實驗三 管柱層析與薄層層析

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1 實驗三 管柱層析與薄層層析 目的 : 藉由管柱色層分析法來分離存在於蕃茄中的 Lycopene 和 β-carotene 並用薄層層析法鑑定之 原理 : 除蒸餾 萃取和再結晶方法外, 層析 (chromatography, 原義為色層分析 ) 亦是一種高效率分離混合物的方法 在所有的層析分離法中, 樣品皆溶於一個動相 (mobile phase), 它可以是一種氣體 液體或超臨界流體 (supercritical fluid) 此動相接著被迫通入一個不互溶的固定相 (stationary phase) 中, 此固定相已被固定於管柱內或一個固體表面上 這兩相的選取乃為了使樣品中的成份在動相與靜相間有不同程度的分佈 假設 A 為極性較大的化合物 B 為極性較小的化合物,A B 與固定相的吸引力以 A 較強, 故留置的時間長, 所以 A B 同時進入固定相時, 則 B 先離開固定相,A 次之, 如此便達到分離的目的 由於流動率 (mobility) 不同的結果, 樣品成份乃分離成若干不連續的層帶, 因此可進而做定性或定量分析 目前已有的層析法種類很多, 例如 : 濾紙層析法 (paper chromatography), 管柱層析法 (column chromatography), 薄層層析法 (thin-layer chromatography), 氣相層析法 (gas chromatography), 高壓液相層析法 (high pressure chromatography) 及離子交換層析法 (ion-exchange chromatography) 等 一 管柱層析 : Liquid-Solid Chromatography 此種層析其動相為液體, 固定相為細小顆粒之固體, 操作時將固體顆粒充填於管柱中 ( 所以又稱管柱層析 Column Chromatography), 由液體沖提過充填固體顆粒之管柱 ( 所以液體稱為沖提液 eluting solvent) 來進行分離鑑定, 如圖一 固體顆粒表面以靜電力 (electrostatic forces) 和凡得瓦而力 (van der Waals forces) 吸附化合物, 而沖提液對化合物有其溶解度, 兩力的作用達到分離的目的 現在用 K 表示此種作用 K A = 每單位表面面積吸附 溶質之量 溶質在溶液中之濃度 化合物的結構 固定相之成分結構 沖提液的極性大小都會影響 K 值 當化合物的結構與固定相之成分結構同是高極性時, 因吸引力大故 K 值大, 所以留置管柱時間長 若是化合物的結構與固定相之成分結構一是高極性 一是低極性時, 因吸引力小故 K 值小, 所以留置管柱時間短 而沖提液是高極性時, 其作用大於吸附作用, 即 K 值小所以留置管柱時間短 因此選擇適當的固定相及合適極性的沖提液是實驗者必須訓練的技術 下面提供一些數據供參考 : 1

2 A. 層析的固定相對極性化合物之吸附力大小 Activated alumina, charcoal > Activated magnesium silicate > Activated silicic acid(silica gel) > Inorganic carbonate > Sucrose,starch B. 沖提液之沖提力大小 Organic acid > Alcohols > Ketones > Ethers > Partially halogenated hydrocarbons > Aromatic hydrocarbons > Saturated hydrocarbons 沖提液 海砂 矽膠 海砂棉花活栓試管收集液 圖一管柱層析之基本裝置圖二 薄層層析薄層層析 ( 簡稱為 T.L.C.) 是以鋁礬土 (alumina) 矽膠(silica ge1) 或其它已含有膠結劑 ( 常用的是硫酸鈣 ) 的物質混成稀泥塗抹在乾淨的玻片或鋁片上, 厚度約 0.3cm 乾燥後, 待分離的混合物利用毛細管輕輕地點在 T. L.C. 片底端, 點愈小則分離的效果愈好 然後放入含有展開劑 (developing solvent) 的容器中, 展開劑由於毛細作用, 經過小點上升, 而混合物對薄層的吸附力不同, 所以各成分上升的速率不同, 而達到分離的效果 若混合物有顏色則可以用肉眼分辨之 ; 若無色則可以用物理或化學方法呈色 ( 註 1), 由呈色的位置計算各成分移動的距離, 與展開劑移動的距離之比值, 得 Rf 值,R f 值為該化合物與此溶劑的特性值, 可作鑑定之用 ( 註 2) 2

