 参 考 文 献 格 式 要 求 的 word 格 式 模 板, 用 于 学 术 论 文 的 撰 写, 提 高 论 文 的 写 作 效 率 关 键 词 : 维 普 ;EndNote;word 编 辑 软 件 ; 科 技 文 献 管 理 Administration of Chinese reference database through EndNote software and VIP Chinese journal database LIN Ying-zhi, SU Mingxing, LIU Bo* ( Biotechnology Center, Fujian Academy of Agriculture Sciences, Fuzhou , China ) Abstract: VIP Chinese journal databae is one of the most larger database of the Chinese science literature. EndNote is an reference manager software developed by Thomson ISI ResearchSoft. Some plug-in were developed for the importation of the Chinese reference which searched from the VIP database to the personal reference database which created and managed by EndNote. Other output styles according with Chinese journal were developed for the theses processing by word software. Key Words:VIP Chinese Journal database; EndNote; WordProcessor;Reference Manager 在 中 文 科 学 论 文 的 撰 写 过 程 中, 需 要 花 费 很 多 精 力 检 索 编 辑 文 献, 调 整 参 考 文 献 的 格 式 和 倾 序, 是 论 文 写 作 中 很 大 的 负 担 本 文 建 立 一 个 方 法, 结 合 EndNote 文 献 管 理 软 件 和 维 普 期 刊 数 据 库 建 立 专 题 中 文 文 献 数 据 库, 实 现 中 文 文 献 管 理, 帮 助 作 者 轻 松 实 现 中 文 文 献 的 标 引, 从 而 将 精 力 专 注 于 文 章 的 内 容 和 结 构, 提 高 论 文 写 作 效 率 1 EndNote 科 研 文 献 管 理 软 件 和 维 普 期 刊 数 据 库 EndNote 是 美 国 ISI Researchsoft 开 发 的 科 研 文 献 管 理 工 具, 可 从 因 特 网 检 索 获 取 文 献 信 息 导 入 EndNote 的 文 献 数 据 库 EndNote 具 备 数 据 库 文 献 的 检 索 查 找 功 能, 最 为 重 要 的 是 EndNote 和 Word 编 辑 软 件 集 成, 可 以 方 便 地 在 Word 文 档 中 插 入 文 献, 自 动 生 成 引 用 标 记 和 文 章 末 尾 的 文 献 列 表, 为 科 技 论 文 写 作 带 来 了 很 大 的 方 便 (Herbert, 2002; Hunt, 1998; Miller, 1997; Reiss et al., 2001; Sable et al., 2000; Vaux, 1994; 曲 书 泉 等, 2002) 然 而 EndNote 没 有 为 中 文 文 献 的 导 入 和 文 献 格 式 的 编 排 提 供 模 板, 也 未 见 相 关 中 文 文 献 的 导 入 输 出 方 法, 给 中 文 参 考 文 献 的 处 理 带 来 了 很 大 的 不 便 收 稿 日 期 : 作 者 简 介 : 林 营 志,1974 年 生, 男, 博 士, 高 级 程 序 员 主 要 研 究 方 向 : 生 物 信 息 生 物 反 应 器, yingzhilin@hotmail.com * 通 讯 作 者 : 刘 波,1957 年 生, 男, 博 士, 研 究 员, laeptb@pub3.fz.fj.cn. ** 文 中 所 提 的 转 换 软 件 和 相 关 的 导 入 模 板 输 出 模 板 可 在 下 载

2 2 第 六 卷 2004(9) 中 文 科 技 期 刊 数 据 库 即 维 普 数 据 库, 收 录 了 我 国 1989 年 以 来 的 大 量 科 技 论 文 题 录 和 全 文, 是 国 内 最 具 有 权 威 和 最 受 欢 迎 的 综 合 性 中 文 期 刊 全 文 数 据 库 之 一 ( 曹 志 梅 等., 2003) 笔 者 利 用 EndNote 结 合 维 普 数 据 库 实 现 中 文 文 献 的 管 理 : 建 立 配 合 转 换 维 普 文 献 数 据 的 模 板 和 程 序, 将 文 献 导 入 EndNote, 建 立 中 文 文 献 数 据 库 ; 建 立 文 献 格 式 输 出 模 板, 应 用 于 中 文 科 技 论 文 的 写 作 具 体 步 骤 为 : 检 索 并 下 载 维 普 题 录 摘 要 ; 格 式 转 换 ; 导 入 EndNote; 插 入 word 编 辑 论 文 ; 创 建 格 式 输 出 模 板 ; 格 式 化 文 献 格 式 2 中 文 文 献 库 的 建 立 2.1 检 索 下 载 维 普 文 献 建 立 数 据 库 之 前, 首 先 通 过 维 普 网 站 获 取 构 建 文 献 库 所 需 的 数 据 源 在 提 供 维 普 检 索 服 务 的 网 站, 通 过 合 适 的 检 索 条 件 并 获 得 所 需 的 文 献 列 表 后, 就 可 以 通 过 右 上 角 的 下 载 题 录 按 钮 下 载 所 需 的 文 献, 视 需 要 选 择 全 部 题 录 标 记 题 录 或 当 前 题 录, 在 弹 出 的 窗 口 中 选 择 保 存, 文 件 名 默 认 为 WPZX.wp, 保 存 到 方 便 的 位 置 就 可 以 了 一 次 最 多 可 下 载 100 条 文 献, 如 有 超 过, 可 通 过 对 检 索 年 代 的 限 制 将 检 索 结 果 分 段 下 载, 保 存 为 多 个 文 件 这 也 是 笔 者 选 择 维 普 而 不 是 CNKI 的 重 要 原 因, 后 者 一 次 最 多 下 载 4 条 2.2 格 式 转 化 下 载 获 得 的 题 录 文 件 分 成 两 个 部 分 : 文 件 头 和 文 献 列 表 文 件 头 描 述 了 检 索 时 间 检 索 范 围 起 止 年 代 检 索 布 尔 表 达 式 等 信 息 ; 文 献 列 表 由 一 个 个 独 立 的 文 献 记 录 构 成, 各 记 录 之 间 以 三 个 回 车 换 行 符 和 数 字 ##/##( 当 前 记 录 号 / 记 录 总 数 ) 进 行 分 隔, 每 条 记 录 由 多 行 构 成, 每 行 由 一 个 或 多 个 字 段 构 成, 依 次 为 光 盘 号, 题 名, 作 者 等, 如 图 1 所 示 6/54 光 盘 号 2002NY09 题 名 烤 烟 雄 性 不 育 杂 交 一 代 组 合 广 雄 32 号 的 选 育 作 者 罗 战 勇 吕 永 华 等 机 构 广 东 省 农 科 院 作 物 研 究 所, 广 东 广 州 广 东 省 烟 草 公 司, 广 东 广 州 刊 名 广 东 农 业 科 学.2002,(5) ISSN 号 X C N 号 馆 藏 号 93806X 关 键 词 烤 烟 雄 性 不 育 杂 交 一 代 广 雄 32 号 杂 交 组 合 产 量 表 现 经 济 性 状 农 艺 性 状 栽 培 要 点 分 类 号 S572 文 摘 广 雄 32 号 ( 原 名 9032) 图 1 维 普 题 录 文 件 的 记 录 结 构 由 于 EndNote 无 法 识 别 中 文 的 字 段 标 识 符, 需 将 其 转 换 成 英 文 标 识 符 为 方 便 转 换 操 作 笔 者 制 作 了 一 个 小 软 件 进 行 转 换 工 作, 操 作 很 简 便, 打 开 下 载 的 文 件, 处 理 保 存 就 好 了, 见 图 2 软 件 采 用 的 转 换 模 式 见 表 1, 转 换 前 一 栏 是 维 普 题 录 使 用 的 标 识 符, 转 换 后 是 对 应 的 软 件 转 换 后 的 标 识 符, 每 个 标 识 符 以 - 结 束 处 理 后 的 文 件 即 可 用 模 板 导 入 到 EndNote 中 表 1 维 普 题 录 文 件 的 转 换 模 式 转 换 前 转 换 后 对 应 EndNote 标 识 符 说 明 光 盘 号 DA - Accession Number 光 盘 号 题 名 TI - Title 标 题 作 者 AU - Author 作 者 机 构 AD - Author Address 联 系 地 址

3 福 建 农 业 生 物 技 术 通 讯 3 刊 名 SO - Journal.Year,Volume(Issue).Pages 刊 物 名 称 年 代 卷 期 页 码 或 Journal.Year,(Issue).Pages 或 : 刊 物 名 称 年 代 期 页 码 ISSN 号 IS - ISSN ISSN 编 号 文 献 号 C N 号 SB - Label CN 编 号 馆 藏 号 UI - Call Number 索 取 文 献 用 关 键 词 MH - Keywords 关 键 词 分 类 号 AID - Reviewed Item 所 属 分 类 文 摘 AB - Abstract 摘 要 2.3 设 计 导 入 模 板 导 入 维 普 题 录 EndNote 中 导 入 模 板 为 一 个 个 独 立 的 文 件, 后 缀 名 为 enf EndNote 没 有 提 供 针 对 维 普 题 录 的 模 板, 笔 者 根 据 表 1 设 计 了 一 个, 另 存 为 vipchinesefilter.enf, 放 在 EndNote 安 装 目 录 的 子 目 录 Filters 中 模 板 设 置 中 的 记 录 分 行 特 征 为 : 段 落 分 行 无 结 束 行 每 条 目 以 ##/## 开 始, 无 缩 进 设 置, 软 件 自 动 识 别 分 隔 记 录 ; 各 标 识 符 标 识 的 数 据 参 照 表 1 转 换 成 数 据 库 中 的 字 段, 其 中 刊 名 行 的 转 换 有 两 种 模 式, 分 别 为 :Journal.Year,Volume(Issue).Pages 和 Journal.Year,(Issue).Pages, 因 为 有 些 记 录 在 该 行 没 有 卷 号 字 段, 所 以 要 用 两 种 模 式, 由 软 件 自 动 选 择 合 适 的 模 式 导 入 数 据 导 入 文 献 前 先 打 开 已 有 的 文 献 数 据 库 或 新 建 一 个 数 据 库, 然 后 用 EndNote 功 能 将 转 换 好 的 维 普 题 录 文 件 导 入 数 据 库 中, 方 法 为 :Files -> Import, 在 对 话 框 中 Import Option 选 择 VIPChineseFilter, 源 文 件 ( choose file 按 钮 ) 选 择 已 转 换 好 的 维 普 题 录 文 件, 执 行 Import,EndNote 就 会 依 据 模 板 将 题 录 摘 要 逐 条 导 入 到 数 据 库 中 由 于 新 导 入 的 文 献 可 能 和 现 有 的 文 献 重 复, 所 以 导 入 后 最 好 进 行 重 复 检 查 先 执 行 菜 单 Reference-> show all reference, 显 示 库 中 的 所 有 文 献, 然 后 执 行 菜 单 Reference -> Find Duplicates EndNote 就 会 标 出 重 复 多 余 的 文 献 条 目, 用 Ctrl+D 将 重 复 项 删 除 3 在 论 文 中 插 入 数 据 库 引 用 条 目 用 EndNote 打 开 相 应 的 文 献 数 据 库, 选 择 当 前 需 引 用 的 文 献 ( 可 多 选 ); 在 Words 文 档 中 用 光 标 定 位 引 用 的 位 置, 然 后 点 击 EndNote 工 具 条 上 的 Insert selected Citation 按 钮 ( 见 图 3), 所 选 文 献 即 被 插 入, 同 时 在 文 章 末 尾 自 动 生 成 相 应 的 文 献 列 表 在 论 文 的 编 辑 过 程 中, 文 献 引 用 会 跟 随 正 文 一 起 移 动, 并 自 动 调 整 先 后 顺 序 图 2 维 普 题 录 文 件 转 化 软 件 界 面 图 3 Word 中 的 EndNote 工 具 条

4 4 第 六 卷 2004(9) 4 格 式 化 文 献 引 用 格 式 4.1 制 作 符 合 中 文 期 刊 要 求 的 输 出 模 板 在 科 技 论 文 中, 不 同 期 刊 对 参 考 文 献 的 引 用 和 排 列 方 法 都 有 各 自 的 要 求, 包 括 引 用 部 分 和 文 末 文 献 列 表 两 部 分 的 内 容 和 格 式 EndNote 针 对 不 同 刊 物 提 供 了 不 同 的 模 板, 但 没 有 提 供 中 文 刊 物 的 模 板 我 们 可 用 自 定 义 的 方 式 建 立 中 文 期 刊 的 模 板, 方 法 为 : 打 开 EndNote, 执 行 菜 单 edit->output styles -> open styles manager, 选 择 合 适 的 出 发 模 板 进 行 编 辑 ( 单 击 edit), 另 存 为 对 应 中 文 刊 物 的 名 称, 如 科 技 导 报.ens, 放 置 在 EndNote 安 装 目 录 的 styles 子 目 录 中 以 科 技 导 报 模 板 为 例 : 修 改 Citation 和 Bibliography 两 部 分, 前 者 定 义 正 文 中 的 文 献 引 用 格 式, 后 者 定 义 文 末 的 文 献 列 表 格 式 Citation 部 分 的 template: 科 技 导 报 采 用 编 号 标 注 引 用, 所 以 应 该 插 入 Bibliography Number 字 段, 该 字 段 为 当 前 引 用 在 引 用 先 后 顺 序 中 的 编 号, 前 后 加 上 中 括 号, 设 定 成 上 标 格 式 即 可, 显 示 效 果 为 [Bibliography Number] 如 果 是 作 者 年 代 形 式 出 现 的, 就 应 该 插 入 author 和 year 字 段, 并 在 Author list 中 进 一 步 设 定 显 示 格 式 Biblography 部 分 的 template: 设 置 成 Author. Title[J]. Journal, Year. Volume (Issue) :Pages ; 排 列 顺 序 : 按 照 文 中 出 现 的 先 后 顺 序, 选 择 order of appearance; 布 局 : 设 置 成 以 [Bibliography Number] 开 始, 所 有 段 落 悬 挂 缩 进 ; 作 者 列 表 : 设 置 成 作 者 按 先 后 顺 序 显 示, 前 后 之 间 用 逗 号 分 隔, 超 过 两 个 作 者 以 等 显 示 4.2 格 式 化 文 献 格 式 论 文 编 辑 完 成 后, 确 定 了 投 稿 的 期 刊, 就 可 以 根 据 要 求 对 参 考 文 献 进 行 格 式 化 了 首 先 在 EndNote 中 挑 选 备 选 模 板 : 打 开 菜 单 edit -> OutPut Styles -> Open Styles Manager, 在 可 能 用 到 的 模 板 前 打 勾 ; 挑 好 被 选 格 式 后, 就 可 对 文 章 中 的 引 用 文 献 进 行 格 式 化 了, 单 击 EndNote 工 具 栏 ( 见 图 3) 中 的 按 钮 Format Bibliography, 弹 出 对 话 框, 在 With Output 中 选 择 需 要 的 格 式, 即 可 按 指 定 模 式 进 行 格 式 化, 见 图 4 该 操 作 可 重 复 进 行, 亦 可 更 换 成 其 它 模 板, 以 适 应 不 同 刊 物 的 要 求 格 式 化 完 成 后, 在 文 末 生 成 指 定 格 式 的 文 献 列 表, 见 图 5 图 4 参 考 文 献 格 式 化 窗 口 [1] 曲 书 泉, 张 伟. 一 种 非 常 实 用 的 参 考 文 献 引 文 注 释 软 件 EndNote [J]. 疾 病 监 测, (2): [2] 曹 志 梅, 王 凯. CAJ 及 VIP 收 录 中 文 核 心 期 刊 情 况 的 统 计 分 析 [J]. 情 报 学 报, (1): 图 5 格 式 化 生 成 的 文 末 参 考 文 献 列 表

