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淋宋
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1 LC-MS/MS 法测定人血浆中布洛芬对映体浓度及其药动学研究黄明, 张全英 * *, 宗顺麟 ( 苏州大学附属第二医院临床药理实验室, 江苏苏州 ) 摘要 : 采用 LC-MS/MS 法测定人血浆中 S-(+)- 布洛芬 (S-IBP) 和 R-(-)- 布洛芬 (R-IBP) 的浓度, 并应用于健康受试者体内药物动力学研究以萘普生为内标, 采用 Daicel 公司 Chiralpak AD-3R (4.6 mm 150 mm,3.0 μm) 色谱柱, 流动相为乙腈 -0.01% 甲酸水溶液 (40:60), 流速为 750 μl min -1, 每个样品的分析时间为 23.0 min, 样品经电喷雾离子源负离子化后, 通过三重四极杆串联质谱仪, 在多反应监测模式下测定 S-IBP 和 R-IBP (m/z ) 和内标萘普生 (m/z ) 的浓度血浆样品前处理采用甲醇沉淀蛋白 S-IBP 和 R-IBP 的血浆浓度在 0.05 ~ μg ml -1 内线性良好, 定量下限为 0.05 μg ml -1 S-IBP 批内批间精密度 (RSD) 均在 2.2% ~ 4.2% 以内, 相对偏差 (RE) 在 -12.0% ~ 13.0% 以内 R-IBP 批内批间精密度 (RSD) 均在 2.0% ~ 8.2% 以内, 相对偏差 (RE) 在 -11.5% ~ 10.6% 以内 S-IBP 和 R-IBP 血浆样品室温 (25 ) 放置 6 h, 反复冻融 (-30 )3 次及冰冻 (-30 ) 保存 47 天的情况下均稳定该分析方法简便特异性高灵敏度高, 可用于受试者空腹口服布洛芬缓释胶囊 300 mg 后血浆样品中布洛芬对映体 S-IBP 和 R-IBP 的药动学研究关键词 : 布洛芬 ; 手性对映体 ; 高效液相 - 串联质谱 ; 药动学中图分类号 :R917 收稿日期 : ; 修回日期 : * 通讯作者 Tel: , [email protected] 1 / 12

2 Determination of ibuprofen enantiomers in human plasma by LC-MS/MS and its application to pharmacokinetics study HUANG Ming, ZHANG Quan-ying*, ZONG Shun-lin (Clinical Pharmacology Laboratory, The Second Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou , China) Abstract: The study aims to establish an LC-MS/MS method for the determination of S-(+)-ibuprofen (S-IBP) and R-(-)-ibuprofen (R-IBP), which was used subsequently to investigate the pharmacokinetics of ibuprofen enantiomers in healthy Chinese volunteers. Naproxen was used as internal standard. The separation was achieved on a Chiralpak AD-3R column (4.6 mm 150 mm,3.0 μm) with a mobile phase consisting of acetonitrile/0.01% formic acid aqueous solution (40:60) at a flow rate of 750 μl min -1 within 23.0 min. Naproxen and the internal standard were measured by a triple - quadrupole mass spectrometer in negative electron electronic spray ion (ESI) mode using multiple reaction monitoring (MRM). The extracted ions monitored following MRM transitions were m/z for ibuprofen enantiomers and m/z for the internal standard naproxen. Plasma samples were pretreated by methanol precipitation. The calibration curve of S-IBP and R-IBP in human plasma was linear over the concentration rang of (0.05 ~ 30.00) μg ml -1. The lower limit of quantitation was 0.05 μg ml -1. The intra- and inter R-run precisions of S-IBP at three quality control levels were within 2.2% ~ 4.2%, the relative deviation of the assay was within -12.0% ~ 13.0%. The intra- and inter R-run precisions of R-IBP at three quality 2 / 12