3 Rf 某成份移動之距離 展開劑移動之距離 註 1: 如果將展開後的薄層層析片, 放入含有碘的瓶子中, 各成分會吸附碘蒸氣而呈色 ; 取出薄層層析片後, 迅速用鉛筆做下記號, 否則顏色會褪掉 某些矽膠或礬土在售出前已混有發光劑, 將展開後的薄層層析片放在紫外 (UV) 燈照射下, 便可明顯判別會吸收紫外光之各成分的位置 UV 光傷眼 皮膚, 勿直視 UV 燈 註 2: 薄層層析在有機化學上有很多重要的用途 : (1) 估計兩化合物是否相同 :R f 不同的, 必為不同化合物, 但 R f 相同的, 則不一定是相同的化合物 (2) 決定混合物至少含有多少不同成分 (3) 決定管柱層析所適用的沖提劑 (4) 檢視各種分離方法, 如結晶 萃取 蒸餾和管柱層析的效果 (5) 檢視有機化學反應的進行 三 實驗原理以蕃茄醬代替蕃茄因蕃茄含高達 96% 的水份, 故有機物含量極低, 使用 1 公斤的新鮮蕃茄只層析出 0.02 克的 lycopene, 若改為 1 公斤的蕃茄醬, 則有 0.15 克的 lycopene 本次實驗只用 10 克蕃茄醬, 故量極少 有機物組成蕃茄含較多 lycopene 及紅色素, 若實驗精密, 還可分離出 β-carotene 及黃色素 下為 lycopene 及 β-carotene 的分子結構, 因分子結構中共價鍵的組合不同導致顏色相異且兩者都是碳鏈極長的相似結構, 唯一的不同在於碳鏈兩端,β -carotene 有環狀 lycopene 則無, 亦使兩分子之極性不同 本實驗主要在分離這兩種相似的有機物 蕃茄醬處理首先必須用乙醇將蕃茄醬脫水, 脫水之後再用萃取的方法將兩種有機物萃取到二氯甲烷中, 二氯甲烷蒸發後, 留下粗略的萃取物, 再用管柱色層分析法分離 3

4 H 3 C 2' 15 1' 1 15' 2 Lycopene 2' 15 1' 1 15' 2 -Carotene 實驗藥品 : 蕃茄醬 10g 95% Ethanol ( 乙醇 ) 10ml Dichloromethane ( 二氯甲烷 ) 20ml n-hexane ( 正己烷 ) 70ml Ethyl Acetate ( 乙酸乙酯 ) 15ml Silica gel ( 矽膠 ) 8g Sat. Sodium Chloride ( 飽和食鹽水 )10ml Sea Sand ( 海砂 ) 4g Magnesium Sulfate Anhydrous ( 無水硫酸鎂 ) 實驗器材 : 層析管 抽氣過濾瓶 T.L.C. 片 展開槽 白瓷漏斗 毛細管 試管及架 玻璃漏斗 鑷子 棉花 磁石 實驗步驟 : 實驗步驟長, 可提前至實驗室進行步驟 1~2 一 管柱的填充 1. 確實以清潔劑刷洗玻璃管柱 裝矽膠用的 250ml 燒杯 玻棒 漏斗 50ml 錐形瓶 125ml 錐形瓶 2 個 玻璃滴管 2 隻 圓底燒瓶 2 個及試管 10 隻, 並用少許丙酮潤洗後烘乾 ( 塑膠類不可進烘箱 ) 若沒洗淨殘留物會導致實驗誤差 2. 取一乾燥後的 125ml 錐形瓶裝 70ml 正己烷, 蓋上蓋子備用 3. 取一玻璃管柱下端塞入少許棉花, 平鋪一層海砂約 1.5 g, 加入 10~15ml 正己烷 ( 注意不可破壞海砂面 ), 打開活栓並用安全吸球輕敲管柱將氣泡排出 4. 稱 8g 矽膠於 250ml 燒杯中, 加入約 20ml 正己烷用玻棒攪拌至均勻無氣泡 5. 管柱上放玻璃漏斗, 下面放 125ml 錐形瓶, 將步驟 4 的矽膠迅速攪拌倒入, 開活栓, 再用少許的正己烷潤洗燒杯 玻璃漏斗及層析管壁, 將矽膠盡量洗入層析管中, 以安全吸球輕敲管壁, 使管柱內矽膠緊密且無氣泡 ( 反覆數次切記管柱內不可乾掉 ) 4

