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1 摇南京农业大学学报摇 2009, 32 (4): Journal of Nanjing Agricultural University http: / / nauxb 郾 njau 郾 edu 郾 cn 伍应保, 於丙军. 栽培大豆和野生大豆亲本及其杂交后代幼苗 Cl - 通道基因表达及其与耐氯性的关系 [ J]. 南京农业大学学报, 2009, 32(4): 栽培大豆和野生大豆亲本及其杂交后代幼苗 Cl - 通道基因表达及其与耐氯性的关系伍应保 1 1,2*, 於丙军 (1. 南京农业大学生命科学学院, 2. 南京农业大学大豆研究所 / 国家大豆改良中心, 江苏南京 ) 摘要 : 根据 EST 数据库拼接了 1 条大豆 Cl - 通道基因的 EST 序列, 并通过 RT 鄄 PCR 技术从大豆 cdna 中获得该 EST Southern blot 半定量 Northern blot RT 鄄 PCR 和分光光度法等检测结果表明 : 该 EST 所在 Cl - 通道基因在供试栽培大豆和野生大豆杂交组合 (Jackson 伊 BB52) 亲本及其耐盐杂交后代 JB185 (F 5 ) 株系等材料中的拷贝数无差异, 但在盐胁迫下, 栽培大豆 Jackson 幼苗根和叶中该基因的转录水平表现减弱趋势, 而野生大豆 BB52 和杂交后代 JB185 ( F 5 ) 表现增强趋势或相对较高水平, 在 JB185 (F 5 ) 中更为明显盐胁迫下 Jackson 幼苗体内积累的 Cl - 相对较多, 且向叶片运输比例较大, 而 BB52 和 JB185 (F 5 ) 体内积累的 Cl - 相对较少, 且主要积累在根部, 向叶片运输比例较小关键词 : 栽培大豆 ; 野生大豆 ; 杂交后代 ; EST; Cl - 通道基因中图分类号 : Q945 郾 78; S565 郾 1 摇摇摇文献标志码 : A 摇摇摇文章编号 : (2009) Gene expression of Cl - channel and its relation to chloride tolerance of Glycine max, Glycine soja and their hybrid seedlings WU Ying 鄄 bao 1, YU Bing 鄄 jun 1,2* (1. College of Life Sciences, 2. Soybean Research Institute / National Center for Soybean Improvement, Nanjing Agricultural University, Nanjing , China) Abstract: One EST ( expressed sequence tag) of chloride channel genes ( CLCs) in soybean was assembled according to the EST database, and was confirmed in soybean cdna by RT 鄄 PCR technique. No difference in gene copy number of the EST among the Glycine max (Jackson), Glycine soja (BB52) and their hybrid F 5 (strain JB185) was showed by Southern blot, and its weake 鄄 ning transcriptional level by semi 鄄 quantitative Northern blot and RT 鄄 PCR exhibited in roots and leaves of Jackson seedlings under salt stress, while an enhanced or relatively higher trend was found in salt 鄄 stressed BB52 and JB185 seedlings, especially in JB185. Measured by photometric method, the higher Cl - content in plants and its larger proportion in leaves of Jackson seedlings, and low 鄄 er Cl - content in plants and its