5 福 建 农 业 生 物 技 术 通 讯 去 除 文 献 控 制 宏 代 码 输 出 正 式 文 档 采 用 EndNote 插 入 的 文 献 条 目 以 域 的 形 式 嵌 入 在 Word 文 档 中, 受 到 EndNote 宏 的 控 制, 不 能 直 接 编 辑 在 对 其 进 行 修 改 之 前, 需 将 宏 去 除, 方 法 是 : 当 文 章 修 改 完 毕 准 备 投 稿 时, 选 择 word 中 EndNote 工 具 栏 中 的 Removed Field Codes 按 钮 ( 见 图 3),EndNote 复 制 当 前 文 档 生 成 新 文 档, 新 生 成 的 文 档 中 去 除 了 域 代 码, 此 时 就 可 对 文 档 进 一 步 修 改 调 整 这 种 去 除 了 宏 代 码 的 文 档 可 避 免 对 编 辑 部 的 期 刊 编 辑 工 作 造 成 干 扰 4 小 结 与 讨 论 参 考 文 献 的 编 辑 排 序 一 直 是 科 技 论 文 写 作 中 一 个 很 繁 琐 的 工 作, 尤 其 是 写 作 长 篇 综 述 毕 业 论 文 书 籍, 又 需 要 采 用 编 号 形 式 进 行 标 引 时, 正 文 的 移 动 会 引 发 文 献 列 表 的 变 更, 造 成 很 大 的 工 作 量, 也 容 易 造 成 错 误 欧 美 等 国 已 大 量 使 用 EndNote 等 软 件 辅 助 进 行 文 章 的 写 作, 受 益 匪 浅, 而 国 内 目 前 应 用 得 还 很 少, 除 因 为 这 些 软 件 长 期 对 中 文 支 持 不 足 外, 中 文 文 献 导 入 模 板 输 出 模 板 的 缺 位 也 是 重 要 原 因 笔 者 以 维 普 数 据 库 作 为 数 据 源, 制 作 了 相 应 的 导 入 输 出 模 板 以 科 技 导 报 为 例 设 计 输 出 格 式 模 板, 实 现 了 中 文 参 考 文 献 的 管 理 和 输 出, 希 望 有 越 来 越 多 的 人 使 用 这 些 技 术, 共 同 提 高 论 文 的 写 作 效 率 同 类 的 文 献 管 理 软 件 除 EndNote 外, 还 有 Reference manager( 陈 明 旦 等, 2002) 和 Biblioscape 等, 笔 者 选 用 EndNote 的 原 因 是 为 Endnote 新 近 推 出 的 最 新 8.0 版 本 支 持 unicode 编 码, 对 中 文 等 亚 洲 文 字 的 识 别 显 示 和 排 序 有 了 明 显 的 改 善 然 而 由 于 EndNote 是 国 外 开 发 的, 在 中 文 支 持 上 仍 然 存 在 着 一 些 问 题, 仅 通 过 外 部 软 件 和 模 板 的 设 计 修 改 无 法 解 决 例 如 : 当 引 用 的 文 献 存 在 2 个 以 上 作 者 时, 中 文 文 献 通 常 用 等 字 表 示, 英 文 却 是 使 用 " et al. ",EndNote 无 法 区 分 中 文 和 英 文, 因 此 只 能 用 同 一 种 方 式 进 行 格 式 化, 生 成 的 文 献 列 表 需 去 除 域 代 码 后 再 编 辑, 当 然 也 可 用 Word 的 替 换 功 能 处 理 ; 而 在 8.0 之 前 的 版 本, 通 过 本 文 方 法 导 入 的 维 普 文 献 在 EndNote 中 只 能 显 示 出 作 者 年 代 和 标 题, 其 余 均 显 示 为 乱 码, 而 且 期 刊 名 称 还 不 能 直 接 导 入 到 Journal 字 段 中 此 外 亦 不 能 支 持 维 普 全 文 的 链 接 直 接 显 示, 这 些 问 题 有 待 于 软 件 功 能 的 进 一 步 改 善, 也 企 盼 着 中 国 开 发 出 符 合 中 文 习 惯, 支 持 多 种 语 言 文 献 的 文 献 管 理 软 件 参 考 文 献 [1] 曹 志 梅, 王 凯 CAJ 及 VIP 收 录 中 文 核 心 期 刊 情 况 的 统 计 分 析. 情 报 学 报, 22 (1): [2] 陈 明 旦, 刘 建 文, 等 利 用 ReferenceManager 进 行 Internet 文 献 检 索. 中 国 科 技 期 刊 研 究, 13 (4): [3] 曲 书 泉, 张 伟 一 种 非 常 实 用 的 参 考 文 献 引 文 注 释 软 件 EndNote. 疾 病 监 测, 17 (2): [4] Herbert, T. L EndNote 5 for windows. J Chem Inf Comput Sci, 42 (1): [5] Hunt, T Endnote 3.0. Trends Biochem Sci, 23 (7):268. [6] Miller, M. C EndNote Plus 2.2, including an add-in for Microsoft Word. MD Comput, 14 (4): [7] Reiss, M., Reiss, G., Pausch, N. C Reference manager EndNote 4. Further development and new functions. Radiologe, 41 (6): [8] Sable, J. H., Carlin, B. G., et. al Creating local bibliographic databases: new tools for evidence-based health care. Bull Med Libr Assoc, 88 (2): [9] Vaux, D An end to the paper chase? EndNote Plus (release 1.3.1, March 1993; plug-in module update April 1994). Trends Biochem Sci, 19 (7): [10] [11]

6 6 第 六 卷 2004(9) 生 化 分 析 黄 瓜 尖 孢 镰 刀 菌 菌 株 专 化 型 的 初 步 研 究 * 肖 荣 凤, 朱 育 菁, 车 建 美, 陈 璐, 刘 波 ( 福 建 省 农 业 科 学 院 生 物 技 术 中 心, 福 州 ) 1 引 言 尖 孢 镰 刀 菌 是 许 多 重 要 作 物 枯 萎 病 的 病 原 真 菌, 迄 今 已 报 道 的 专 化 型 分 化 有 80 多 个, 专 化 型 下 又 划 分 为 许 多 生 理 小 种 至 今, 已 报 道 的 尖 孢 镰 刀 菌 的 专 化 型 有 35 种, 其 中 瓜 类 枯 萎 病 菌 已 被 报 导 有 8 个 专 化 型 :1 F. oxysporum Schl.f.sp. cucumerinum Owen 尖 孢 镰 刀 菌 黄 瓜 专 化 型 2 F. oxysporum Schl.f.sp.niveum(E.F.Smith)Snyder&Hansen 尖 孢 镰 刀 菌 西 瓜 专 化 型 3 F. oxysporum Schl.f.sp.melonis Snyder&Hansen 尖 孢 镰 刀 菌 甜 瓜 专 化 型 4 F. oxysporum Schl.f.sp.luffae Kwai,Suzuki & Kawai 尖 孢 镰 刀 菌 丝 瓜 专 化 型 5 F. oxysporum Schl.f.sp.lagenariae Matuo & Yamamoto 尖 孢 镰 刀 菌 葫 芦 专 化 型 6 F. oxysporum Schl.f.sp.momordicae Sun S.K.&Huang J.W. 尖 孢 镰 刀 菌 苦 瓜 专 化 型 7 F. oxysporum Schl.f.sp. benincasae Gerlagh M. & Ester A. 尖 孢 镰 刀 菌 冬 瓜 专 化 型 8 F. oxysporum Schl.f.sp.cucurbitacearum Gerlagh M.&Block W.J. 瓜 类 专 化 型 我 国 已 经 明 确 报 道 的 有 西 瓜 甜 瓜 黄 瓜 冬 瓜 葫 芦 专 化 型 ; 而 同 一 专 化 型 的 枯 萎 病 原 菌 在 不 同 的 地 区, 存 在 着 明 显 的 致 病 性 分 化, 形 成 不 同 的 生 理 小 种 专 化 型 和 生 理 小 种 的 鉴 别, 对 于 抗 病 育 种, 植 物 检 疫 以 及 病 害 防 治, 具 有 重 要 的 理 论 和 实 际 意 义 本 研 究 旨 在 测 定 黄 瓜 尖 孢 镰 刀 菌 菌 株 在 几 种 瓜 类 作 物 上 的 侵 染 及 致 病 能 力 2 材 料 与 方 法 2.1 试 验 材 料 供 试 菌 株 : 分 离 自 黄 瓜 枯 萎 病 株 的 尖 孢 镰 刀 菌 (F-H J4), 编 号 120 供 试 种 子 见 表 1 表 1 供 试 瓜 类 种 子 ( 供 10 株 ) 品 种 产 地 品 种 产 地 夏 三 尺 杂 交 黄 瓜 上 海 健 宝 南 瓜 日 本 津 绿 5 号 黄 瓜 天 津 黑 金 冬 瓜 广 东 华 美 香 瓜 韩 国 爱 和 芋 葫 福 州 亚 历 山 大 西 瓜 韩 国 翠 绿 苦 瓜 福 州 早 青 一 代 西 葫 芦 河 北 金 青 肉 丝 瓜 广 东 2.2 方 法 菌 株 120 于 PSA 平 板 上 培 养 7d 后, 刮 下 菌 丝 于 100mL 无 菌 水 中, 充 分 振 匀, 用 双 层 纱 布 过 滤 两 遍 制 成 孢 子 悬 液, 吸 1mL 孢 子 悬 浮 液 于 盛 50mL 培 养 液 250mL 的 三 角 瓶 中 然 后 将 接 菌 的 培 养 液 置 于 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 863 计 划 项 目 (2002AA ) 作 者 简 介 : 肖 荣 凤 (1978-), 女, 硕 士 研 究 生 * 通 讯 作 者 : 刘 波, 从 事 生 物 技 术 和 生 物 防 治 研 究, laeptb@pub3.fz.fj.cn

7 福 建 农 业 生 物 技 术 通 讯 7 25 下,120r/min 摇 床 培 养,14d 时 各 取 出, 双 层 纱 布 过 滤, 滤 液 稀 释 100 倍 后, 取 10mL 于 150mL 的 三 角 瓶 处 理 表 1 中 瓜 类 种 子, 测 定 F-H J4 对 不 同 瓜 类 作 物 的 致 病 性, 清 水 处 理 作 对 照, 试 验 重 复 2 次, 置 于 30,60 r/min 下 轻 微 振 荡 培 养 ( 提 高 通 气 量, 促 进 发 芽 ),4 d 取 出 放 于 30 的 人 工 气 候 箱 培 养, 逐 日 观 察 感 染 情 况 种 子 消 毒 方 法 : 经 0.05% 的 高 锰 酸 钾 消 毒 5min, 用 清 水 冲 洗 多 遍 3 结 果 与 分 析 试 验 结 果 见 表 2. 供 试 的 10 种 瓜 类 种 子 经 黄 瓜 尖 孢 镰 刀 菌 致 病 株 (F-H J4) 处 理 后, 有 6 种 种 子 发 芽, 分 别 为 : 夏 三 尺 杂 交 黄 瓜, 清 水 与 处 理 组 的 发 芽 率 均 为 100%; 津 绿 5 号 黄 瓜, 清 水 与 处 理 组 的 发 芽 率 均 为 80%; 华 美 香 瓜, 清 水 对 照 发 芽 率 为 50%, 处 理 组 发 芽 率 为 60%; 早 青 一 代 西 葫 芦, 清 水 对 照 发 芽 率 为 70%, 处 理 组 发 芽 率 为 30%, 金 青 肉 丝 瓜, 清 水 对 照 与 处 理 组 的 发 芽 率 分 别 为 50% 10%; 爱 和 芋 葫, 清 水 对 照 与 处 理 组 的 发 芽 率 分 别 为 40% 20%; 清 水 对 照 发 芽 率 为 70%, 处 理 组 发 芽 率 为 30% 后 3 种 瓜 种 子 在 清 水 对 照 组 中 的 发 芽 率 高 于 菌 液 处 理 组, 可 能 是 菌 液 对 西 葫 芦 丝 瓜 芋 葫 种 子 的 萌 发 有 抑 制 作 用 ; 而 对 黄 瓜 萌 发 率 无 影 响, 香 瓜 种 子 在 菌 液 处 理 组 萌 发 率 较 清 水 对 照 组 高 10% 另 外 的 4 种 种 子 未 发 芽, 分 别 为 亚 历 山 大 西 瓜, 健 宝 南 瓜, 黑 金 冬 瓜, 翠 绿 苦 瓜, 这 4 种 种 子 可 能 是 由 种 皮 过 厚 的 缘 故 种 子 在 尖 孢 镰 刀 菌 菌 液 中 处 理 萌 发 长 成 植 株 后 的 发 病 情 况 表 明, 处 理 后 的 黄 瓜, 香 瓜 植 株 均 能 发 病 且 发 病 率 达 100%, 西 葫 芦 丝 瓜 芋 葫 未 有 发 病 症 状, 清 水 对 照 组 中 除 香 瓜 有 一 株 死 亡 外, 其 余 植 株 均 表 现 正 常 表 2 黄 瓜 尖 孢 镰 刀 菌 致 病 株 (F-H J4) 处 理 后 的 瓜 类 种 子 的 萌 发 与 发 病 情 况 品 种 菌 液 处 理 组 清 水 对 照 组 萌 发 率 (%) 发 病 情 况 萌 发 率 (%) 发 病 情 况 夏 三 尺 杂 交 黄 瓜 % 发 病, 潜 育 期 10 d 100 未 发 病 津 绿 5 号 黄 瓜 % 发 病, 但 发 病 潜 育 较 80 未 发 病 夏 三 尺 杂 交 黄 瓜 推 迟 4d 华 美 香 瓜 % 发 病, 潜 育 期 11 d 50 有 一 株 死 亡 早 青 一 代 西 葫 芦 30 未 发 病 70 未 发 病 金 青 肉 丝 瓜 10 未 发 病 50 未 发 病 爱 和 芋 葫 20 未 发 病 40 未 发 病 亚 历 山 大 西 瓜 未 发 芽 未 发 芽 健 宝 南 瓜 未 发 芽 未 发 芽 黑 金 冬 瓜 未 发 芽 未 发 芽 翠 绿 苦 瓜 未 发 芽 未 发 芽 初 步 试 验 研 究 表 明, 供 试 的 10 种 瓜 类 种 子 中 黄 瓜 香 瓜 西 葫 芦 丝 瓜 芋 葫 较 易 发 芽 ; 而 西 瓜, 南 瓜, 冬 瓜, 苦 瓜 种 子 不 易 发 芽, 可 能 是 与 种 皮 的 厚 度 有 关, 或 与 种 子 的 品 种 有 关 黄 瓜 尖 孢 镰 刀 菌 致 病 株 (F-H J4) 可 侵 染 黄 瓜 及 香 瓜, 不 侵 染 西 葫 芦 丝 瓜 芋 葫, 但 其 专 业 型 的 确 定 有 待 于 进 一 步 的 研 究