5 6. 待矽膠層上完全無溶劑後, 取約 1.5 g 海砂以藥匙平鋪在矽膠層上, 不可破壞矽膠面的平整, 沿管壁邊加入少許正己烷, 將溶劑流至與海砂平面齊 ( 漏出的無污染溶劑可回收再利用 ), 即完成管柱填充 二 蕃茄醬的前處理 1. 稱 10g 蕃茄醬於 50ml 燒杯中, 加入 10ml 95% 乙醇使用磁石攪拌約 3 分鐘至黏稠狀消失 2. 以抽氣過濾裝置過濾, 留下濃稠狀固體 ( 濾液丟棄 ) 3. 將固體刮進燒杯中, 加 10ml 二氯甲烷用藥匙背面攪拌使之溶解, 溶液呈紅色後, 用抽氣過濾法過濾, 濾液保留 關閉抽氣閥防止抽乾濾液 4. 重複步驟 3 5. 合併步驟 3 4 的濾液, 倒入分液漏斗中加入 10ml 飽和食鹽水後進行萃取, 待分層後, 收集有機層至乾燥的 50ml 錐型瓶中 6. 有機層以無水硫酸鎂除去水分, 棉花放入玻璃漏斗內將溶劑濾到乾燥的 50ml 圓底燒瓶中, 再用少許的二氯甲烷潤洗錐型瓶及棉花 7. 以減壓濃縮機抽乾溶劑, 加入 1 ml 正己烷溶解樣品此為 A 溶液, 並在 T.L.C. 片 M 點上點 3~5 次 ( 參考 : 四 點 TLC 片方法 ) 三 分析樣品的分離 -- 管柱沖提步驟 1. 上述 A 溶液以乾淨的滴管吸出, 將滴管伸入管柱內的海砂層上方, 小心的沿著管壁滴入填充好的管柱中, 打開活栓讓液體流入矽膠層 2. 取約 0.5ml 的正己烷小心的沿管壁加入, 此時正己烷會呈黃色, 讓上層液流入矽膠中 重覆此步驟 4~6 次, 直到海砂上層的沖提液為透明無色後小心的將正己烷加入管柱中, 加滿 3. 接滴出物, 控制滴出速率為 1~2 滴 / 秒, 適時補充正己烷且更換試管直到黃色的 β-carotene 完全流出止 ( 若滴出物為透明無色表示正己烷並無污染, 可重複使用 ) 4. 增加溶劑極性, 加入 15ml 乙酸乙酯 (E.A.) 且適時補充乙酸乙酯並更換試管, 直到橘紅色的 lycopene 完全流出止 5. 分別用乾燥的圓底燒瓶裝黃色的 β-carotene 和橘紅色的 lycopene, 以減壓濃縮機移去溶劑, 再加入約 0.5 ml 正己烷溶解, 以 T.L.C. 片鑑定分離效果 四 樣品的鑑定 -- 點 T.L.C. 片方法 1. 取 T.L.C. 片 ( 約長 7cm 寬 3cm), 用鉛筆在 0.7cm 處輕畫一條線為起始線, 並點 3 點 (β,m,l) 另在約離頂點 0.3cm 處輕畫一條線, 為終點如圖二 2. 用毛細管先在 M 點上混合物, 再將分離濃縮後的黃色 β-carotene 與紅色 lycopene, 點在 T.L.C. 片標示點上, 黃色點須點 15~20 次, 紅色 5~7 次, 注意不可使點擴散 ( 毛細管依毛細現象吸入化合物, 用完以丙酮清洗, 重複使用 ) 3. 將約 10mL 正己烷倒入展開槽, 作為展開液, 再放入一片濾紙 用鑷子小心的將 T.L.C. 片放入 ( 展開液不可超過起始點 ), 展開至設定位置, 如圖三 5

6 末端 M L 起始端 = β-carotene M = β-carotene 和 Lycopene 的混合物 L = Lycopene 圖二 T.L.C. 片圖 TLC 展開液 圖三 T.L.C. 片在展開槽之位置 注意事項 : 1. 本次實驗步驟較繁複, 同學須分工合作並可提早到實驗室做準備工作 2. 管柱填充 樣品分離與樣品鑑定等部份實驗須避水 塑膠物品禁止放入烘箱 3. 為了避免使用太多有機溶劑, 造成環境污染 乾淨無污染的溶劑, 可再利用 4. 廢液不可隨便丟棄, 放在指定的地點 5. 管柱內的矽膠將液體流光, 將固體倒入指定的地點, 盡可能將內容物完全倒出後, 再以清潔劑刷洗乾淨 6

7 實驗紀錄及報告 實驗三管柱層析與薄層層析 組別 : 姓名 : 日期 : 實驗數據紀錄 繪出 T.L.C. 片結果 1. 展開液移動之距離 cm 2. β-carotene 移動之距離 cm 3. Lycopene 移動之距離 cm 4. 計算 β-carotene 與 Lycopene 之 R f 值 問題與討論 1. 在管柱層析中, 為何必須小心地填充分離管柱? 2. 在管柱層析中, 為何先用極性較低的沖提液而不用高極性的沖提液? 3. 在薄層層析中, 將 T.L.C. 片放入展開槽中時, 展開液為何不可超過起始點? 7

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