larger proportion in roots in BB52 and JB185 seedlings were observed. Key words: Glycine max; Glycine soja; hybrid; expressed sequence tag ( EST); chloride channel genes ( CLCs) 大豆是我国主要农作物之一, 栽培大豆 ( Glycine max) 属于中度耐盐植物 [1] 就盐胁迫下的离子毒害而言, Cl - 对其幼苗造成的伤害较 Na + 严重 [2] 野生大豆 (Glycine soja) 作为栽培大豆的近缘种, 耐盐性较栽培大豆强, 其盐害主要由 Na + 引起 [2-3] 栽培大豆由于其遗传基础已越来越窄, 耐盐性相对有限, 局限在栽培大豆品种范围内的育种工作难以取得大的突破, 而野生大豆的产量和经济价值都较低利用滩涂野生大豆的耐氯 ( 盐 ) 性来改良栽培大豆的氯 ( 盐 ) 敏感性, 被认为是进行大豆耐盐种质创新的有效途径之一盐逆境下植物体内 Cl - 的吸收和转运涉及位于生物膜上的 Cl - 通道 (chloride channels, CLCs) Cl - / 2H + symporter 及 Cl - / H + antiporter 等共同参与, 其中 Cl - 通道在植物细胞质膜液泡膜内质网膜线粒体膜叶片的叶绿体被膜和内囊体膜上都存在 [4-5] 迄今已在拟南芥水稻马铃薯玉米菠菜烟收稿日期 : 基金项目 : 江苏省自然科学基金青年科技创新人才 ( 学术带头人 ) 项目 (BK ); 国家自然科学基金项目 ( ); 国家转基因生物新品种培育重大专项 (2009ZX B) 作者简介 : 伍应保, 硕士研究生 * 通讯作者 : 於丙军, 教授, 博导, 主要从事植物逆境生理生态与分子遗传改良研究, Tel: , E 鄄 mail: bjyu@ njau 郾 edu 郾 cn

2 68 摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇南摇京摇农摇业摇大摇学摇学摇报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第 32 卷草栽培大豆中克隆到 Cl - 通道基因 (CLCs) 家族成员, 这说明 CLCs 广泛存在于植物界 [6-7] 但目前在大豆上所进行的 CLCs 的研究也仅涉及栽培大豆, 对野生大豆 ( 尤其是滩涂野生大豆, 如本文所用 BB52 种群 ) 及其与栽培大豆的杂交后代尚未见报道本文以逐代耐盐性筛选的栽培和野生大豆杂交组合 (Jackson 伊 BB52) 后代 JB185 (F 5 ) 株系及其亲本幼苗为材料, 利用 EST 数据库和 Southern blot 半定量 RT 鄄 PCR 和 Northern blot 等技术分析了 CLCs 在上述材料中的拷贝数盐胁迫下转录水平及不同品种间幼苗内 Cl - 含量的差异, 以期为研究栽培大豆和野生大豆亲本及其杂交后代的不同耐氯 ( 盐 ) 性及耐盐栽培大豆的选育提供理论依据 1 摇材料与方法 1 郾 1 摇材料培养和处理摇摇供试材料为滩涂野生大豆种群 BB52 ( 山东垦利, 耐盐性较强 ) 和栽培大豆种群 Jackson ( 美国, 耐 [8] 盐性较弱 ) 及它们的经逐代耐盐性筛选的杂交后代 JB185 (F 5 ) 株系材料培养过程参照屈娅娜等方法至第 2 对真叶刚展开时, 对于分子实验用的材料, 用 1 / 2 Hoagland 营养液配制的 150 mmol L -1 NaCl 溶液进行 h 处理, 分别取样立即置于液氮中速冻, 再置于 -80 益冰箱保存备用 ; 对于生理实验用的材料, 用 1 / 2 Hoagland 营养液配制的 mmol L -1 NaCl 溶液进行处理, 营养液或处理液每 2 d 更换 1 次, 在处理 6 d 后取材进行 Cl - 含量的测定, 重复 3 次 1 郾 2 摇试验方法 1 郾 2 郾 1 摇目的 Cl - 通道基因 EST 的 cdna 克隆和序列比对摇试验中使用的 Taq DNA 聚合酶 M 鄄 MLV 逆转录酶 pmd18 鄄 T 载体 Trizol 试剂盒大肠杆菌 DH5 琢和凝胶回收试剂盒购自大连宝生物工程有限公司 [9] (TaKaRa), 总 RNA 的提取按照 Trizol 试剂盒提供的方法进行根据 NCBI 上 EST 数据库参照黄骥等方法拼接了 1 条 Cl - 通道基因的 EST 序列, 并根据此序列设计 PCR 引物 : E1: 5 忆鄄 GGTGTCAGGCGT 鄄 