8 8 第 六 卷 2004(9) 不 同 培 养 阶 段 黄 瓜 尖 孢 镰 刀 菌 菌 液 的 致 病 力 差 异 * 肖 荣 凤, 朱 育 菁, 车 建 美, 陈 璐, 刘 波 ( 福 建 省 农 业 科 学 院 生 物 技 术 中 心, 福 州 ) 1 引 言 枯 萎 病 原 菌 在 生 长 过 程 中 会 分 泌 胞 外 毒 素 及 其 它 物 质, 通 过 过 滤 枯 萎 病 菌 的 发 酵 液 即 可 得 到 胞 外 毒 素 已 有 的 研 究 报 道 用 于 枯 萎 病 原 菌 生 物 测 定 的 菌 液 培 养 时 间 为 7-14d 间 本 研 究 旨 在 研 究 枯 萎 病 原 菌 菌 株 的 不 同 培 养 阶 段 的 菌 液 在 致 病 力 上 的 差 异, 为 瓜 类 枯 萎 病 原 菌 的 生 物 测 定 的 适 宜 接 菌 的 菌 液 制 备 提 供 依 据 2 材 料 与 方 法 2.1 试 验 材 料 供 试 菌 株 : 分 离 自 黄 瓜 枯 萎 病 株 的 尖 孢 镰 刀 菌 (F-H J4), 编 号 方 法 菌 株 120 于 PSA 平 板 上 培 养 7d 后, 刮 下 菌 丝 于 100mL 无 菌 水 中, 充 分 振 匀, 用 双 层 纱 布 过 滤 两 遍 制 成 孢 子 悬 液, 吸 1mL 孢 子 悬 浮 液 于 盛 50mL 培 养 液 250mL 的 三 角 瓶 中, 未 加 菌 的 作 空 白 对 照 然 后 将 接 菌 的 培 养 液 置 于 25 下,120r/min 摇 床 培 养, 培 养 至 第 d 时 各 出 取 一 瓶, 双 层 纱 布 过 滤, 滤 液 稀 释 100 倍 后, 取 10mL 处 理 黄 瓜 种 子, 测 定 不 同 培 养 阶 段 的 菌 液 对 黄 瓜 植 株 的 致 病 力 差 异 3 结 果 与 分 析 试 验 结 果 见 表 1 不 同 培 养 阶 段 用 于 处 理 黄 瓜 种 子 的 菌 液 浓 度 如 表 1 所 示, 其 为 发 酵 液 滤 液 稀 释 100 倍 的 菌 液, 不 同 培 养 阶 段 阶 段 的 菌 体 数 存 在 差 异 处 理 后, 植 株 的 发 病 潜 育 期 为 10-12d, 差 异 不 大, 各 处 理 的 植 株 从 开 始 感 病 至 完 全 发 病 ( 发 病 率 达 100%), 仅 需 2-3d, 试 验 中 的 清 水 对 照 处 理 植 株 生 长 正 常 表 1 不 同 培 养 阶 段 的 菌 液 处 理 结 果 培 养 时 间 (d) 回 接 的 菌 液 浓 度 10 6 cfu/ml 发 病 潜 育 期 (d) 病 程 时 间 (d) 发 病 率 (%) 清 水 对 照 0 0 本 研 究 结 果 表 明, 不 同 培 养 阶 段 的 菌 液 用 于 植 株 的 生 物 测 定, 在 植 株 的 发 病 潜 育 期 上 差 异 不 大, 仅 为 2d; 处 理 后 的 植 株 从 开 始 发 病 至 所 有 植 株 完 全 死 亡 只 需 2-3d 结 合 已 测 定 枯 萎 病 原 菌 发 酵 培 养 各 阶 段 的 其 它 微 生 物 学 指 标, 选 择 培 养 7d 菌 液 用 于 生 物 测 定 即 可 达 到 效 果, 且 菌 液 的 准 备 周 期 适 中

9 福 建 农 业 生 物 技 术 通 讯 9 基 因 测 序 西 瓜 寄 主 尖 孢 镰 刀 菌 rdna ITS 区 段 扩 增 的 测 序 * 曹 宜, 林 营 志, 朱 育 菁, 苏 明 星, 刘 波 ( 福 建 省 农 业 科 学 院 生 物 技 术 中 心, 福 州 ) 1 引 言 目 前, 克 隆 和 测 序 真 菌 核 糖 体 基 因, 根 据 其 特 点 进 行 真 菌 分 类 鉴 定 和 系 统 发 育 的 研 究 已 有 很 多 报 道 由 于 采 用 PCR 扩 增 病 原 真 菌 核 糖 体 基 因 某 一 特 异 片 段 用 于 菌 株 的 鉴 定 监 测 及 病 害 诊 断, 具 有 快 速 准 确 和 简 便 的 特 点, 也 越 来 越 受 到 重 视 根 据 真 菌 在 ITSⅠ 和 ITSⅡ 区 具 有 丰 富 变 异 的 特 点, 将 这 一 可 变 区 作 为 真 菌 分 类 鉴 定 的 依 据 之 一 为 了 根 据 ITS 区 段 对 尖 孢 镰 刀 菌 进 行 分 类, 通 过 设 计 引 物 扩 增 同 一 寄 主 ( 西 瓜 ) 尖 孢 镰 刀 菌 的 rdna ITS 区 段, 对 ITS 区 进 行 测 序 2 材 料 与 方 法 2.1 供 试 菌 株 供 试 菌 株 及 来 源 见 表 1 表 1 供 试 菌 种 及 来 源 菌 种 序 号 菌 株 编 号 菌 种 名 称 来 源 采 集 地 点 F-X 西 瓜 福 州 永 泰 F-X 西 瓜 福 州 永 泰 F-X 西 瓜 福 州 永 泰 F-X 西 瓜 福 州 永 泰 2.2 目 的 片 段 18S-28S r DNA 及 ITS 区 的 PCR 扩 增 2.3 PCR 产 物 的 纯 化 及 测 序 未 纯 化 的 PCR 产 物, 通 过 用 先 割 胶 后 过 柱 纯 化 的 方 法 继 续 纯 化, 在 自 动 DNA 测 序 仪 上 进 行 序 列 测 定 3 结 果 与 分 析 图 1 西 瓜 枯 萎 病 原 尖 孢 镰 刀 菌 菌 株 F-X 测 序 的 碱 基 序 列

10 10 第 六 卷 2004(9) 图 2 西 瓜 枯 萎 病 原 尖 孢 镰 刀 菌 菌 株 F-X 测 序 的 碱 基 序 列 图 3 西 瓜 枯 萎 病 原 尖 孢 镰 刀 菌 菌 株 F-X 测 序 的 碱 基 序 列 图 4 西 瓜 枯 萎 病 原 尖 孢 镰 刀 菌 菌 株 F-X 测 序 的 碱 基 序 列 测 序 时, 由 于 荧 光 染 料 的 干 扰, 测 序 结 果 在 引 物 3' 端 后 面 的 10 至 30 个, 严 重 时 可 能 达 到 70 个 以 上 碱 基 不 一 定 能 够 准 确 判 读 所 用 测 序 仪 器 为 ABI 公 司 的 仪 器, 正 常 情 况 下, 除 了 开 始 约 10 至 30 个 碱 基, 在 550bp 以 内 可 以 达 到 98.5% 以 上 的 准 确 率, 但 仪 器 及 软 件 有 时 也 会 发 生 错 读 或 漏 读 碱 基 的 情 况, 此 时 需 要 自 己 判 断 具 体 是 什 么 碱 基 所 以, 一 般 只 有 进 行 正 反 链 同 时 测 序, 在 两 个 序 列 完 全 吻 合 的 情 况 下, 才 能 确 保 所 得 序 列 100% 可 靠 单 靠 一 个 方 向 测 序 想 得 到 完 全 准 确 的 序 列 是 几 乎 不 可 能 的, 这 是 由 仪 器 本 身 的 性 能 指 标 决 定 的 正 常 情 况 下, 一 个 测 序 反 应 可 以 得 到 500 个 以 上 有 效 碱 基, 但 一 般 在 600bp 以 后 的 序 列 只 能 作 为 参 考 参 考 文 献 [1] 杨 红, 李 颖, 关 国 华 等. 尖 孢 镰 刀 菌 异 核 体 及 其 不 同 核 型 分 离 子 rdna ITS 区 序 列 分 析. 农 业 生 物 技 术 学 报,2002,10 (4): [2] 杨 佩 文, 李 家 瑞, 杨 勤 忠 等. 根 肿 病 菌 核 糖 体 基 因 ITS 区 段 的 克 隆 测 序 及 其 在 检 测 中 的 应 用. 云 南 农 业 大 学 学 报,2003, 18(3): [3] 杭 晓 敏, 杨 虹,Whiteby Corne. 垃 圾 填 埋 场 中 厌 氧 真 菌 18S rdna 的 PCR 扩 增 及 鉴 定. 生 物 工 程 学 报,2001,17(5):

11 福 建 农 业 生 物 技 术 通 讯 11 不 同 寄 主 尖 孢 镰 刀 菌 rdna ITS 区 段 扩 增 的 测 序 * 曹 宜, 林 营 志, 朱 育 菁, 苏 明 星, 刘 波 ( 福 建 省 农 业 科 学 院 生 物 技 术 中 心, 福 州 ) 1 引 言 目 前, 克 隆 和 测 序 真 菌 核 糖 体 基 因, 根 据 其 特 点 进 行 真 菌 分 类 鉴 定 和 系 统 发 育 的 研 究 已 有 很 多 报 道 由 于 采 用 PCR 扩 增 病 原 真 菌 核 糖 体 基 因 某 一 特 异 片 段 用 于 菌 株 的 鉴 定 监 测 及 病 害 诊 断, 具 有 快 速 准 确 和 简 便 的 特 点, 也 越 来 越 受 到 重 视 根 据 真 菌 在 ITSⅠ 和 ITSⅡ 区 具 有 丰 富 变 异 的 特 点, 将 这 一 可 变 区 作 为 真 菌 分 类 鉴 定 的 依 据 之 一 为 了 根 据 ITS 区 段 对 尖 孢 镰 刀 菌 进 行 分 类, 通 过 设 计 引 物 扩 增 不 同 寄 主 尖 孢 镰 刀 菌 的 rdna ITS 区 段, 对 ITS 区 进 行 测 序 2 材 料 与 方 法 2.1 供 试 菌 株 供 试 菌 株 及 来 源 见 表 1 表 1 供 试 菌 种 及 来 源 菌 种 序 号 菌 株 编 号 菌 种 名 称 来 源 采 集 地 点 F-J 豇 豆 泉 州 F-P 花 生 泉 州 F-L 甜 椒 漳 州 诏 安 F-L 辣 椒 漳 州 诏 安 2.2 目 的 片 段 18S-28S r DNA 及 ITS 区 的 PCR 扩 增 2.3 PCR 产 物 的 纯 化 及 测 序 未 纯 化 的 PCR 产 物, 通 过 用 先 割 胶 后 过 柱 纯 化 的 方 法 继 续 纯 化, 在 自 动 DNA 测 序 仪 上 进 行 序 列 测 定 3 结 果 与 分 析 图 1 豇 豆 枯 萎 病 原 尖 孢 镰 刀 菌 菌 株 F-J 测 序 的 碱 基 序 列

12 12 第 六 卷 2004(9) 图 2 花 生 枯 萎 病 原 尖 孢 镰 刀 菌 菌 株 F-P 测 序 的 碱 基 序 列 图 3 甜 椒 枯 萎 病 原 尖 孢 镰 刀 菌 菌 株 F-L 测 序 的 碱 基 序 列 图 4 辣 椒 枯 萎 病 原 尖 孢 镰 刀 菌 菌 株 F-L 测 序 的 碱 基 序 列 测 序 时, 由 于 荧 光 染 料 的 干 扰, 测 序 结 果 在 引 物 3' 端 后 面 的 10 至 30 个, 严 重 时 可 能 达 到 70 个 以 上 碱 基 不 一 定 能 够 准 确 判 读 所 用 测 序 仪 器 为 ABI 公 司 的 仪 器, 正 常 情 况 下, 除 了 开 始 约 10 至 30 个 碱 基, 在 550bp 以 内 可 以 达 到 98.5% 以 上 的 准 确 率, 但 仪 器 及 软 件 有 时 也 会 发 生 错 读 或 漏 读 碱 基 的 情 况, 此 时 需 要 自 己 判 断 具 体 是 什 么 碱 基 所 以, 一 般 只 有 进 行 正 反 链 同 时 测 序, 在 两 个 序 列 完 全 吻 合 的 情 况 下, 才 能 确 保 所 得 序 列 100% 可 靠 单 靠 一 个 方 向 测 序 想 得 到 完 全 准 确 的 序 列 是 几 乎 不 可 能 的, 这 是 由 仪 器 本 身 的 性 能 指 标 决 定 的 正 常 情 况 下, 一 个 测 序 反 应 可 以 得 到 500 个 以 上 有 效 碱 基, 但 一 般 在 600bp 以 后 的 序 列 只 能 作 为 参 考