3 control levels were within 2.0% ~ 8.2%, the relative deviation of the assay was within -11.5% ~ 10.6%. The plasma samples were stable at room temperature (25 C) for 6 h, at -30 C for 47 days and during three freeze-thaw cycles. The method was proved to be convenient, accurate and sensitive. The method was proved to be suitable for the pharmacokinetics of ibuprofen enantiomers in healthy Chinese volunteers after a single oral dose of 300 mg ibuprofen extended-release capsule. Key words: ibuprofen; chiral enantiomer; LC-MS/MS; pharmacokinetics 布洛芬 (ibuprofen, IBP) 为非甾体抗炎药, 主要通过抑制前列腺素或其他炎症介质合成而发挥抗炎解热镇痛作用目前, 布洛芬主要以消旋体给药, 其左右旋体在体内的药理活性存在显著的差异, 其中右旋布洛芬 (S-IBP) 在抑制前列腺素生成上优于左旋布洛芬 (R-IBP) 布洛芬以消旋体给药后, 部分左旋布洛芬可通过形成辅酶 A 硫脂单向地转化为右旋布洛芬 [1, 2], 所以有必要研究布洛芬对映体各自的药动学参数 [3-6] 目前, 国内外血浆中布洛芬对映体浓度的测定方法主要包括 LC-UV 法和 LC-MS/MS [7-10] 血浆样品前处理方法有 :1 液液萃取法 [3-4, 7-10] : 样品经提取吹干复溶等步骤后测定, 操作繁琐 2 固相萃取法 [5, 9] :SPE 柱成本相对较高 3 蛋白沉淀法 [6] : 此方法应用犬血浆样品测定本研究首次采用甲醇沉淀蛋白前处理方法, 使用液质联用仪测定人血浆中布洛芬对映体浓度,S-IBP 和 R-IBP 定量下限均为 0.05 μg ml -1, 并将此方法应用于布洛芬缓释胶囊中国健康受试者人体药动学研究 3 / 12

4 材料与方法仪器液质联用仪 :API4000 三重串联四极杆质谱仪,AB Sciex 公司 ; Agilent1200 液相色谱仪,Agilent 公司 ; 数据处理系统为 Analyst 1.4.2,AB Sciex 公司分析天平 :XS 105DU 型 (Max 2 =41 g,d 2 =0.01 mg),mettler Toledo 公司对照品和试剂 S-IBP 对照品 ( 批号 , 中国食品药品检定研究院, 含量为 99.9%) R-IBP 对照品 ( 批号 A2,TLC Pharmachem, 含量为 99.6%) 萘普生对照品( 批号 , 中国食品药品检定研究院, 含量为 99.6%); 乙腈和甲醇 (HPLC 级,Merck KGaA); 甲酸 (AR 级, 上海凌峰化学试剂有限公司 ); 水 ( 灭菌注射用水, 石家庄四药有限公司 ) 空白血浆来自健康志愿者试验药物布洛芬缓释胶囊 ( 中美天津史克制药有限公司生产商品名芬必得, 产品批号 , 含量 99.3%, 规格 300 mg/ 粒 ) 色谱条件色谱柱为 Daicel 公司 Chiralpak AD-3R (4.6 mm 150 mm,3.0 μm), 保护柱为 Chiralpak AD-3R (4.0 mm 10 mm,3.0 μm); 流动相为乙腈 -0.01% 甲酸水溶液 (40:60); 流速 750 μl min -1 ; 分析时间 23.0 min,0~8.0 min A 通道 ( 排废 ),8.0~23.0 min B 通道 ( 质谱系统 ); 进样量 20 μl; 柱温 25 质谱条件电喷雾离子源 (ESI), 负离子电离模式 ; 雾化气 50 psi(1psi 6.9 kpa); 加热辅助气 50 psi, 离子源温度 550 ; 采用多反应监测 (MRM);S-IBP 和 R-IBP 监测离子对均为 m/z , 去簇电压 (DP) 为 60 V, 射入电压 (EP) 为 10 V, 碰撞能量 (CE) 为 11 V, 碰撞室的射出电压 (CXP) 为 6 V; 内标萘普生监测离子对为 m/z , 去簇电压 (DP) 为 40 V, 射入电压 (EP) 为 10 V, 碰撞能量 (CE) 为 9 V, 碰撞室的射出电压 (CXP) 为 6 V 4 / 12