GAGAGAGATAAGC 鄄 3 忆, E2: 5 忆鄄 AATGAGCCTCATCTCTGCGATGTTGC 鄄 3 忆 2 滋 g 的总 RNA 用于 cdna 第 1 链的合成, 并用 RNase 消化 cdna 产物 PCR 扩增条件为 : 94 益 4 min; 94 益 30 s, 56 益 30 s, 72 益 1 min, 35 个循环 ; 最后 72 益 10 min PCR 扩增产物经 1% 琼脂糖凝胶检测, 回收目的条带, 与 pmd18 鄄 T 载体连接, 16 益过夜, 通过电激转化方法将克隆载体转入大肠杆菌 DH5 琢感受态细胞中, 并在含氨苄青霉素和 X 鄄 gal 的平板上筛选白色菌落, 然后提取质粒, 鉴定, 从中挑选单克隆送金思特生物科技 ( 南京 ) 有限公司测序采用 Megalign 和 Clustalx 1 郾 8 软件进行序列比对分析 1 郾 2 郾 2 摇 Cl - 通道基因 Southern blot 探针的克隆序列比对及其在供试材料中的基因拷贝数分析摇试验中使用的内切酶 ( EcoR 玉 Nde 玉 Dra 玉 ) 购自大连宝生物工程有限公司 ( TaKaRa), DIG High Prime DNA Labeling and Detection starter Kit 域试剂盒购自 Roche 公司 ( 德国 ), 基因组 DNA 用 CTAB 法提取以基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增获得 Southern blot 探针, 所用引物 PCR 反应条件 PCR 目的条带获得及检测验证同上述 EST 的克隆用内切酶 (EcoR 玉 Nde 玉 Dra 玉 ) 酶切各基因组 DNA ( 大于或等于 10 滋 g), 按照 DIG High Prime DNA Labeling and Detection starter Kit 域试剂盒方法进行 South 鄄 ern blot [10] 1 郾 2 郾 3 摇用 RT 鄄 PCR Northern blot 检测目的 EST 所在 Cl - 通道基因在供试材料幼苗根叶中的转录差异摇试验中使用的同位素 32 P 购自中国同位素有限公司 ( 北京 ) 总 RNA 提取用酸性酚硫氰酸胍氯仿法 [11] 采用半定量 RT 鄄 PCR 方法检测该 EST 所在 Cl - 通道基因在大豆根部的转录水平, 所用引物和 PCR 反应条件同上述 EST 克隆, 循环数降为 28 个以 Actin 基因作为内部参照, Actin 基因 PCR 引物为 A1: 5 忆鄄 GTTCTCTCCTTGTATGCAAGTG 鄄 3 忆, A2: 5 忆鄄 CCAGACTCATCATATTCACCTTTAG 鄄 3 忆, PCR 扩增程序如下 : 94 益 4 min; 94 益 30 s, 55 益 30 s, 72 益 1 min, 共 28 个循环 ; 最后 72 益 10 min 采用半定量 Northern blot 方法检测该 EST 所在 Cl - 通道基因在叶片中的转录水平, Northern blot 用同位素 ( 32 P) 方 [11] 法进行 1 郾 2 郾 4 摇 Cl - 含量的测定摇上述大豆幼苗处理 6 d 后, Cl - [12] 的提取参照於丙军等的方法 Cl - 含量的测定 [13] 参照周强等的方法

第 4 期摇摇摇伍应保, 等 : 栽培大豆和野生大豆亲本及其杂交后代幼苗 Cl - 通道基因表达及其与耐氯性的关系 69 2 摇结果与分析 2 郾 1 摇目的 Cl - 通道基因 EST 的 cdna 克隆和序列分析摇摇通过 RT 鄄 PCR, 一次扩增获得长度在 350 bp 左右 Cl - 通道基因的 cdna 片段, 与预期的大小一致该片段回收后, 连接到 pmd18 鄄 T 载体上,

3 第 4 期摇摇摇伍应保, 等 : 栽培大豆和野生大豆亲本及其杂交后代幼苗 Cl - 通道基因表达及其与耐氯性的关系 69 2 摇结果与分析 2 郾 1 摇目的 Cl - 通道基因 EST 的 cdna 克隆和序列分析摇摇通过 RT 鄄 PCR, 一次扩增获得长度在 350 bp 左右 Cl - 通道基因的 cdna 片段, 与预期的大小一致该片段回收后, 连接到 pmd18 鄄 T 载体上, 测序结果表明, cdna 序列的确切长度为 367 bp, 与拼接的 EST 序列经比对分析可知是目的 EST 片段 ( 图 1 中 EST 郾 seq), 从而可知该 EST 所在 Cl - 通道基因存在于大豆基因组内图 1 摇 Cl - 通道基因的 EST 序列与 Southern blot 探针 ( 图中 DNA 郾 seq) 的核苷酸序列及其比对 Fig 郾 1 摇 EST sequence and Southern blot probe nucleotide acid sequence (DNA 郾 seq) of Cl - channel gene and their alignment 黑色部分代表二者相同的核苷酸序列 The black boxes represent the same nucleotide acid sequences. 