13 福 建 农 业 生 物 技 术 通 讯 13 分 子 标 记 GFP 质 粒 宿 主 菌 的 质 粒 DNA 的 提 取 刘 波, 周 莉 娟, 曹 宜, 车 建 美 ( 福 建 省 农 业 科 学 院 生 物 技 术 中 心, 福 州 ) 1 引 言 通 过 遗 传 转 化 途 径, 以 绿 色 荧 光 蛋 白 基 因 (Green Fluorescence Protein,GFP) 为 报 告 基 因, 通 过 电 转 化 的 方 法 将 GFP 基 因 导 入 到 青 枯 菌 基 因 组 中, 标 记 青 枯 菌 菌 株 携 带 有 绿 色 荧 光 蛋 白 基 因 的 质 粒 存 在 于 宿 主 菌 E.coli.CC118 中 本 试 验 的 目 的 为 了 提 取 和 纯 化 GFP 质 粒 宿 主 菌 的 质 粒 DNA 2 材 料 与 方 法 2.1 菌 株 和 培 养 基 菌 株 : 在 立 体 荧 光 显 微 镜 下 发 强 烈 绿 色 荧 光 的 质 粒 宿 主 菌 E.coli.CC118 培 养 基 : 加 有 抗 生 素 的 LB 培 养 基 2.2 菌 株 的 培 养 挑 取 少 许 在 -70 甘 油 保 存 的 宿 主 菌 接 种 于 含 氨 苄 青 霉 素 的 LB 固 体 平 板 培 养 基 上 活 化 从 平 板 上 挑 取 发 强 烈 绿 色 荧 光 的 质 粒 宿 主 菌 的 单 菌 落, 接 于 含 有 氨 苄 青 霉 素 和 卡 那 霉 素 的 LB 液 体 培 养 基 中, 于 28 条 件 下 振 荡 培 养 培 养 8 h 后 按 1% 接 菌 量, 取 200uL 菌 液 接 入 20mL LB 液 体 培 养 基 中,28 振 荡 培 养 过 夜, 培 养 物 用 于 下 一 步 的 提 取 质 粒 DNA 2.3 碱 裂 解 法 提 取 质 粒 DNA 1) 取 2mL 宿 主 菌 过 夜 培 养 物 加 入 2mL 离 心 管,12,000 rpm 离 心 5 min, 去 上 清 液 ; 2)200uL STE 洗 沉 淀 1-2 次 ; 3)200uL 溶 液 Ⅰ 悬 浮 细 胞, 再 加 200uL 现 配 的 溶 液 Ⅱ, 颠 倒 混 匀 4 次 后 置 冰 上 5 min; 4) 加 200uL 溶 液 Ⅲ, 颠 倒 混 匀 4 次 后 置 冰 上 5 min; 5)12,000 rpm 离 心 5 min, 小 心 吸 取 上 清 液 至 一 新 离 心 管 ; 6) 加 入 等 体 积 的 苯 酚 : 氯 仿 : 异 戊 醇 (25:24:1) 抽 提 1 次,12,000 rpm 离 心 5 min, 小 心 吸 取 上 清 液 移 至 另 一 新 离 心 管 中 ; 7) 将 上 清 液, 再 加 入 等 体 积 的 氯 仿 抽 提 1 次,12,000 rpm 离 心 5 min, 吸 取 上 清 液 移 至 另 一 新 离 心 管 中 ; 8) 上 清 液 加 入 0.6 倍 体 积 的 异 丙 醇 沉 淀 质 粒 DNA, 小 心 颠 倒 混 匀 数 次 后, 室 温 下 放 置 5 min; 9)12,000 rpm 离 心 5 min, 弃 上 清 液, 用 70% 乙 醇 清 洗 沉 淀, 吹 干 干 燥 质 粒 DNA; 10)30uL 无 菌 水 溶 解 沉 淀, 加 入 10ug/mL 的 RNA 酶,37 孵 育 30 min 后 再 于 65 条 件 下 20 min 以 抑 制 RNA 酶 活 性 ; 11) 电 泳 分 析 提 取 到 的 质 粒 DNA, 琼 脂 糖 浓 度 为 1% 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 863 计 划 项 目 (2002AA ) 作 者 简 介 : 刘 波, 从 事 生 物 技 术 和 生 物 防 治 研 究, laeptb@pub3.fz.fj.cn

14 14 第 六 卷 2004(9) 2.4 质 粒 DNA 的 检 测 和 定 量 分 析 将 提 取 到 的 质 粒 DNA 样 品 取 5uL 在 含 有 1.0% 的 琼 脂 糖 凝 胶 中 进 行 电 泳, 电 压 100 伏 特, 在 紫 外 凝 胶 成 像 仪 上 成 像 并 观 察, 电 泳 分 析 检 测 提 取 的 质 粒 DNA 的 结 果 用 紫 外 分 光 光 度 计 法 或 标 准 分 子 量 Marker 电 泳 分 析 法, 进 行 质 粒 DNA 的 定 量 分 析 3 结 果 与 分 析 采 用 碱 裂 解 法 提 取 质 粒 宿 主 菌 E.coli.CC118 的 质 粒 DNA, 提 取 的 质 粒 DNA 样 品 用 1.0% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳, 电 泳 结 果 均 出 现 了 一 条 清 晰 的 DNA 条 带 M 图 1 碱 裂 解 法 提 取 GFP 质 粒 宿 主 菌 质 粒 DNA 凝 胶 电 泳 结 果

15 福 建 农 业 生 物 技 术 通 讯 15 不 同 电 转 化 电 压 对 青 枯 菌 感 受 态 细 胞 生 长 的 影 响 刘 波, 周 莉 娟, 曹 宜, 车 建 美 ( 福 建 省 农 业 科 学 院 生 物 技 术 中 心, 福 州 ) 1 引 言 在 自 然 条 件 下, 很 多 质 粒 都 可 通 过 细 菌 接 合 作 用 转 移 到 新 的 宿 主 内, 但 在 人 工 构 建 的 质 粒 载 体 中, 一 般 缺 乏 此 种 转 移 所 必 需 的 mob 基 因, 因 此 不 能 自 行 完 成 从 一 个 细 胞 到 另 一 个 细 胞 的 接 合 转 移 如 需 将 质 粒 载 体 转 移 进 受 体 细 菌, 需 诱 导 受 体 细 菌 产 生 一 种 短 暂 的 感 受 态 以 摄 取 外 源 DNA 转 化 (Transformation) 是 将 外 源 DNA 分 子 引 入 受 体 细 胞, 使 之 获 得 新 的 遗 传 性 状 的 一 种 手 段, 它 是 微 生 物 遗 传 分 子 遗 传 基 因 工 程 等 研 究 领 域 的 基 本 实 验 技 术 转 化 过 程 所 用 的 受 体 细 胞 经 过 一 些 特 殊 方 法 ( 如 电 击 法,CaCl 2,RbCl,KCl) 等 化 学 试 剂 法 ) 的 处 理 后, 细 胞 膜 的 通 透 性 发 生 了 暂 时 性 的 改 变, 成 为 能 允 许 外 源 DNA 分 子 进 入 的 感 受 态 细 胞 (Compenent cells) 进 入 受 体 细 胞 的 DNA 分 子 通 过 复 制, 表 达 实 现 遗 传 信 息 的 转 移, 使 受 体 细 胞 出 现 新 的 遗 传 性 状 将 经 过 转 化 后 的 细 胞 在 筛 选 培 养 基 中 培 养, 即 可 筛 选 出 转 化 子 (Transformant,, 即 带 有 异 源 DNA 分 子 的 受 体 细 胞 ) 试 验 进 行 了 青 枯 菌 感 受 态 细 胞 的 制 备, 并 采 用 不 同 的 电 转 化 电 压 进 行 电 击, 观 察 电 转 化 电 压 对 青 枯 菌 感 受 态 细 胞 生 长 的 影 响 2 材 料 与 方 法 2.1 材 料 (1) 青 枯 菌 菌 株 : 菌 株 序 号 :61; 菌 株 编 号 :Rs-F A; 来 源 : 茄 子 植 株 ; 采 集 地 点 : 福 州 北 峰 (2)Eppendorf 电 转 化 仪 (3)Eppendorf 离 心 机 (4) 所 用 试 剂 为 国 产 分 析 纯 2.2 方 法 青 枯 菌 感 受 态 制 备 挑 取 青 枯 菌 的 单 菌 落 至 25 ml 的 SPA 液 体 培 养 基 中,30,180 rpm 培 养 过 夜, 按 照 1% 的 比 例 取 过 夜 培 养 的 菌 液 (OD 650 =2.303), 加 入 到 新 配 制 的 SPA 液 体 培 养 基 中, 同 样 条 件 下 培 养, 分 别 于 OD 650 =0.854 和 OD 650 =1.092 时 取 40 ml 菌 液 转 移 至 离 心 管 冰 浴 15 min,6000 rpm,4 离 心 10 min, 收 集 菌 体 细 胞, 用 4 预 冷 的 无 菌 水 洗 菌 体 细 胞 ( 无 菌 水 用 量 逐 次 递 减 ), 最 后 将 细 胞 悬 浮 于 600 µl 和 800 µl 的 10% 甘 油 中 电 转 化 电 转 化 条 件 见 表 1 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 863 计 划 项 目 (2002AA ) 作 者 简 介 : 刘 波, 从 事 生 物 技 术 和 生 物 防 治 研 究, laeptb@pub3.fz.fj.cn

16 16 第 六 卷 2004(9) 表 1 感 受 态 细 胞 的 电 转 化 条 件 感 受 态 细 胞 编 号 电 转 化 设 定 电 压 (V) I II III IV V VI 1(OD650=0.854) (OD650=1.092) 注 : 感 受 态 细 胞 进 行 2 次 连 续 电 击, 表 中 的 2 个 电 压 分 别 为 第 一 次 的 设 定 电 压 和 第 二 次 的 设 定 电 压 由 于 本 试 验 主 要 观 察 电 转 化 电 压 对 青 枯 菌 感 受 态 细 胞 生 长 的 影 响, 因 此 在 转 化 过 程 中 没 有 加 入 质 粒 DNA 电 转 化 过 程 如 下 : 采 用 1 mm 的 转 化 杯, 将 感 受 态 细 胞 和 转 化 杯 预 冷 min, 将 100 µl 的 感 受 态 细 胞 加 入 转 化 杯 后 在 冰 上 置 10 min, 电 转 化 仪 上 先 设 定 好 参 数, 然 后 将 转 化 杯 放 入 槽 中 进 行 电 转 化, 转 化 结 束 后 立 即 加 入 1 ml 的 SPA 培 养 基, 混 匀 后 转 入 2 ml 离 心 管 中,30 振 荡 培 养, 分 别 于 培 养 2 h 5 h 和 过 夜 (ON) 后, 取 100 µl 涂 在 SPA 固 体 培 养 基 和 添 加 12.5 µg/ml 的 新 霉 素 的 SPA 固 体 培 养 基 上, 观 察 菌 落 的 生 长 情 况, 以 未 进 行 电 转 化 的 感 受 态 细 胞 未 对 照 3 结 果 与 分 析 试 验 结 果 见 表 2, 表 3 和 图 1- 图 22 添 加 12.5 µg/ml 的 新 霉 素 的 SPA 固 体 培 养 基 上 均 未 长 出 任 何 菌 落, 说 明 不 同 时 期 的 感 受 态 细 胞 经 不 同 电 压 电 转 化 后 均 不 具 有 新 霉 素 抗 性 不 同 时 期 的 感 受 态 细 胞 经 不 同 电 压 电 转 化 后 在 SPA 固 体 培 养 基 上 长 出 的 菌 落 数 差 异 较 大,OD 650 =0.854 的 感 受 态 细 胞 经 电 击 后, 生 长 的 菌 落 较 少, 而 OD 650 =1.092 的 感 受 态 细 胞 经 电 击 后, 生 长 的 菌 落 较 多, 无 法 计 数, 说 明 不 同 时 期 的 感 受 态 细 胞 经 不 同 电 压 电 转 化 后 的 活 力 不 同, 死 亡 菌 体 的 数 量 也 不 同 OD 650 =0.854 的 感 受 态 细 胞 经 不 同 电 压 电 转 化 后, 活 力 也 有 所 不 同, 第 一 次 电 压 为 2500V 时 对 感 受 态 细 胞 生 长 的 影 响 较 大, 培 养 之 后 长 出 的 菌 落 较 少 OD 650 =1.092 的 感 受 态 细 胞 经 不 同 电 压 电 转 化 后, 生 长 情 况 差 别 不 明 显 表 2 不 同 电 转 化 电 压 对 感 受 态 细 胞 生 长 的 影 响 (SPA 培 养 基 ) 培 养 时 间 1-I 1-II 1-III 1-IV 1-V 1-VI 2h h 过 夜 注 : 数 字 : 生 长 的 菌 落 数,-: 未 长 任 何 菌 落 表 3 不 同 电 转 化 电 压 对 感 受 态 细 胞 生 长 的 影 响 (SPA 培 养 基 ) 培 养 时 间 2-I 2-II 2-III 2-IV 2-V 2-VI 2h h 过 夜 注 :++++: 菌 体 生 长 旺 盛, 无 法 计 数

17 福 建 农 业 生 物 技 术 通 讯 17 图 1 1-I-2h-SPA 图 2 1-II-2h-SPA 图 3 1-III-2h-SPA 图 4 1-IV-2h-SPA 图 5 1-V-2h-SPA 图 6 1-VI-2h-SPA 图 7 1-I-5h-SPA 图 8 1-II-5h-SPA 图 9 1-III-5h-SPA 图 10 1-IV-5h-SPA 图 11 1-V-5h-SPA 图 12 1-VI-5h-SPA 图 13 1-I-2h-SPA + 图 14 1-I-5h-SPA + 图 SPA 图 16 2-SPA 图 17 2-II-2h-SPA 图 18 2-I-5h-SPA 图 19 2-I-2h-SPA + 图 20 2-I-5h-SPA +

18 18 第 六 卷 2004(9) 图 21 2-II-ON-SPA 图 22 2-I-ON-SPA 注 :2-I-2h-SPA + 表 示 :OD650=1.092 的 感 受 态 细 胞 在 第 二 种 电 压 条 件 下 电 击 后, 培 养 2h 涂 布 于 添 加 新 霉 素 的 SPA 固 体 培 养 基 上