5 储备液和工作液配制 S-IBP 和 R-IBP 标准曲线储备液和工作液 : 称量 S-IBP 和 R-IBP 各 mg 于 10 ml 量瓶用甲醇定容, 混匀得 mg ml -1 S-IBP 和 R-IBP 标准曲线储备液, 用甲醇稀释至浓度为和 μg ml -1 的标准曲线系列工作液将 mg ml -1 S-IBP 和 R-IBP 储备液, 用甲醇稀释至浓度为和 μg ml -1 的质控系列工作液内标萘普生储备液及工作液 : 称取萘普生对照品 mg 于 10 ml 量瓶用甲醇定容, 混匀得 mg ml -1 内标储备液, 并用甲醇稀释 μg ml -1 内标萘普生工作液标准曲线和质控血浆样品制备和处理取空白血浆 200 μl 置 1.5 ml 离心管中, 加入 S-IBP 和 R-IBP 标准曲线或质控工作液 10 μl 和内标萘普生工作液 50 μl, 混匀后加入甲醇 600 μl 沉淀血浆蛋白, 涡旋 1 min, 于 g 4 离心 10 min 离心后取上清液 400 μl 置进样瓶中, 加入水相 400 μl, 涡旋混匀后, 置于自动进样器中进样测定 S-IBP 和 R-IBP 浓度方法学验证特异性实验分别取 S-IBP 和 R-IBP 对照溶液萘普生对照溶液空白血浆按标准曲线和质控血浆样品制备和处理项方法处理样品 ; 空白血浆 200 μl 和 S-IBP 和 R-IBP 对照品溶液 ( 均 μg ml -1 )10 μl 混匀后按标准曲线和质控血浆样品制备和处理项方法操作样品 ; 受试者口服布洛芬缓释胶囊 300 mg 后 2.0 h 的血浆按受试者血浆样品处理项方法操作样品, 进样检测标准曲线和定量下限取空白血浆 200 μl, 分别加入 S-IBP 和 R-IBP 标准曲线系列工作液 10 μl, 制备血浆中 S-IBP 和 R-IBP 浓度均为和 μg ml -1 的标准曲线系列血浆样品, 按标 5 / 12

6 准曲线和质控血浆样品制备和处理项方法处理, 进样检测, 以 S-IBP 或 R-IBP 浓度为横坐标,S-IBP 或 R-IBP 峰面积与内标萘普生峰面积的比值为纵坐标, 权重系数为 1/C 2, 进行线性回归精密度与准确度取空白血浆 200 μl, 分别加入 S-IBP 和 R-IBP 质控系列工作液 10 μl ( 和 μg ml -1 ), 制备血浆中 S-IBP 和 R-IBP 浓度分别均为和 μg ml -1 的质控系列血浆样品, 每个浓度 6 样品, 按标准曲线和质控血浆样品制备和处理项方法处理, 测定 3 批, 根据每批随行标准曲线, 计算样品的实测浓度, 用 Excel 软件中单因素方差分析计算 S-IBP 和 R-IBP 批间和批内精密度, 同时计算相对偏差提取回收率按精密度与准确度实验方法制备含 S-IBP 和 R-IBP 分别为和 μg ml -1 的血浆样品, 每个浓度 6 个样品, 按标准曲线和质控血浆样品制备和处理项方法处理, 以其进样测定得到的峰面积除以空白血浆经蛋白沉淀后直接加入低中高 S-IBP 和 R-IBP 质控系列工作液及内标萘普生工作液后检测得到的峰面积, 计算血浆中 S-IBP R-IBP 和内标萘普生的提取回收率基质效应取 6 个不同来源的空白血浆 200 μl 至 1.5 ml 离心管中, 分别加入甲醇 600 μl, 涡旋 1 min,4 离心 ( g)10 min, 取上清液 700 μl 作血浆基质 ; 另取纯化水 200 μl 至 1.5 ml 离心管中, 同法处理得到对照基质分别取对照基质和血浆基质 700 μl, 加入 S-IBP 和 R-IBP 质控系列工作液 10 μl 和内标萘普生工作液 50 μl 混匀, 吸取该溶液 200 μl 至进样瓶中, 加入水相 800 μl, 混匀上述样品每个浓度 6 份并按色谱条件和质谱条件项检测, 获得 S-IBP R-IBP 和内标萘普生峰面积, 以每一浓度样品两种基质的峰面积比值 6 / 12

7 计算基质效应受试者血浆样品处理取受试者血浆样品 200 μl 置 1.5 ml 离心管中, 加入甲醇 10 μl 和内标萘普生工作液 50 μl, 混匀后加入甲醇 600 μl 沉淀血浆蛋白, 涡旋 1 min, 于 g 4 离心 10 min 离心后取上清液 400 μl 置进样瓶中, 加入水相 400 μl, 涡旋混匀后, 置于自动进样器中进样测定 S-IBP 和 R-IBP 浓度人体药动学研究方案临床试验方案经苏州大学附属第二医院伦理委员会批准 12 名男性健康受试者均签署知情同意书, 年龄在 (23±3) 岁, 试验开始两周前至试验期间未服用其他任何药物, 体重指数均在 19~24 内, 心电图正常, 肝肾功能正常, 均符合受试者入选标准 12 名受试者空腹口服布洛芬缓释胶囊 ( 芬必得,300 mg/ 粒 )1 粒,250 ml 温开水送服, 于服药前和服药后和 24 h 由肘静脉取血 4 ml 所有血液样品置肝素化采血管中, 离心 ( g,4,5 min), 分离上层血浆, 于 -30 冰箱中保存, 待测结果 1 方法学验证 1.1 特异性结果显示,S-IBP 和 R-IBP 的保留时间分别为和 min, 内标萘普生的保留时间为 min, 内源性物质不干扰 S-IBP 和 R-IBP 和内标萘普生的测定, 见图 1 XIC of -MRM (2 pairs): / e Max. 6.1e4 cps. 0.0 XIC of -MRM (2 pairs): / Max cps XIC of -MRM (2 pairs): / e / 12 Max. 8.1e4 cps. 0.0 XIC of -MRM (2 pairs): / Max cps XIC of -MRM (2 pairs): / Max cps XIC of -MRM (2 pairs): / Max. 1.5e5 cps. 1.0e5 0.0 A B C 11.80