2 郾 2 摇 Cl - 通道基因 Southern blot 探针的克隆序列比对及其在栽培和野生大豆及其杂交后代中的基因拷贝数分析通过 PCR 扩增获得长度在 560 bp 左右 Cl - 通道基因的部分片段, 该片段回收后, 连接到 pmd18 鄄 T 载体上, 经测序得知该序列的确切长度为 579 bp ( 图 1 中 DNA 郾 seq) 将该序列与目的 Cl - 通道基因 EST 序列比对分析 ( 图 1), 可知是目的 EST 对应在基因组 DNA 上的序列, 即为 Southern blot 探针的序列以图 1 中 DNA 郾 seq 为探针进行 Southern blot, 结果表明, 当用内切酶 EcoR 玉和 Nde 玉酶切基因组 DNA 时, 无论是亲本 (Jackson 和 BB52), 还是其杂交后代 JB185 (F 5 ) 的拷贝数没有差异 ( 都是 1 条带 ); 当用内切酶 Dra 玉酶切时, 亲本和杂交后代的拷贝数也没有差异 ( 都是 2 条带 ) 从 3 种内切酶的结果可知, 该目的 EST 所在 Cl - 通道基因在亲本及杂交后代中的拷贝数没有差异 ( 图略 ) 2 郾 3 摇目的 EST 所在 Cl - 通道基因在盐胁迫栽培大豆和野生大豆及其杂交后代幼苗中的转录差异采用半定量 RT 鄄 PCR 和 Northern blot 的方法分别分析了目的 EST 所在 Cl - 通道基因在盐胁迫的供试 3 种材料根和叶中的转录水平在根中该基因的转录在野生大豆 BB52 种群和杂交后代 JB185 (F 5 ) 株系中随着盐胁迫时间的延长表现增强趋势, 在栽培大豆 Jackson 品种中表现减弱趋势, 且在 JB185 (F 5 ) 中的表达量多维持在较高水平 ( 图 2) 在叶片中该 EST 所在基因在 Jackson 中随着盐胁迫时间的延长其表达量有逐渐下降趋势, 但是在 BB52 和 JB185 (F 5 ) 中表达量相对稳定, 在 JB185 (F 5 ) 中更为明显 ( 图 3) 图 2 摇 150 mmol L -1 NaCl 胁迫 h 时目的 EST 所在 Cl - 通道基因在栽培大豆和野生大豆及其杂交后代幼苗根中 RT 鄄 PCR 结果 Fig 郾 2 摇 RT 鄄 PCR of EST of Cl - channel gene ( CLCs) in roots of G 郾 soja, G 郾 max and their F 5 hybrid seedlings stressed with 150 mmol L -1 NaCl for 0, 1, 3, and 12 h, respectively

70 摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇南摇京摇农摇业摇大摇学摇学摇报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第 32 卷图 3 摇 150 mmol L -1 NaCl 胁迫 0 1 3 12 h 时目的 EST 所在 Cl - 通道基因在栽培大豆和野生大豆及其杂交后代幼苗叶片中 Northern blot 结果 Fig 郾 3 摇 Northern blot of EST of Cl - channel

4 70 摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇南摇京摇农摇业摇大摇学摇学摇报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第 32 卷图 3 摇 150 mmol L -1 NaCl 胁迫 h 时目的 EST 所在 Cl - 通道基因在栽培大豆和野生大豆及其杂交后代幼苗叶片中 Northern blot 结果 Fig 郾 3 摇 Northern blot of EST of Cl - channel gene ( CLCs) in leaves of G 郾 soja, G 郾 max and their F 5 