19 福 建 农 业 生 物 技 术 通 讯 19 鸡 大 肠 杆 菌 和 阴 沟 肠 杆 菌 对 抗 生 素 抗 性 的 研 究 曹 宜 1, 周 涵 韬 2, 张 赛 群 2 2, 朱 红 梅 (1 福 建 省 农 业 科 学 院 生 物 技 术 中 心 2 厦 门 大 学 生 命 科 学 院 ) 1 引 言 本 试 验 研 究 了 鸡 大 肠 杆 菌 和 阴 沟 肠 杆 菌 对 不 同 抗 生 素 ( 氨 苄 青 霉 素 壮 观 霉 素 卡 那 霉 素 ) 的 敏 感 性, 为 进 一 步 进 行 鸡 大 肠 杆 菌 和 阴 沟 肠 杆 菌 的 GFP 基 因 的 转 化 提 供 了 相 应 抗 生 素 的 抗 性 背 景 2 材 料 与 方 法 2.1 试 验 菌 株 供 试 的 2 个 菌 株 为 鸡 大 肠 杆 菌 (E.coli), 即 大 肠 杆 菌 O78, 来 源 于 莆 田 40 余 日 龄 番 鸭, 在 实 验 室 用 麦 康 凯 培 养 基 分 离 得 到 的 ; 另 1 个 菌 株 为 阴 沟 肠 杆 菌 (E.C) 2.2 试 剂 氨 苄 青 霉 素 壮 观 霉 素 卡 那 霉 素, 购 自 上 海 生 工 2.3 抗 性 培 养 基 的 配 制 采 用 LB 固 体 培 养 基, 添 加 不 同 浓 度 的 抗 生 素 ( 见 表 1), 设 不 添 加 任 何 抗 生 素 的 LB 培 养 基 为 对 照 2.4 菌 株 对 抗 生 素 的 敏 感 性 试 验 将 鸡 大 肠 杆 菌 和 阴 沟 肠 杆 菌 2 个 菌 株 分 别 接 菌 于 LB 液 体 培 养 基 中, 培 养 至 对 数 生 长 期, 分 别 取 4μL 涂 布 于 未 添 加 和 添 加 不 同 浓 度 抗 生 素 的 LB 固 体 平 板 培 养 基 上, 置 于 30 培 养 48 h 后 观 察 其 抗 性 情 况 表 1 LB 培 养 基 中 抗 生 素 的 浓 度 编 号 CK 氨 苄 青 霉 素 (μg/ml) 壮 观 霉 素 (μg/ml) 卡 那 霉 素 (μg/ml) 结 果 与 分 析 试 验 结 果 见 表 2, 供 试 菌 株 鸡 大 肠 杆 菌 和 阴 沟 肠 杆 菌 在 含 有 不 同 浓 度 (80 μg/ml 100 μg/ml 150 μg/ml 200 μg/ml 300 μg/ml) 的 氨 苄 青 霉 素 的 LB 固 体 培 养 基 上 均 能 生 长, 因 而 鸡 大 肠 杆 菌 和 阴 沟 肠 杆 菌 对 氨 苄 青 霉 素 具 有 抗 性 表 3 中 可 见, 鸡 大 肠 杆 菌 在 不 同 浓 度 (80 μg/ml 100 μg/ml) 的 壮 观 霉 素 的 LB 固 体 培 养 基 上 都 能 生 长, 说 明 鸡 大 肠 杆 菌 对 壮 观 霉 素 具 有 抗 性 ; 阴 沟 肠 杆 菌 在 不 同 浓 度 的 壮 观 霉 素 的 LB 培 养 基 上 均 不 能 生 长, 说 明 阴 沟 肠 杆 菌 对 壮 观 霉 素 具 有 敏 感 性 表 4 中 可 见, 鸡 大 肠 杆 菌 和 阴 沟 肠 杆 菌 在 不 同 浓 度 (100 μg/ml 200 μg/ml 300 μg/ml) 的 卡 那 霉 素 的 LB 培 养 基 上 都 不 能 生 长, 说 明 鸡 大 肠 杆 菌 和 阴 沟 肠 杆 菌 对 卡 那 霉 素 具 有 敏 感 性 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 863 计 划 项 目 (2002AA ) 作 者 简 介 : 曹 宜 (1976-), 硕 士 研 究 生 * 通 讯 作 者 : 刘 波, 从 事 生 物 技 术 和 生 物 防 治 研 究, laeptb@pub3.fz.fj.cn

20 20 第 六 卷 2004(9) 表 2 鸡 大 肠 杆 菌 和 阴 沟 肠 杆 菌 对 氨 苄 青 霉 素 的 敏 感 性 编 号 CK E.coli E.C 注 :E.coli 为 鸡 大 肠 杆 菌 ;E.C 为 阴 沟 肠 杆 菌 ++++: 强 ;+++: 较 强 ;++: 弱 表 3 鸡 大 肠 杆 菌 和 阴 沟 肠 杆 菌 对 氨 苄 青 霉 素 的 敏 感 性 编 号 CK E.coli E.C 注 :E.coli 为 鸡 大 肠 杆 菌 ;E.C 为 阴 沟 肠 杆 菌 ++++: 强 ;+++: 较 强 ;++: 弱 表 4 鸡 大 肠 杆 菌 和 阴 沟 肠 杆 菌 对 壮 观 霉 素 的 敏 感 性 编 号 1 2 CK E.coli E.C 注 :E.coli 为 鸡 大 肠 杆 菌 ;E.C 为 阴 沟 肠 杆 菌 ++++: 强 ;+++: 较 强 ;++: 弱 ;-: 没 有 菌 落 生 长 表 5 鸡 大 肠 杆 菌 和 阴 沟 肠 杆 菌 对 卡 那 霉 素 的 敏 感 性 编 号 CK E.coli E.C 注 :E.coli 为 鸡 大 肠 杆 菌 ;E.C 为 阴 沟 肠 杆 菌 ++++: 强 ;-: 没 有 菌 落 生 长

21 福 建 农 业 生 物 技 术 通 讯 21 生 物 防 治 生 防 菌 拮 抗 -2 培 养 液 无 菌 滤 液 及 蛋 白 粗 提 液 对 西 瓜 枯 萎 病 尖 孢 镰 刀 菌 的 抑 制 作 用 试 验 * 葛 慈 斌, 朱 育 菁, 陈 璐, 刘 波 ( 福 建 省 农 业 科 学 院 生 物 技 术 中 心, 福 州 ) 1 引 言 前 次 试 验 ( 见 报 告 ) 筛 选 出 的 含 固 量 较 低 的 A 组 B 组 和 LB 培 养 基, 虽 然 不 是 很 适 合 于 菌 株 拮 抗 -2 的 生 长, 培 养 液 的 菌 体 含 量 不 高, 但 这 些 培 养 液 对 西 瓜 枯 萎 病 尖 孢 镰 刀 菌 (Fusarium oxysporum Schl.) 具 有 较 强 的 抑 制 作 用, 抑 菌 圈 直 径 明 显 的 比 含 豆 饼 粉 的 培 养 液 的 大, 这 说 明, 在 菌 株 拮 抗 -2 培 养 液 中, 菌 体 生 长 量 与 抗 菌 物 质 的 产 生 之 间 不 存 在 相 关 关 系 本 试 验 的 目 的 在 于 检 测 菌 株 拮 抗 -2 培 养 液 无 菌 滤 液 是 否 具 有 抑 菌 作 用, 并 用 硫 酸 铵 沉 淀 无 菌 滤 液 中 的 蛋 白 类 物 质, 测 定 其 是 否 具 有 抑 菌 活 性, 以 分 析 无 菌 滤 液 中 的 有 效 物 质 的 成 分, 现 将 结 果 报 道 如 下 2 材 料 与 方 法 2.1 材 料 A 组 B 组 和 LB 培 养 基 培 养 的 菌 株 拮 抗 -2 和 菌 株 Nong-20 # 培 养 液 ; 指 示 菌 为 西 瓜 枯 萎 病 尖 孢 镰 刀 菌, 培 养 基 为 PDA; 固 体 硫 酸 铵 牛 津 杯 镊 子 等 2.2 菌 株 拮 抗 -2 和 Nong-20 # 培 养 液 的 过 滤 除 菌 硫 酸 铵 沉 淀 蛋 白 处 理 取 少 量 的 培 养 液,9000r/min 离 心 20min 后, 上 清 液 先 用 抽 滤 式 细 菌 过 滤 器 过 滤, 滤 液 再 用 针 筒 式 细 菌 滤 器 ( 滤 膜 孔 径 φ=0.22u) 过 滤, 得 无 菌 滤 液 ; 取 15ml 部 分 无 菌 滤 液, 在 磁 力 搅 拌 下 缓 慢 加 入 固 体 硫 酸 铵 至 饱 和 ( 大 约 加 入 12.0g), 置 4 下 过 夜, 次 日 r/min 离 心 20min, 收 集 上 清, 沉 淀 以 0.04mol/l 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 悬 浮, 即 得 粗 蛋 白 液 ( 在 硫 酸 铵 沉 淀 过 程 中, 可 观 察 到 B 组 培 养 液 有 大 量 的 絮 状 沉 淀 析 出, 离 心 后, 管 底 有 较 多 的 沉 淀 ) 2.3 抑 菌 圈 测 定 试 验 西 瓜 枯 萎 病 菌 孢 子 悬 液 的 制 备 : 镰 刀 菌 菌 株 在 PDA 平 板 上 活 化 后 4 天 后, 向 平 板 内 倒 入 15ml 无 菌 水, 收 集 孢 子 及 菌 丝 体 悬 液 ; 用 无 菌 纱 布 滤 去 菌 丝 体, 得 孢 子 悬 液, 备 用 吸 取 镰 刀 菌 孢 子 悬 液 0.5ml, 加 入 到 熔 化 并 冷 却 到 50 的 6ml 0.7% 琼 脂 的 PDA 培 养 基 内, 混 合 均 匀 后, 作 为 上 层 培 养 基, 倾 覆 在 预 先 已 凝 固 的 PDA 平 板 上 待 上 层 培 养 基 凝 固 后, 在 每 块 平 板 上 放 置 4 个 牛 津 杯 ( 直 径 : 内 0.6cm 外 0.8cm, 高 1.0cm), 用 移 液 枪 分 别 向 每 个 牛 津 杯 内 加 入 无 菌 水 ( 或 恶 霉 灵 400 倍 液 ) 各 培 养 液 无 菌 滤 液 粗 蛋 白 液 和 沉 淀 蛋 白 过 程 中 的 上 清 液 ( 简 称 上 清 ) 各 200ul, 然 后 将 平 板 放 置 在 26 培 养 箱 培 养 48h 后, 测 量 抑 菌 圈 的 直 径, 比 较 各 菌 株 抑 菌 能 力 的 大 小 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 863 计 划 项 目 (2002AA ) 作 者 简 介 : 葛 慈 斌 (1973-), 男, 波 恩 大 学 博 士 研 究 生 * 通 讯 作 者 : 刘 波, 从 事 生 物 技 术 和 生 物 防 治 研 究, laeptb@pub3.fz.fj.cn

22 22 第 六 卷 2004(9) 3 结 果 与 分 析 试 验 结 果 ( 表 1 及 图 1-6) 表 明,A 组 B 组 和 LB 培 养 基 培 养 的 菌 株 拮 抗 -2 的 培 养 液 无 菌 滤 液 均 能 够 在 尖 孢 镰 刀 菌 PDA 平 板 上 产 生 清 晰 的 抑 菌 圈, 其 中 A 组 培 养 液 的 抑 菌 圈 直 径 最 大, 为 18.5mm, 与 阳 性 对 照 恶 霉 灵 400 倍 液 的 抑 菌 圈 直 径 (19.0mm) 之 间 无 显 著 差 异, 但 显 著 地 比 B 组 和 LB 培 养 液 的 大 ;LB 培 养 液 的 抑 菌 圈 直 径 最 小, 仅 为 13.5mm A 组 B 组 和 LB 培 养 基 培 养 的 菌 株 Nong-20 # 的 培 养 液 无 菌 滤 液 不 能 在 尖 孢 镰 刀 菌 PDA 平 板 上 产 生 抑 菌 圈 从 菌 株 拮 抗 -2 培 养 液 无 菌 滤 液 中 提 取 的 粗 蛋 白 液, 也 不 能 形 成 抑 菌 圈 * 表 1 菌 株 拮 抗 -2 培 养 液 无 菌 滤 液 对 西 瓜 枯 萎 病 尖 孢 镰 刀 菌 的 抑 制 作 用 供 试 菌 液 抑 菌 圈 直 径 (mm) A 组 18.5a B 组 17.2b LB 13.5c 阳 性 对 照 - 恶 霉 灵 400 倍 液 19.0a * 在 同 一 栏 内, 带 相 同 字 母 的 数 字 在 Duncan s 新 复 极 差 测 验 的 多 重 比 较 P<0.01 时 没 有 差 异 图 1 菌 株 拮 抗 -2 的 A 组 培 养 液 无 菌 滤 液 粗 蛋 白 液 的 抑 菌 圈 试 验 结 果 ( 正 面, 左 上 角 为 拮 抗 -2, 右 上 角 为 恶 霉 灵 400 倍 液 ) 图 2 菌 株 拮 抗 -2 的 A 组 培 养 液 无 菌 滤 液 粗 蛋 白 液 的 抑 菌 圈 试 验 结 果 ( 反 面, 右 下 角 为 拮 抗 -2, 左 上 角 为 恶 霉 灵 400 倍 液 ) 图 3 菌 株 拮 抗 -2 的 B 组 培 养 液 无 菌 滤 液 粗 蛋 白 液 的 抑 菌 圈 试 验 结 果 ( 正 面, 左 上 角 为 拮 抗 -2, 右 上 角 为 CK) 图 4 菌 株 拮 抗 -2 的 B 组 培 养 液 无 菌 滤 液 粗 蛋 白 液 的 抑 菌 圈 试 验 结 果 ( 反 面, 右 上 角 为 拮 抗 -2, 左 上 角 为 CK) 图 5 菌 株 Nong-20# 的 B 组 培 养 液 无 菌 滤 液 粗 蛋 白 液 的 抑 菌 圈 试 验 结 果 ( 正 面, 没 有 形 成 抑 菌 圈 ) 图 6 菌 株 Nong-20# 的 B 组 培 养 液 无 菌 滤 液 粗 蛋 白 液 的 抑 菌 圈 试 验 结 果 ( 反 面, 没 有 形 成 抑 菌 圈 ) 试 验 结 果 表 明,A 组 B 组 和 LB 培 养 基 培 养 的 菌 株 拮 抗 -2 的 培 养 液 无 菌 滤 液 均 能 够 在 尖 孢 镰 刀 菌 PDA 平 板 上 产 生 清 晰 的 抑 菌 圈, 说 明 菌 株 拮 抗 -2 中 含 有 对 枯 萎 病 菌 具 有 抑 制 作 用 的 活 性 物 质, 但 是 从 这 些 无 菌 滤 液 提 取 的 粗 蛋 白 液, 不 能 形 成 抑 菌 圈, 说 明 这 些 活 性 物 质 的 主 要 成 分 可 能 不 是 蛋 白 类 物 质 ;A 组 B 组 和

23 福 建 农 业 生 物 技 术 通 讯 23 LB 培 养 基 培 养 的 菌 株 Nong-20 # 的 培 养 液 无 菌 滤 液 不 能 在 尖 孢 镰 刀 菌 PDA 平 板 上 产 生 抑 菌 圈 芽 孢 杆 菌 是 土 壤 和 植 物 微 生 态 的 优 势 微 生 物 种 群, 具 有 很 强 的 抗 逆 能 力 和 抗 菌 防 病 作 用, 许 多 性 状 优 良 的 菌 株 已 成 功 地 应 用 于 植 物 病 害 生 物 防 治 芽 孢 杆 菌 抗 菌 防 病 机 制 包 括 竞 争 作 用 拮 抗 作 用 和 诱 导 植 物 抗 病 性 其 中, 核 糖 体 合 成 的 细 菌 素 几 丁 质 酶 和 葡 聚 糖 酶 等 抗 菌 蛋 白 以 及 次 生 代 谢 产 生 的 抗 生 素 与 挥 发 性 抗 菌 物 质 产 生 的 拮 抗 作 用 是 生 防 细 菌 最 主 要 的 抗 菌 机 制 [1] 何 红 等 从 辣 椒 体 内 分 离 到 菌 株 BS-2, 用 30%-70% 的 硫 酸 铵 从 该 菌 株 培 养 液 盐 析 出 的 蛋 白 类 物 质 对 植 物 炭 疽 病 和 番 茄 青 枯 病 等 多 种 植 物 病 原 真 菌 和 细 菌 有 强 烈 的 抑 制 作 用 [2] 王 雅 平 等 从 拮 抗 菌 (Bacillus spp.)tg26 菌 株 的 BPY 培 养 液 中 分 离 纯 化 出 对 小 麦 赤 霉 病 菌 具 有 强 烈 特 异 性 抑 制 活 性 的 抗 真 菌 蛋 白 BII [3] 本 试 验 从 菌 株 拮 抗 -2 培 养 液 中 在 硫 酸 铵 饱 和 的 情 况 下 盐 析 出 的 粗 蛋 白, 没 有 表 现 出 对 枯 萎 病 菌 的 抑 制 作 用, 这 可 能 是 因 为 菌 株 拮 抗 -2 的 抑 菌 活 性 物 质 可 能 不 是 蛋 白 类 物 质, 也 可 能 是 因 为 在 盐 析 方 法 上 不 妥 当 ( 硫 酸 铵 浓 度 过 高 ) 关 于 菌 株 拮 抗 -2 的 抑 菌 活 性 物 质 的 性 质 和 成 分, 有 待 于 进 一 步 的 研 究 参 考 文 献 [1] 陈 中 义, 张 杰, 黄 大 肪. 植 物 病 害 生 防 芽 孢 杆 菌 抗 菌 机 制 与 遗 传 改 良 研 究 [J]. 植 物 病 理 学 报,2003,33(2): [2] 何 红, 蔡 学 清, 关 雄, 等. 内 生 菌 BS-2 菌 株 的 抗 菌 蛋 白 及 其 防 病 作 用. 植 物 病 理 学 报,2003,33(4): [3] 王 雅 平, 刘 伊 强, 潘 乃 燧, 等. 抗 真 菌 蛋 白 BII 的 分 离 纯 化 及 其 性 质 研 究. 生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报,1993,25(4): 生 防 菌 拮 抗 -2 培 养 液 无 菌 滤 液