8 XIC of -MRM (2 pairs): / Max cps. 0 XIC of -MRM (2 pairs): / Max cps XIC of -MRM (2 pairs): / Max cps XIC of -MRM (2 pairs): / Max. 1.2e5 cps. 1.00e XIC of -MRM (2 pairs): / e Max. 7.7e4 cps. 0.0 XIC of -MRM (2 pairs): / Max. 9.2e4 cps. D E F 9.2e XIC of -MRM (2 pairs): / e Max. 9.1e4 cps. 0.0 XIC of -MRM (2 pairs): / Max. 1.2e5 cps. 1.00e G Figure 1 LC-MS/MS Chromatograms of S-IBP (S-(+)-ibuprofen) and R-IBP (R-(-)-ibuprofen). A: Standard solution of S-IBP (1.500 μg ml -1 ); B: Standard solution of R-IBP (1.500 μg ml -1 ); C: Standard solution of naproxen (1.250 μg ml -1 ); D: Blank plasma; E: Spiked plasma sample obtained by the addition of 10 μl standard solution of S-IBP and R-IBP (1.000 μg ml -1 ) to 200 μl blank plasma; F: Spiked plasma sample obtained by the addition of 10 μl standard solution of S-IBP and R-IBP (30.00 μg ml -1 ) to 200 μl blank plasma; G: Plasma obtained from a volunteer at 2.0 h after orally administration ibuprofen extended-release capsule 1.2 标准曲线和定量下限 S-IBP 回归方程为 ƒ=0.526 C (r= ) R-IBP 回归方程为 ƒ=0.501 C (r= ) 结果表明,S-IBP 和 R-IBP 在 0.05 ~ μg ml -1 内线性关系均较好, 定量下限 LLOQ 均为 0.05 ng ml 精密度与准确度结果显示,S-IBP 和 R-IBP 低中高三浓度质控样品批间和批内 RSD 均小于 15%,RE 均在 ±15% 范围内 1.4 提取回收率结果显示, 血浆中 S-IBP 低中高三个浓度的提取回收率分别为 96.7%±4.6%(n=6) 104.1%±1.9%(n=6) 和 103.3%±4.7%(n=6); 血浆中 R-IBP 低中高三个浓度的提取回收率分别为 100.3%±4.4%(n=6) 97.5%±2.6% ( n=6 ) 和 99.7%±2.0% ( n=6 ); 内标萘普生的提取回收率为 101.3%±2.8%(n=18) 1.5 基质效应结果显示, 血浆中 S-IBP 低中高三个浓度的基质效应分别 8 / 12

9 为 100.8%±2.2%(n=6) 100.6%±1.9%(n=6) 和 96.3%±3.5%(n=6); 血浆中 S-IBP 低中高三个浓度的基质效应分别为 101.5%±4.1%(n=6) 97.4%±3.6%(n=6) 和 96.7%±2.7%(n=6); 内标萘普生的基质效应为 98.4%±3.4%(n=18) 1.6 稳定性结果显示,S-IBP 和 R-IBP 血浆样品室温放置 (25 )6 h -30 冰冻 47 天和反复冻融 3 次情况下均稳定 ; 待测样品自动进样器放置 (4 )48 h, 血浆蛋白沉淀离心后上清液样品室温放置 (25 )6 h S-IBP 和 R-IBP 储备液在室温放置 24 h 和在冷藏 (2~8 )26 天情况下稳定 ; 内标萘普生储备液在室温放置 24 h 和在冷藏 (2~8 )26 天情况下稳定 2 人体药动学应用 12 名受试者空腹口服布洛芬后 S-IBP 和 R-IBP 的平均血药浓度 - 时间曲线见图 2, 主要药动学参数见表 1 Figure 2 Mean plasma concentration - time curves of ibuprofen enantiomers after a single oral dose of 300 mg ibuprofen extended-release capsule in 12 healthy male volunteers ( x ± s, n = 12) 9 / 12