hybrid seedlings stressed with 150 mmol L -1 NaCl for 0, 1, 3, and 12 h, respectively 2 郾 4 摇盐胁迫对野生大豆和栽培大豆亲本及其杂交后代幼苗体内 Cl - 含量的影响在 mmol L -1 NaCl 分别处理 6 d 时, 与各自对照相比, 供试 3 种材料大豆幼苗根叶中 Cl - 含量及在植株中的总含量随着盐浓度的上升都呈升高趋势, 其中在根部的升幅都达显著水平, 而叶中仅在 150 mmol L -1 NaCl 处理下才显著上升就根部而言, BB52 种群 Cl - 含量最高, Jackson 品种最低 ; 就叶片而言, 情况则相反, JB185 (F 5 ) 株系介于两亲本之间 ( 图 4 A, B) 从植株整体来看, 同等条件下 Jackson 幼苗体内 Cl - 含量较 BB52 和杂交后代 JB185 (F 5 ) 株系都要高, 后两者 Cl - 含量相当 ( 图 4 C) Fig 郾 4 摇图 4 摇不同 NaCl 浓度胁迫 6 d 对栽培大豆和野生大豆及其杂交后代幼苗根 (A) 叶 (B) 和植株 (C) 内 Cl - 含量的影响 Effects of NaCl with different concentrations for 6 days on Cl - content in roots (A), leaves (B) and plants (C) of G 郾 soja, G 郾 max and their F 5 hybrid seedlings 不同字母表示在 5% 水平差异显著 Different letters are significantly different at 0 郾 05 level. 3 摇讨论植物体内 Cl - 通道的种类很多, 功能多样 [4] 本实验室已有的研究结果显示, NaCl 胁迫下外加 Zn 2+ 可通过抑制大豆植株的 Cl - - 吸收提高对 NO 3 吸收和增强光合作用来缓解大豆幼苗的氯 ( 盐 ) 害, 这表明可从植物化学调控角度在一定程度上来改变大豆的氯 ( 盐 ) 敏感性 [8,14], 但其有效性毕竟受到施用浓度环境条件等因素的制约 ; 而栽培大豆和滩涂野生大豆杂交组合 ( Jackson 伊 BB52) 经逐代耐盐性筛选获得的后代 JB185 (F 4 ) 株系, 与其野生亲本 BB52 种群一样表现对 Na + 敏感但对 Cl - 较强的耐性 [15] 本研究中, 根据 EST 数据库拼接并确认的目的 EST 序列所在的大豆 Cl - 通道基因在上述杂交组合亲本及其杂交后代 JB185 (F 5 ) 株系等材料之间的拷贝数无差异, 说明该基因在栽培大豆和野生大豆种间存在普遍性和相似性不过在盐胁迫下, 该基因在供试材料幼苗根和叶中的转录水平存在明显差异, 且随着盐胁迫时间的延长, 在 BB52 种群和 JB185 (F 5 ) 根及叶中的转录水平表现增强趋势或保持相对较高水平, 在 JB185 (F 5 ) 中更为明显这表明, 通过栽培大豆和滩涂野生大豆间的杂交可能激活了该基因在杂交后代中的转录过程因此, 从传统杂交和分子遗传改良等角度, 利用滩涂野生大豆的耐氯 ( 盐 ) 性来提高栽培大豆的耐氯 ( 盐 ) 性, 则具有明显的优势和应用价值在不同盐浓度胁迫下, 野生大豆 BB52 和杂交后代 JB185 (F 5 ) 幼苗体内积累的 Cl - 相对较少, 且主 [7] 要积累在根部, 向叶片运输比例较小, 而栽培大豆 Jackson 相反 Li 等首次在 NaCl 处理的转栽培大豆 GmCLC1 (Cl - 通道蛋白基因 ) 和 GmNHX1 (Na + / H + antiporter 基因 ) 烟草 BY 2 细胞的液泡中检测到

5 第 4 期摇摇摇伍应保, 等 : 栽培大豆和野生大豆亲本及其杂交后代幼苗 Cl - 通道基因表达及其与耐氯性的关系 71 高含量的 Cl - 和 Na + 存在, 进一步研究发现 GmCLC1 和 GmNHX1 蛋白均定位于液泡膜上, 分别起到控制液泡膜上 Cl - 和 Na + 内流的作用经序列比对, 本文中的 Cl - 通道基因的 EST 序列与该 GmCLC1 全长编码 [7] 序列并无同源性根据上述大豆目的 EST 所在 Cl - 通道基因在供试材料根和叶中的转录水平及 Cl - 在体内积累和器官分配等方面均存在显著差异的结果, 笔者推测本文中大豆 EST 序列所在 Cl - 通道基因, 可能编码一种位于根叶细胞质膜上的控制 Cl - 外流的 Cl - 通道蛋白该基因的拷贝数虽然无差异, 但其转录水平表现种间特异性与差异性, 即主要与大豆的原初盐渍生境关系密切, 而与后天短暂的盐胁迫刺激关系较小, 其增强转录特性可通过滩涂野生大豆和栽培大豆间的杂交和逐代耐盐性筛选过程向其后代转移不过有关该基因的全长编码序列及其编码的 Cl - 通道蛋白的具体亚细胞定位和作用方式都尚不清楚此外, 关于 GmCLC1 和 GmNHX1 在野生大豆 ( 尤其是滩涂野生大豆 ) 及其与栽培大豆杂交后代中的存在情况表达特性及其编码蛋白的功能, 都是值得今后应深入研究的课题参考文献 : [1] 摇邵桂花, 常汝镇, 陈一舞. 