24 24 第 六 卷 2004(9) 抑 菌 谱 的 测 定 试 验 * 葛 慈 斌, 朱 育 菁, 史 怀, 刘 波 ( 福 建 省 农 业 科 学 院 生 物 技 术 中 心, 福 州 ) 1 引 言 前 次 试 验 ( 见 报 告 ) 结 果 表 明, 生 防 菌 菌 株 拮 抗 -2 培 养 液 无 菌 滤 液 对 西 瓜 枯 萎 病 尖 孢 镰 刀 菌 (Fusarium oxysporum Schl.) 具 有 较 强 的 抑 制 作 用, 抑 菌 圈 直 径 可 达 18.5mm 本 试 验 的 目 的 在 于 用 抑 菌 圈 法 测 定 不 同 培 养 基 培 养 的 菌 株 拮 抗 -2 无 菌 滤 液 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 大 肠 杆 菌 鳄 梨 根 腐 病 原 菌 Verticillium theobromae 2202 菌 株 蘑 菇 干 泡 病 (dry bubble disease) 病 原 菌 V. fungicola 2352 菌 株 棉 花 黄 萎 病 病 原 菌 大 丽 轮 枝 菌 (V. dahliae)11938 菌 株 和 黑 白 轮 枝 菌 (V. albo-atrum)12230 菌 株 是 否 具 有 抑 制 作 用, 现 将 结 果 报 道 如 下 2 材 料 与 方 法 2.1 材 料 A 组 B 组 和 LB 培 养 基 培 养 的 菌 株 拮 抗 -2 培 养 液 无 菌 滤 液 ; 指 示 菌 为 青 枯 雷 尔 氏 菌 强 致 病 力 菌 株 Rs-60-V 和 无 致 病 力 菌 株 Rs-60-A 大 肠 杆 菌 K88 菌 株 由 本 研 究 室 保 存, 病 原 真 菌 V. theobromae 2202 菌 株 V. fungicola 2352 菌 株 大 丽 轮 枝 菌 (V. dahliae)11938 菌 株 和 黑 白 轮 枝 菌 (V. albo-atrum)12230 菌 株 由 德 国 菌 种 保 存 中 心 (DSMZ) 提 供, 摇 瓶 培 养 用 土 豆 汁 - 葡 萄 糖 培 养 基, 固 体 培 养 基 为 PDA 2.2 指 示 菌 菌 液 的 制 备 菌 株 Rs-60-V Rs-60-A 菌 液 的 制 备 : 从 长 势 旺 盛 的 菌 株 Rs-60-V Rs-60-A 大 肠 杆 菌 K88 菌 株 平 板 挑 取 菌 落, 悬 浮 在 少 量 的 无 菌 水 中, 即 制 成 菌 液, 备 用 ; 病 原 真 菌 孢 子 悬 液 的 制 备 : 挑 取 少 量 的 这 4 个 病 原 真 菌 菌 丝, 接 种 在 土 豆 汁 - 葡 萄 糖 培 养 基 内, 置 r/min 恒 温 摇 床 振 荡 培 养 7d, 用 无 菌 纱 布 滤 去 培 养 液 中 的 菌 丝 体, 得 孢 子 悬 液, 备 用 2.3 抑 菌 圈 测 定 试 验 吸 取 上 述 制 备 好 的 菌 株 Rs-60-V Rs-60-A 菌 液 大 肠 杆 菌 K88 菌 株 和 4 株 病 原 真 菌 的 孢 子 悬 液 各 0.5ml, 加 入 到 熔 化 并 冷 却 到 50 的 6ml 0.7% 琼 脂 的 PDA 培 养 基 内, 混 合 均 匀 后, 作 为 上 层 培 养 基, 倾 覆 在 已 凝 固 的 常 用 PDA 平 板 上 待 上 层 培 养 基 凝 固 后, 在 每 块 平 板 上 放 置 4 个 牛 津 杯 ( 直 径 : 内 -0.6cm 外 -0.8cm, 高 1.0cm), 用 移 液 枪 分 别 向 每 个 牛 津 杯 内 加 入 无 菌 水 ( 或 恶 霉 灵 400 倍 液 ) 菌 株 拮 抗 -2 培 养 液 无 菌 滤 液 各 200ul, 置 于 27 培 养 箱 培 养 40h 后, 测 量 抑 菌 圈 的 直 径, 比 较 各 菌 株 抑 菌 能 力 的 大 小 3 结 果 与 分 析 试 验 结 果 ( 表 1 及 图 1-6) 表 明,A 组 B 组 和 LB 培 养 基 培 养 的 菌 株 拮 抗 -2 的 培 养 液 无 菌 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 863 计 划 项 目 (2002AA ) 作 者 简 介 : 葛 慈 斌 (1973-), 男, 波 恩 大 学 博 士 研 究 生 * 通 讯 作 者 : 刘 波, 从 事 生 物 技 术 和 生 物 防 治 研 究, laeptb@pub3.fz.fj.cn 滤 液 对 供 试 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 大 丽 轮 枝 菌 等 6 种 植 物 病 原 真 菌 或 细 菌 及 大 肠 杆 菌 K88 菌 株 都 具 有 较 强 的 抑 制 作 用, 抑 菌 圈 直 径 均 在 10.2mm 以 上, 其 中 以 对 黑 白 轮 枝 菌 的 抑 制 作 用 最 强,A 组 和 B 组 培 养 液 的 抑 菌

25 福 建 农 业 生 物 技 术 通 讯 25 圈 直 径 分 别 为 21.9 和 21.0mm 比 较 A 组 B 组 和 LB 培 养 基 培 养 的 菌 株 拮 抗 -2 无 菌 滤 液 对 这 6 株 植 物 病 原 真 菌 或 细 菌 及 大 肠 杆 菌 K88 菌 株 的 抑 制 作 用 的 差 异, 可 以 发 现,A 组 和 B 组 培 养 液 无 菌 滤 液 的 抑 菌 圈 直 径 显 著 地 比 LB 培 养 基 的 大 (P<0.01), 说 明 这 2 组 培 养 基 比 LB 培 养 基 更 适 合 于 菌 株 拮 抗 -2 产 生 抗 菌 物 质 另 外 还 试 验 了 2 种 竹 玉 液 对 Rs-59-A 和 大 丽 轮 枝 菌 的 抑 制 作 用, 结 果 ( 表 2 和 图 5-6) 表 明 竹 玉 液 对 这 2 个 菌 株 也 有 较 强 的 抑 制 作 用, 抑 菌 圈 直 径 均 在 25.1mm 以 上, 竹 玉 液 2 的 形 成 的 抑 菌 圈 直 径 显 著 地 比 竹 玉 液 1 的 大 (P<0.01) * 表 1 菌 株 拮 抗 -2 培 养 液 无 菌 滤 液 对 7 株 植 物 病 原 真 菌 或 细 菌 的 抑 制 作 用 指 示 菌 菌 株 拮 抗 -2 培 养 液 无 菌 滤 液 形 成 的 抑 菌 圈 直 径 (mm) A 组 B 组 LB Rs-60-V 14.7a 14.1a 10.2b Rs-59-A --- ** Verticillium theobromae 16.6a 16.6a 11.5b Verticillium fungicola 18.2a 18.0a 10.8b 大 丽 轮 枝 菌 黑 白 轮 枝 菌 21.9a 21.0a 15.6b 大 肠 杆 菌 K88 菌 株 * 在 同 一 行 内, 带 相 同 字 母 的 数 字 在 Duncan s 新 复 极 差 测 验 的 多 重 比 较 P<0.01 时 没 有 差 异 ** 该 处 理 用 于 试 验 其 它 药 剂 的 抑 菌 能 力 指 示 菌 * 表 2 两 种 竹 玉 液 对 Rs-59-A 和 大 丽 轮 枝 菌 的 抑 制 作 用 2 种 竹 玉 液 形 成 的 抑 菌 圈 直 径 (mm) 竹 玉 液 1 竹 玉 液 2 Rs-59-A 33.1a 38.8b 大 丽 轮 枝 菌 25.1a 35.5b * 在 同 一 行 内, 带 相 同 字 母 的 数 字 在 Duncan s 新 复 极 差 测 验 的 多 重 比 较 P<0.01 时 没 有 差 异 图 1 菌 株 拮 抗 -2 培 养 液 无 菌 滤 液 对 菌 株 V. theobromae 的 抑 制 作 用 ( 正 面, 左 上 角 为 A 组, 左 下 角 为 B 组, 右 下 角 为 LB 组 ) 图 2 菌 株 拮 抗 -2 培 养 液 无 菌 滤 液 对 菌 株 V. theobromae 的 抑 制 作 用 ( 反 面, 右 上 角 为 A 组, 右 下 角 为 B 组, 左 下 角 为 LB 组 ) 图 3 菌 株 拮 抗 -2 培 养 液 无 菌 滤 液 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 菌 株 Rs-60-V 的 抑 制 作 用 ( 正 面, 左 上 角 为 A 组, 左 下 角 为 B 组, 右 下 角 为 LB 组 )

26 26 第 六 卷 2004(9) 图 4 菌 株 拮 抗 -2 培 养 液 无 菌 滤 液 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 菌 株 Rs-60-V 的 抑 制 作 用 ( 反 面, 右 上 角 为 A 组, 右 下 角 为 B 组, 左 下 角 为 LB 组 ) 图 5 菌 株 拮 抗 -2 培 养 液 无 菌 滤 液 和 2 个 药 剂 对 大 丽 轮 枝 菌 的 抑 制 作 用 ( 正 面, 左 上 角 为 竹 玉 液 1, 左 下 角 为 B 组 拮 抗 -2 培 养 液, 右 下 角 为 竹 玉 液 2 ) 图 6 菌 株 拮 抗 -2 培 养 液 无 菌 滤 液 和 2 个 药 剂 对 大 丽 轮 枝 菌 的 抑 制 作 用 ( 反 面, 右 上 角 为 竹 玉 液 1, 右 下 角 为 B 组 拮 抗 -2 培 养 液, 左 下 角 为 竹 玉 液 2 ) 试 验 结 果 表 明, 菌 株 拮 抗 -2 培 养 液 无 菌 滤 液 对 供 试 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 大 丽 轮 枝 菌 等 6 种 植 物 病 原 真 菌 或 细 菌 及 大 肠 杆 菌 K88 菌 株 都 具 有 较 强 的 抑 制 作 用 ;A 组 和 B 组 培 养 液 无 菌 滤 液 的 抑 菌 作 用 显 著 地 比 LB 培 养 液 的 强, 说 明 这 2 组 培 养 基 比 LB 培 养 基 更 适 合 于 菌 株 拮 抗 -2 产 生 抗 菌 物 质 ;2 种 竹 玉 液 对 Rs-59-A 和 大 丽 轮 枝 菌 也 具 有 较 强 的 抑 制 作 用 芽 孢 杆 菌 是 土 壤 和 植 物 微 生 态 的 优 势 微 生 物 种 群, 具 有 很 强 的 抗 逆 能 力 和 抗 菌 防 病 作 用, 许 多 性 状 优 良 的 菌 株 已 成 功 地 应 用 于 植 物 病 害 生 物 防 治 [1] 朱 伟 光 等 从 91 株 大 气 腐 生 菌 中 筛 选 出 13 株 对 9 种 植 物 病 原 细 菌 有 抑 制 作 用 的 菌 株, 其 中 以 Bacillus cereus G35 的 拮 抗 物 质 具 有 蛋 白 质 的 性 质 [2] 何 红 等 从 辣 椒 体 内 分 离 到 菌 株 BS-2, 其 分 泌 的 蛋 白 类 物 质 对 植 物 炭 疽 病 和 番 茄 青 枯 病 等 多 种 植 物 病 原 真 菌 和 细 菌 有 强 烈 的 抑 制 作 用 [3] 与 上 述 的 菌 株 相 似, 本 试 验 测 试 的 菌 株 拮 抗 -2 也 具 有 杀 菌 谱 广 抑 菌 能 力 强 的 特 点, 具 备 开 发 成 植 物 病 害 生 防 菌 剂 的 潜 质 参 考 文 献 [1] 陈 中 义, 张 杰, 黄 大 肪. 植 物 病 害 生 防 芽 孢 杆 菌 抗 菌 机 制 与 遗 传 改 良 研 究 [J]. 植 物 病 理 学 报,2003,33(2): [2] 朱 伟 光, 李 德 葆, 葛 起 新, 等. 植 物 病 原 细 菌 拮 抗 菌 及 其 拮 抗 物 质 测 定 ---Bacillus cereus G35 的 产 素 特 性 与 质 粒 关 系. 浙 江 农 业 大 学 学 报,1990,16(4): [3] 何 红, 蔡 学 清, 关 雄, 等. 内 生 菌 BS-2 菌 株 的 抗 菌 蛋 白 及 其 防 病 作 用. 植 物 病 理 学 报,2003,33(4):