10 Table 1 Main pharmacokinetic parameters of ibuprofen(ibp) enantiomers after a single oral dose of 300 mg IBP extended-release capsule ( x ± s, n = 12). NA: Not applicable Dose / mg ( Literature [3] ) Racemic IBP S-IBP R-IBP Racemic IBP S-IBP R-IBP AUC 0-24h / μg h ml ± ± ± ± ± ± 5.85 AUC 0- / μg h ml ± ± ± NA NA NA C max / μg ml ± ± ± ± ± ± 1.04 t max / h 5.33 ± ± ± ± ± ± 0.32 t 1/2 / h 2.90 ± ± ± ± ± ± 0.84 CL/F / L h ± ± ± ± ± ±0.82 讨论本研究建立的 LC-MS/MS 测定人血浆中布洛芬对映体浓度, 定量下限为 0.05 μg ml -1 [3,5-10] [4], 低于文献报道,Shi 等采用液液萃取法, 操作繁琐本方法可满足布洛芬缓释胶囊的药动学研究大量样品测定 [4] 手性拆分是药物分析的热点, 也是定量测定手性药物的前提 Xiang 等采用大赛璐多糖衍生物正相手性柱,Chiralcel OJ-H, 流动性为正己烷 - 异丙醇 - 三氟醋酸, 不适合 LC-MS/MS 本文采用大赛璐多糖衍生物反相手性柱 Chiralpak AD-3R, 硅胶表面涂敷有直链淀粉 - 三 (3,5- 二甲苯基氨基甲酸酯 ), 与正相柱 Chiralpak AD-H 比较, 反相柱涂敷的手性聚合物与正相柱相同, 但是所用的硅胶不同反相柱使用水 / 有机溶剂流动相, 适合分析水溶性样品 ( 比如生物活性样品 ), 可应用于 LC-MS/MS 中本研究对色谱和质谱条件进行了优化考察, 初期尝试使用 Daicel 公司官网推荐的色谱条件 : 乙腈 -ph 2.0 甲酸水溶液 (50/50), 结果显示 :S-IBP 和 R-IBP 仪器响应低, 考虑负离子监测模式下, 流动性 ph 低, 不利于负离子的形成, 故减小甲酸水溶液中甲酸的比例最终选择乙腈 0.01% 甲酸水溶液 (40:60) 为流动相, 10 / 12

11 S-IBP 和 R-IBP 的响应较高且保留时间适中血浆样品沉淀蛋白, 离心后, 取上清液 400 μl, 并加入水相 400 μl, 是为了将进样样品中水的比例提高至近似流动相的比例, 防止发生二次化学平衡现象, 改善峰形 12 例受试者口服布洛芬缓释胶囊胶囊 300 mg 后, 血浆中 S-IBP 和 R-IBP 主 [3] 要药动学参数 AUC C max t max t 1/2 和 CL/F 与文献基本一致布洛芬消旋体 S-IBP 和 R-IBP 之间除 AUC C max 和 CL/F 外, 其他主要药动学参数均无统计学差异 S-IBP 的 AUC 0-24h 均数是布洛芬消旋体的 61.0%, 是 R-IBP 的 156.2%;S-IBP 的 C max 均数是布洛芬消旋体的 56.4%, 是 R-IBP 的 C max 的 117.0% R-IBP 的清除较 S-IBP 快 References [1] Bookstaver PB, Miller AD, Rudisill CN, et al. Intavenous ibuprofen: the first injectable product for the treatment of pain and fever [J]. J Pain Res, 2010, 25: [2] Cattaneo D, Clementi E. Clinica1 pharmacokinetics of ibuprofen arginine [J]. Curr Clin Pharmacol, 2010, 5: [3] Xiang J, Yu Q, Liang MZ, et al. Pharmacokinetics of ibuprofen enantiomers in healthy volunteers [J]. J Sichuan Univ(Med Sci Edi) ( 四川大学学报医学版 ), 2010, 41: [4] Shi XB, Shan L, Guo B, et al. Determination of ibuprofen enantiomers in plasma by HPLC-chiral stationary phase [J]. Chin J Mod Appl Pharm ( 中国现 11 / 12

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14-0390-0696.doc

14-0390-0696.doc 390 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (3): 390 394 HPLC-MS/MS 法定量研究比格犬灌胃替诺福韦酯后替诺福韦血浆药代动力学 * 王宝莲, 扈金萍, 盛莉, 陈晖, 李燕 ( 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所, 北京 100050)