大豆耐盐性遗传的研究 [J]. 作物学报, 1994, 20(6): [2] 摇 Luo Q Y, Yu B J, Liu Y L. Differential sensitivity to chloride and sodium ions in seedlings of G 郾 max and G 郾 soja under NaCl stress [ J]. J Plant Physiol, 2005, 162: [3] 摇陈宣钦, 刘怀攀, 罗庆云, 等. 耐盐性不同的野大豆种子和幼苗对等渗水分和 NaCl 胁迫的响应 [J]. 南京农业大学学报, 2006, 29(4): [4] 摇 White P J, Broadley M R. Chloride in soils and its uptake and movement within the plant: a review [J]. Ann Bot, 2001, 88: [5] 摇於丙军, 刘友良. 植物中的氯氯通道和耐氯性 [J]. 植物学通报, 2004, 21(4): [6] 摇 de Angeli A, Monachello D, Ephritikhine G, et al. The nitrate / proton antiporter AtCLCa mediates nitrate accumulation in plant vacuoles [ J]. Nature, 2006, 442: [7] 摇 Li W Y F, Wong F L, Tsai S N, et al. Tonoplast 鄄 located GmCLC1 and GmNHX1 from soybean enhance NaCl tolerance in transgenic bright yellow(by) 鄄 2 Cells [J]. Plant Cell and Environ, 2006, 29: [8] 摇屈娅娜, 於丙军. 氯离子通道抑制剂对盐胁迫下野生和栽培大豆幼苗离子含量等生理指标的影响 [ J]. 南京农业大学学报, 2008, 31(2): [9] 摇黄骥, 张红生, 曹雅君, 等. 水稻功能基因的电子克隆策略 [J]. 中国水稻科学, 2002, 16(4): [10] Wang J, Zhang L 鄄 D, Zuo K 鄄 J, et al. Cloning and expressional studies of the voltage 鄄 dependent anion channel gene from Brassica rapa L. [J]. J Integrat Plant Biol, 2006, 48(2): [11] 萨姆布鲁克 J, 拉塞尔 D W. 分子克隆实验指南 [M]. 3 版. 黄培堂, 译. 北京 : 科学出版社, 2002: [12] 於丙军, 罗庆云, 曹爱忠, 等. 栽培大豆和野生大豆耐盐性及离子效应的比较 [ J]. 植物资源与环境学报, 2001, 10 (1 ): [13] 周强, 李萍, 曹金花, 等. 测定植物体内氯离子含量的滴定法和分光光度法比较 [ J]. 植物生理学通迅, 2007, 43 (6 ): [14] Qu Y 鄄 N, Zhou Q, Yu B 鄄 J. Effects of Zn 2+, niflumic acid on photosynthesis in Glycine soja and Glycine max seedlings under NaCl stress [J]. Environ Exp Bot, 2009, 65: [15] 陈宣钦, 於丙军, 刘友良. 栽培和野生大豆及其杂交后代幼苗的耐氯性与多胺积累的关系 [ J]. 植物生理与分子生物学学报, 2007, 33(1): 责任编辑 : 夏爱红

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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