27 福 建 农 业 生 物 技 术 通 讯 27 竹 玉 液 对 西 瓜 尖 孢 镰 刀 菌 抑 制 作 用 测 定 * 葛 慈 斌, 朱 育 菁, 史 怀, 刘 波 ( 福 建 省 农 业 科 学 院 生 物 技 术 中 心, 福 州 ) 1 引 言 竹 玉 液 是 福 建 松 溪 县 南 山 炭 业 有 限 公 司 从 纯 天 然 竹 油 提 炼 而 成 的 一 种 药 剂, 具 有 祛 藓 除 臭 抗 菌 止 痒 润 肤 祛 除 多 种 皮 肤 病 之 功 效 ( 产 品 包 装 ) 在 前 次 试 验 生 防 菌 菌 株 拮 抗 -2 无 菌 滤 液 的 抑 菌 谱 时 ( 见 试 验 报 告 ), 已 发 现 该 药 剂 对 棉 花 黄 萎 病 病 原 菌 大 丽 轮 枝 菌 (Verticillium dahliae) 和 青 枯 雷 尔 氏 菌 无 致 病 力 菌 株 Rs-59-A 具 有 较 强 的 抑 制 作 用 为 明 确 竹 玉 液 是 否 对 西 瓜 枯 萎 病 尖 孢 镰 刀 菌 (Fusarium oxysporum Schl.) 具 有 抑 制 作 用 及 抑 制 作 用 的 大 小, 本 试 验 通 过 测 定 不 同 浓 度 的 竹 玉 液 和 恶 霉 灵 溶 液 在 西 瓜 枯 萎 病 菌 PDA 平 板 上 形 成 抑 菌 圈 的 大 小, 计 算 这 2 种 药 剂 引 起 枯 萎 病 菌 死 亡 的 LD 50, 进 而 通 过 比 较 它 们 的 LD 50 来 用 恶 霉 灵 溶 液 浓 度 来 标 定 的 竹 玉 液 抑 制 西 瓜 枯 萎 病 菌 作 用 的 效 价, 现 将 结 果 报 道 如 下 2 材 料 与 方 法 2.1 材 料 竹 玉 液, 农 药 恶 霉 灵 ; 指 示 菌 为 西 瓜 枯 萎 病 尖 孢 镰 刀 菌, 培 养 基 为 PDA 2.2 不 同 浓 度 的 竹 玉 液 溶 液 和 恶 霉 灵 溶 液 的 制 备 取 少 量 的 药 剂 竹 玉 液, 用 无 菌 水 将 其 稀 释 倍, 备 用 ; 取 少 量 的 恶 霉 灵 400 倍 液, 稀 释 倍, 即 制 备 成 恶 霉 灵 的 倍 液, 备 用 从 长 势 旺 盛 的 菌 株 Rs-60-V Rs-60-A 平 板 挑 取 菌 落, 悬 浮 在 少 量 的 无 菌 水 中, 即 制 成 菌 液, 备 用 2.3 抑 菌 圈 测 定 试 验 西 瓜 枯 萎 病 尖 孢 镰 刀 菌 孢 子 悬 液 的 制 备 : 接 种 镰 刀 菌 菌 丝 在 PDA 平 板 上,26 培 养 箱 内 培 养 ;4 天 后, 平 板 上 长 出 棉 花 状 的 镰 刀 菌 菌 落, 向 平 板 内 倒 入 15ml 无 菌 水, 用 涂 布 棒 将 菌 落 刮 下, 制 成 菌 悬 液 ; 用 无 菌 纱 布 过 滤 除 去 菌 悬 液 中 的 菌 丝, 得 孢 子 悬 液 ; 吸 取 镰 刀 菌 孢 子 悬 液 0.5ml, 加 入 到 熔 化 并 冷 却 到 50 的 7ml 0.7% 的 PDA 培 养 基 内, 混 合 均 匀 后, 作 为 上 层 培 养 基, 倾 覆 在 预 先 已 凝 固 的 PDA 平 板 上 ; 待 上 层 培 养 基 凝 固 后, 在 每 块 平 板 上 放 置 4 个 牛 津 杯 ( 直 径 : 内 0.6cm 外 0.8cm, 高 1.0cm), 用 移 液 枪 分 别 向 每 个 牛 津 杯 内 加 入 不 同 浓 度 的 竹 玉 液 溶 液 或 恶 霉 灵 溶 液 ( 在 同 一 块 PDA 平 板 上 加 入 相 同 稀 释 度 的 2 个 浓 度 的 竹 玉 液 溶 液 或 恶 霉 灵 溶 液,2 个 重 复 ) 各 200ul, 然 后 将 平 板 放 置 在 27 培 养 箱 培 养 40h 后, 测 量 抑 菌 圈 的 直 径, 比 较 各 浓 度 的 竹 玉 液 溶 液 或 恶 霉 灵 溶 液 抑 菌 能 力 的 大 小, 用 恶 霉 灵 溶 液 来 标 定 竹 玉 液 对 西 瓜 枯 萎 病 菌 抑 制 作 用 的 大 小 3 结 果 与 分 析 3.1 竹 玉 液 和 恶 霉 灵 对 西 瓜 枯 萎 病 菌 的 抑 制 作 用 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 863 计 划 项 目 (2002AA ) 作 者 简 介 : 葛 慈 斌 (1973-), 男, 波 恩 大 学 博 士 研 究 生 * 通 讯 作 者 : 刘 波, 从 事 生 物 技 术 和 生 物 防 治 研 究, laeptb@pub3.fz.fj.cn

28 28 第 六 卷 2004(9) 试 验 结 果 ( 表 1 及 图 1-6) 表 明, 竹 玉 液 对 西 瓜 枯 萎 病 尖 孢 镰 刀 菌 的 抑 制 作 用 明 显, 不 同 浓 度 的 竹 玉 液 在 枯 萎 病 菌 PDA 平 板 上 形 成 的 抑 菌 圈 直 径 差 异 显 著 (P<0.01), 抑 菌 圈 直 径 与 浓 度 呈 正 相 关 ; 竹 玉 液 原 液 形 成 的 抑 菌 圈 直 径 为 27.6mm, 显 著 地 大 于 其 它 浓 度 的 抑 菌 圈 直 径,16 倍 稀 释 液 不 能 形 成 抑 菌 圈, 表 明 其 对 枯 萎 病 菌 的 抑 制 作 用 变 得 很 弱 恶 霉 灵 溶 液 对 西 瓜 枯 萎 病 菌 也 有 很 强 的 抑 制 作 用, 而 且 抑 制 作 用 的 强 弱 也 与 浓 度 成 正 相 关, 不 同 浓 度 的 恶 霉 灵 在 枯 萎 病 菌 PDA 平 板 上 形 成 的 抑 菌 圈 直 径 差 异 显 著 (P<0.01), 恶 霉 灵 400 倍 液 形 成 的 抑 菌 圈 直 径 为 26.5mm, 显 著 地 比 其 它 浓 度 的 恶 霉 灵 溶 液 形 成 的 抑 菌 圈 直 径 大 ; 恶 霉 灵 400 倍 液 稀 释 32 倍 后, 对 枯 萎 病 菌 的 抑 制 作 用 变 得 很 弱 或 是 没 有 抑 制 作 用 * 表 1 竹 玉 液 和 恶 霉 灵 对 西 瓜 枯 萎 病 菌 的 抑 制 作 用 稀 释 倍 数 抑 菌 圈 直 径 (mm) 竹 玉 液 恶 霉 灵 400 倍 液 原 液 27.6a 26.5a 2 倍 17.7b 22.3b 4 倍 14.6c 18.3c 8 倍 9.7d 15.4d 16 倍 0e 11.4e 32 倍 0e 0f * 在 同 一 栏 内, 带 相 同 字 母 的 数 字 在 Duncan s 新 复 极 差 测 验 的 多 重 比 较 P<0.01 时 没 有 差 异 3.2 竹 玉 液 抑 制 西 瓜 枯 萎 病 菌 作 用 效 价 的 恶 霉 灵 溶 液 浓 度 标 定 设 定 恶 霉 灵 400 倍 液 的 浓 度 为 1 恶 霉 灵 400 倍 液 在 枯 萎 病 菌 PDA 平 板 上 形 成 的 抑 菌 圈 直 径 净 值 ( 实 际 测 得 的 抑 菌 圈 直 径 - 牛 津 杯 的 外 径 8.0mm)18.5mm 为 造 成 枯 萎 病 菌 100% 的 死 亡 率 基 于 这 个 设 定, 可 以 计 算 出 其 它 浓 度 的 恶 霉 灵 溶 液 和 竹 玉 液 引 起 的 枯 萎 病 菌 死 亡 率, 计 算 结 果 见 表 2 * 表 2 不 同 浓 度 的 竹 玉 液 和 恶 霉 灵 引 起 的 西 瓜 枯 萎 病 菌 死 亡 率 相 对 浓 度 枯 萎 病 菌 死 亡 率 (%) 恶 霉 灵 400 倍 液 竹 玉 液 1 100a 105.9a b 52.4b c 35.7c d 9.2d e 0e f 0e * 在 同 一 栏 内, 带 相 同 字 母 的 数 字 在 Duncan s 新 复 极 差 测 验 的 多 重 比 较 P<0.01 时 没 有 差 异 根 据 表 2 的 结 果, 利 用 机 率 分 析 方 法, 计 算 恶 霉 灵 400 倍 液 和 竹 玉 液 引 起 西 瓜 枯 萎 病 菌 死 亡 的 LD 50, 结 果 见 表 3 和 表 4 从 表 3 表 4 可 以 看 出, 恶 霉 灵 400 倍 液 引 起 枯 萎 病 菌 死 亡 的 LD 50 =0.189 ( 相 对 浓 度 ), 即 恶 霉 灵 400 倍 液 的 5.29 倍 稀 释 液 ; 竹 玉 液 引 起 枯 萎 病 菌 死 亡 的 LD 50 =0.379, 即 竹 玉 液 原 液 的 2.63 倍 稀 释 液 根 据 对 LD 50 的 计 算 结 果, 可 以 计 算 出 竹 玉 液 抑 制 西 瓜 枯 萎 病 菌 作 用 效 价 的 恶 霉 灵 溶 液 浓 度 : 竹 玉 液 抑 制 西 瓜 枯 萎 病 菌 作 用 效 价 的 恶 霉 灵 溶 液 浓 度 =(5.29/2.63) 400=802 即 竹 玉 液 原 液 抑 制 西 瓜 枯 萎 病 菌 作 用 的 效 价 相 当 于 恶 霉 灵 的 802 倍 稀 释 液

29 福 建 农 业 生 物 技 术 通 讯 29 表 3 恶 霉 灵 400 倍 液 引 起 西 瓜 枯 萎 病 菌 死 亡 的 LD50 回 归 截 距 A 标 准 误 回 归 系 数 B 标 准 误 F 检 验 值 显 著 水 平 p LD50 浓 度 = % 置 信 区 : 表 4 竹 玉 液 400 倍 液 引 起 西 瓜 枯 萎 病 菌 死 亡 的 LD50 回 归 截 距 A 标 准 误 回 归 系 数 B 标 准 误 F 检 验 值 显 著 水 平 p LD50 浓 度 = % 置 信 区 : 图 1 竹 玉 液 和 恶 霉 灵 400 倍 液 的 稀 释 1 2 倍 液 形 成 的 抑 菌 圈 ( 正 面, 上 方 2 个 样 品 为 恶 霉 灵, 下 方 2 个 样 品 为 竹 玉 液 ) 图 2 竹 玉 液 和 恶 霉 灵 400 倍 液 的 稀 释 1 2 倍 液 形 成 的 抑 菌 圈 ( 反 面, 上 方 2 个 样 品 为 恶 霉 灵, 下 方 2 个 样 品 为 竹 玉 液 ) 图 3 竹 玉 液 和 恶 霉 灵 400 倍 液 的 稀 释 4 8 倍 液 形 成 的 抑 菌 圈 ( 正 面, 上 方 2 个 样 品 为 恶 霉 灵, 下 方 2 个 样 品 为 竹 玉 液 ) 图 4 竹 玉 液 和 恶 霉 灵 400 倍 液 的 稀 释 4 8 倍 液 形 成 的 抑 菌 圈 ( 反 面, 上 方 2 个 样 品 为 恶 霉 灵, 下 方 2 个 样 品 为 竹 玉 液 ) 图 5 竹 玉 液 和 恶 霉 灵 400 倍 液 的 稀 释 倍 液 形 成 的 抑 菌 圈 ( 正 面, 上 方 2 个 样 品 为 恶 霉 灵, 下 方 2 个 样 品 为 竹 玉 液 ) 图 6 竹 玉 液 和 恶 霉 灵 400 倍 液 的 稀 释 倍 液 形 成 的 抑 菌 圈 ( 反 面, 上 方 2 个 样 品 为 恶 霉 灵, 下 方 2 个 样 品 为 竹 玉 液 ) 试 验 结 果 表 明, 竹 玉 液 对 西 瓜 枯 萎 病 尖 孢 镰 刀 菌 具 有 较 强 的 抑 制 作 用, 不 同 浓 度 的 竹 玉 液 对 枯 萎 病 菌 的 抑 制 作 用 之 间 差 异 显 著 ; 恶 霉 灵 溶 液 对 西 瓜 枯 萎 病 菌 也 有 很 强 的 抑 制 作 用, 抑 制 作 用 的 强 弱 也 与 浓 度 成 正 相 关 ; 竹 玉 液 原 液 抑 制 西 瓜 枯 萎 病 菌 作 用 的 效 价 相 当 于 恶 霉 灵 的 802 倍 稀 释 液 恶 霉 灵 ( 又 名 绿 亨 一 号 ) 是 一 种 内 吸 性 杀 菌 剂 和 土 壤 消 毒 剂, 对 瓜 类 的 土 传 性 真 菌 病 害, 如 镰 刀 菌 引 [1] 起 的 瓜 类 枯 萎 病, 具 有 显 著 的 防 治 效 果 陈 丙 旭 和 黄 汉 杰 用 30% 恶 霉 灵 水 剂 防 治 黄 瓜 大 田 期 枯 萎 病, 取 [2] 得 87.4% 的 防 治 效 果 柳 唐 镜 报 道 用 恶 霉 灵 3000 倍 液 作 田 间 试 验 示 范 及 室 内 测 定, 结 果 表 明 其 对 西 瓜 枯 萎 病 具 有 良 好 的 放 置 效 果, 喷 施 法 和 灌 根 法 的 防 效 分 别 达 到 82.8% 和 89.7% 本 试 验 测 定 的 竹 玉 液 原 液 对 枯 萎 病 菌 具 有 较 强 的 抑 制 作 用, 但 由 于 竹 玉 液 经 稀 释 后, 抑 菌 能 力 迅 速 降 低, 因 此 通 过 恶 霉 灵 溶 液 浓 度 来 标 定 的 竹 玉 液 抑 制 西 瓜 枯 萎 病 菌 作 用 的 效 价 较 低, 为 恶 霉 灵 802 倍 稀 释 液 参 考 文 献 [1] 陈 丙 旭, 黄 汉 杰.30% 恶 霉 灵 水 剂 防 治 瓜 类 病 害 的 药 效 试 验 [J]. 农 药,1998,37(7):38-39 [2] 柳 唐 镜. 绿 亨 一 号 ( 恶 霉 灵 ) 防 治 西 瓜 枯 萎 病 试 验 [J]. 广 西 植 保,2001,14(1):32-33

30 30 第 六 卷 2004(9) 生 物 农 药 Bt BtA 和 阿 维 菌 素 对 小 菜 蛾 2 龄 幼 虫 的 LC50 测 定 1 引 言 * 阮 传 清, 林 幼 勇, 朱 育 菁, 刘 波 ( 福 建 省 农 科 院 生 物 技 术 中 心, 福 州 ) 小 菜 蛾 发 育 经 历 卵, 幼 虫, 蛹 和 成 虫 幼 虫 阶 段 是 小 菜 蛾 的 为 害 阶 段, 测 定 Bt BtA 和 阿 维 菌 素 对 小 菜 蛾 各 龄 幼 虫 的 致 死 中 量 浓 度 (LC50) 可 为 用 这 些 生 物 农 药 防 治 小 菜 蛾 提 供 指 导 本 文 总 结 了 25 下 Bt BtA 和 阿 维 菌 素 对 小 菜 蛾 2 龄 幼 虫 的 LC50 2 材 料 与 方 法 2.1 虫 源 准 备 采 集 室 内 种 群 的 小 菜 蛾 蛹, 羽 化, 收 集 成 虫 产 卵, 每 24 小 时 收 集 一 次 小 菜 蛾 卵, 收 集 的 同 批 的 小 菜 蛾 卵 在 人 工 气 候 箱 [25,RH70%, 光 周 期 16:8(L:D)] 内 饲 养 5 天 后 用 于 LC50 测 定 ( 此 时 小 菜 蛾 卵 已 发 育 成 2 龄 幼 虫 ) 2.2 生 物 测 定 Bt 伴 孢 晶 体 制 备 : 用 双 相 法 提 取 Bt 发 酵 液 中 伴 孢 晶 体, 将 伴 孢 晶 体 提 取 液 浓 缩 后, 经 抽 真 空 干 燥 称 重, 再 用 蒸 馏 水 稀 释 成 1mg/ml 的 伴 孢 晶 体 悬 浮 液 备 用 ; 阿 维 菌 素 (Abamectin): 称 取 阿 维 菌 素 原 粉 100mg, 溶 于 少 量 丙 酮 中, 同 时 加 入 0.1ml 农 乳 剂 OX-8396, 允 分 摇 匀 后 倒 入 100ml 容 量 瓶, 用 蒸 馏 水 定 容, 配 成 的 1mg/ml 溶 液 备 用 ;BtA: 用 以 上 配 好 的 Bt 和 阿 维 菌 素 溶 液 配 成 主 成 份 伴 孢 晶 体 与 阿 维 菌 素 质 量 比 为 32:1 的 BtA 溶 液, 浓 度 为 0.1mg/ml 用 0.01% 农 乳 剂 OX-8396 溶 液 按 照 表 1 浓 度 稀 释 以 上 配 好 的 Bt 伴 孢 晶 体 阿 维 菌 素 和 BtA 溶 液 表 1 各 杀 虫 剂 浓 度 溶 液 (mg/ml) 浓 度 1 浓 度 2 浓 度 3 浓 度 4 浓 度 5 Bt 伴 孢 晶 体 阿 维 菌 素 BtA 采 用 浸 叶 法 测 定 各 溶 液 对 小 菜 蛾 2 龄 幼 虫 的 死 亡 率 测 定 时 采 摘 温 室 里 种 的 未 用 过 杀 虫 剂 的 甘 兰 菜 菜 叶, 稍 做 裁 剪, 使 其 能 平 放 于 培 养 皿 内 ( 直 径 99mm) 将 剪 好 的 叶 片 于 所 试 杀 虫 剂 溶 液 中 浸 润 后 ( 约 10 秒 ), 用 镊 子 挟 出, 甩 去 液 滴, 晾 干, 平 铺 于 培 养 皿 ( 直 径 99mm) 内, 培 养 皿 事 先 灌 一 层 0.5cm 的 1% 琼 脂 层, 用 以 保 湿 叶 片 而 后 在 叶 片 上 引 入 15 只 供 试 小 菜 蛾 幼 虫 每 种 杀 虫 剂 的 每 个 浓 度 重 复 3 次 另 以 0.01% 浓 乳 剂 OX-8396 浓 度 作 对 照 处 理 完 后, 将 幼 虫 置 于 气 候 箱 内 饲 养 观 察 ( 气 候 箱 条 件 为 25 RH70%, 光 照 16L:8D), 每 隔 24h 观 察 一 次 死 亡 率, 总 计 观 察 3 次 即 72h 内 的 死 亡 率 虫 的 死 亡 以 用 毛 笔 轻 触 不 动 为 准 3 结 果 与 分 析 3.1 Bt 伴 孢 晶 体 对 小 菜 蛾 的 LC50 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 863 计 划 项 目 (2002AA ) 作 者 简 介 : 阮 传 清 (1974-), 男, 波 恩 大 学 博 士 研 究 生 * 通 讯 作 者 : 刘 波, 从 事 生 物 技 术 和 生 物 防 治 研 究, laeptb@pub3.fz.fj.cn

31 福 建 农 业 生 物 技 术 通 讯 31 室 内 种 群 小 菜 蛾 2 龄 幼 虫 对 在 不 同 浓 度 Bt 伴 孢 晶 体 溶 液 下 的 死 亡 率 见 表 2 所 示 所 试 小 菜 蛾 幼 虫 在 供 试 杀 虫 剂 处 理 后 24h 内 不 同 浓 度 处 理 的 死 亡 率 为 0.00%;48h 死 亡 率 的 变 化 范 围 为 3%-50%;72h 时 死 亡 率 范 围 为 30%-70% 3.2 阿 维 菌 素 对 小 菜 蛾 的 LC50 室 内 小 菜 蛾 2 龄 幼 虫 对 在 不 同 浓 度 阿 维 菌 素 溶 液 下 的 死 亡 率 见 表 3 所 示 所 试 小 菜 蛾 幼 虫 在 供 试 杀 虫 剂 处 理 后 24h 内 不 同 浓 度 处 理 的 平 均 死 亡 率 为 3%-10%;48h 死 亡 率 的 变 化 范 围 为 6%-97%;72h 时 死 亡 率 范 围 为 12%-100% 表 2 室 内 种 群 小 菜 蛾 2 龄 幼 虫 在 Bt 伴 孢 晶 体 不 同 浓 度 溶 液 下 的 校 正 死 亡 率 (%) Bt(mg/ml) 24h 平 均 48h 平 均 72h 平 均 注 : 培 养 条 件 为 25+1,70%RH, 光 周 期 16:8(L:D) 表 3 室 内 小 菜 蛾 2 龄 幼 虫 在 阿 维 菌 素 (Ab) 不 同 浓 度 溶 液 下 的 校 正 死 亡 率 (%) Ab(mg/ml) 24h 平 均 48h 平 均 72h 平 均 注 : 培 养 条 件 为 25+1,70%RH, 光 周 期 16:8(L:D) 3.3 BtA 对 小 菜 蛾 的 LC50 室 内 种 群 小 菜 蛾 2 龄 幼 虫 对 在 不 同 浓 度 BtA 溶 液 下 的 死 亡 率 见 表 2 所 示 所 试 小 菜 蛾 幼 虫 在 供 试 杀 虫 剂 处 理 后 24h 内 不 同 浓 度 处 理 的 平 均 死 亡 率 范 围 为 0%-13%;48h 死 亡 率 的 变 化 范 围 为 0%-60%;72h 时 死 亡 率 范 围 为 14%-67% 表 4 室 内 小 菜 蛾 2 龄 幼 虫 在 BtA 不 同 浓 度 溶 液 下 的 校 正 死 亡 率 (%) BtA(mg/ml) 24h 平 均 48h 平 均 72h 平 均 注 : 培 养 条 件 为 25+1,70%RH, 光 周 期 16:8(L:D) 3.4 BtA Bt 伴 孢 晶 体 和 阿 维 菌 素 的 LC50 根 据 上 表 测 定 结 果, 用 DPS 数 据 处 理 系 统 ( 唐 启 义 编 ) 计 算 BtA Bt 伴 孢 晶 体 和 阿 维 菌 素 对 莆 田 3 龄 幼 虫 的 LC50, 结 果 见 表 5 处 理 后 48h 时 bt 伴 孢 晶 体 的 LC50 为 mg/ml 阿 维 菌 素 为 mg/ml,BtA 为 mg/ml 处 理 72h 后 bt 伴 孢 晶 体 的 LC50 为 mg/ml, 阿 维 菌 素 为 mg/ml,BtA 为 mg/ml

32 32 第 六 卷 2004(9) 表 5 BtA Bt 伴 孢 晶 体 和 阿 维 菌 素 对 漳 州 小 菜 蛾 3 龄 幼 虫 的 LC50(mg/ml) 杀 虫 剂 24hLC50 置 信 空 间 48hLC50 置 信 空 间 72hLC50 置 信 空 间 (1*10-3 ) Bt 伴 孢 晶 体 阿 维 菌 素 BtA 参 考 文 献 [1] 陈 之 浩 等,1994 小 菜 蛾 对 杀 虫 双 的 抗 药 性 监 测 交 互 抗 性 测 定 及 药 剂 防 治 研 究. 西 南 农 业 学 报 7(3):68-74 [2] 程 罗 根 等, 1996 小 菜 蛾 的 抗 药 性 及 其 防 治 策 略. 世 界 农 业 1996(10):32-34 [3] 程 罗 根 等, 1999 小 菜 蛾 对 杀 螟 丹 抗 性 遗 传 的 研 究 昆 虫 学 报 42(1):12-48 [4 刘 传 秀 等, 1995 小 菜 蛾 对 溴 氰 菊 酯 抗 性 选 育 及 其 机 理. 植 物 保 护 学 报 22(4): [5] 陆 自 强 等, 1986 扬 州 地 区 小 菜 蛾 的 研 究 江 苏 农 业 科 学 (2)21-23 [6] 吕 仲 贤, 1992 害 虫 对 苏 云 金 杆 菌 的 抗 性 概 述 植 物 保 护 (6):32-33 [7] 王 纪 文, 1991 小 菜 蛾 在 海 南 发 生 与 防 治 中 国 蔬 菜 (4):27-30 [8] 王 旭 等, 1997 小 菜 蛾 抗 药 性 的 研 究. 世 界 农 业 1997(11):27-29 [9] 薛 明 等, 1994 小 菜 蛾 生 物 学 特 性 及 药 剂 防 治 研 究. 莱 阳 农 学 院 学 报 1994(11): [10] 赵 善 欢, 1995 小 菜 蛾 的 抗 药 性 及 防 治 策 略. 西 北 农 业 大 学 学 报 23(3):21-24 [11] Bruce E.Tabashnik,1992 采 用 多 种 农 药 治 理 抗 性 的 理 论 事 实 和 建 议 农 药 译 丛 14(5):45-50

33 福 建 农 业 生 物 技 术 通 讯 33 通 过 HPLC 检 测 进 行 产 毒 藻 筛 选 * 史 怀, 宋 玮, 刘 波 ( 福 建 省 农 科 院 生 物 技 术 中 心, 福 建 福 州 ) 1 引 言 藻 类 是 一 群 具 有 色 素 营 自 氧 生 活 生 长 于 淡 水 和 咸 水 水 体 中 的 一 类 低 等 生 物 其 种 类 繁 多, 且 大 多 能 产 生 毒 素, 目 前, 已 发 现 的 藻 类 中 约 80% 以 上 均 能 产 生 毒 素 其 中 蓝 绿 藻 是 淡 水 藻 类 中 毒 性 最 强 污 染 范 围 最 广 最 具 有 代 表 性 的 一 类, 其 产 生 的 毒 素 有 四 十 多 种, 这 些 都 给 人 们 净 化 水 质 带 来 困 难 主 要 的 藻 类 毒 素 有 : 多 肽 肝 毒 素 生 物 碱 类 神 经 毒 素 细 胞 毒 素 其 中 以 多 肽 肝 毒 素 危 害 最 广, 该 毒 素 水 溶 性 强 且 能 耐 高 温 能 够 作 用 于 肝 细 胞 表 面 的 特 异 性 受 体, 大 剂 量 作 用 将 直 接 导 致 肝 损 伤, 小 剂 量 的 慢 性 刺 激 将 诱 发 肝 癌, 并 且 和 其 它 一 些 肝 肿 瘤 促 进 剂 有 协 同 作 用 近 年 来 外 国 一 些 实 验 室 采 用 高 压 液 相 色 谱 (HPLC) 及 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 (ELISA) 进 行 毒 素 含 量 的 直 接 检 测, 其 灵 敏 度 可 达 ng 水 平, 为 检 测 环 境 中 藻 类 污 染 水 平 提 供 了 新 的 技 术 方 法 [1] 本 实 验 培 养 了 几 种 不 同 的 蓝 藻, 经 过 富 集 后 HPLC 检 测 其 藻 毒 素 的 含 量, 筛 选 出 高 毒 力 的 藻 株 以 进 行 后 续 实 验 2 材 料 与 方 法 2.1 试 验 材 料 藻 毒 素 标 准 品 ( 纯 度 >96%), 由 福 大 购 买 乙 腈 ( 色 谱 纯 ) 三 氟 乙 酸 Agilent1100 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 带 VWD 检 测 器 及 色 谱 工 作 站 ) 不 同 藻 株 ( 编 号 1-8) 藻 毒 素 提 取 液 2.2 试 验 方 法 藻 种 的 培 养 及 HPLC 前 处 理 培 养 基 SE 培 养 基 :NaNO 3 25mg;CaCl 2 2.5mg;MgSO 4.7H 2 O 7.5mg;K 2 HPO 4 7.5mg;KH 2 PO mg;NaCl 2.5mg; 土 壤 浸 出 液 4 ml;fe-edta 0.4Ml;FeCl 3.6H 2 O 0.5mg;A 5 0.1mL;H 2 O 95.8mL A 5 微 量 元 素 培 养 液 :H 3 BO 3 286mg;MnCl 2.4H 2 O 181mg;MnSO 4.7H 2 O 250mg;ZnSO 4.7H 2 O 22mg;CuSO 4.5H 2 O 7.4mg;NaMoO 4 2.1mg;H 2 O 100mL Fe-EDTA 培 养 液 :Na 2 -EDTA 1g;FeCl 3.6H 2 O 81mg;HCl(0.1mol/L) 50mL HPLC 前 处 理 藻 类 样 品 的 冷 冻 干 燥 : 将 培 养 数 日 后 的 藻 类 培 养 液 在 4Y10,10000rpm 冷 冻 离 心 30min 后, 收 集 上 清 液, 继 续 培 养 离 心 后 沉 淀 冷 冻 干 燥 至 成 干 藻 粉, 置 于 干 燥 器 中, 保 存 在 4 条 件 下 从 干 藻 粉 中 释 放 藻 毒 素 : 称 取 适 量 冷 冻 干 燥 后 的 干 藻 粉 溶 于 10mL 蒸 馏 水 中, 用 超 声 波 震 荡 此 悬 浮 液 30min 然 后 在 rpm 离 心 10min, 取 其 上 清 液, 将 离 心 沉 淀 的 细 胞 物 质 超 声 波 震 荡 30min, 在 rpm 离 心 10min 如 离