析 2. 檢驗方法 : 檢體經萃取及淨化後, 以液相層析串聯質譜儀 ( liquid chromatograph/tandem mass spectrometer, LC/MS/MS) 分析之方法 2.1. 裝置 : 液相層析串聯質譜儀 : 離子源 : 電灑離子化正離

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1 行政院衛生署公告 中華民國 101 年 3 月 28 日 署授食字第 號 主旨 : 預告修正 食品中動物用藥殘留量檢驗方法 - 四環黴素類抗生素之檢驗, 為食品衛生管理法所定之食品衛生檢驗方法 依據 : 行政程序法第一百五十一條第二項準用第一百五十四條第一項 公告事項 : 一 修正機關 : 行政院衛生署 二 修正依據 : 食品衛生管理法第二十五條 三 草案內容如附件 本案另載於本署網站 ( 網址 : 之網頁及行政院衛生署食品藥物管理局網站 ( 網址 : 之 本局公告 網頁 四 對於本公告內容有任何意見或修正建議, 請於本公告刊登公報之次日起 20 日內陳述意見或洽詢 : ( 一 ) 承辦單位 : 行政院衛生署食品藥物管理局 ( 二 ) 地址 : 台北市南港區昆陽街 號 ( 三 ) 電話 :(02) ( 四 ) 傳真 :(02) ( 五 ) 電子郵件 :hanyi@fda.gov.tw 署 長邱文達 本案依分層負責規定授權局長決行 食品中動物用藥殘留量檢驗方法 - 四環黴素類抗生素之檢驗修正草案總說明 為加強食品中動物用藥殘留之管理, 並依據食品衛生管理法第二十五條規定 : 食品衛生檢驗之方法, 由中央主管機關公告指定之 爰修正 食品中動物用藥殘留量檢驗方法 - 四環黴素類抗生素之檢驗, 其修正要點如下 : 一 增列內臟及蜂蜜之萃取 淨化及檢出限量部分 二 增修訂部分文字 食品中動物用藥殘留量檢驗方法 - 四環黴素類抗生素之檢驗修正草案對照表 修正規定現行規定說明 1. 適用範圍 : 本檢驗方法適用於 1. 適用範圍 : 本檢驗方法適用於畜禽水產品中四環黴素畜禽水產品中四環黴素 (tetracycline) 等 7 品項抗生 (tetracycline) 等 7 品項抗生素 ( 見附表 ) 之多重殘留分素 ( 見附表 ) 之多重殘留分 一 增列內臟及蜂蜜之萃取 淨化及檢出限量部分 二 增修訂部分文字 10960

2 析 2. 檢驗方法 : 檢體經萃取及淨化後, 以液相層析串聯質譜儀 ( liquid chromatograph/tandem mass spectrometer, LC/MS/MS) 分析之方法 2.1. 裝置 : 液相層析串聯質譜儀 : 離子源 : 電灑離子化正離子 (positive ion electrospray ionization, ESI + ) 層析管 : ACQUITY CSH C18,1.7 μm, 內徑 2.1 mm x 100 mm, 或同級品 離心機 (Centrifuge): 可控溫達 4 以下 振盪器 (Shaker) 均質機 (Homogenizer) 氮氣蒸發裝置 (Nitrogen evaporator) 固相真空萃取裝置 (Solid phase extraction vacuum manifolds) 旋渦混合器 (Vortex mixer) 析 2. 檢驗方法 : 檢體經萃取及淨化後, 以液相層析串聯質譜儀 ( liquid chromatograph/tandem mass spectrometer, LC/MS/MS) 分析之方法 2.1. 裝置 : 液相層析串聯質譜儀 : 離子源 : 電灑離子化正離子 (positive ion electrospray ionization, ESI + ) 層析管 : ACQUITY CSH C18,1.7 μm, 內徑 2.1 mm x 100 mm, 或同級品 離心機 (Centrifuge): 可控溫達 4 以下 振盪器 (Shaker) 均質機 (Homogenizer) 氮氣蒸發裝置 (Nitrogen evaporator) 固相真空萃取裝置 (Solid phase extraction vacuum manifolds) 旋渦混合器 (Vortex mixer) 10961

3 2.2. 試藥 : 甲酸 甲醇 乙腈及正己烷均採用液相層析級 ; 三氯醋酸 (trichloroacetic acid) 磷酸氫二鈉 (sodium dihydrogen phosphate monohydrate) 檸檬酸 鹽酸 氫氧化鈉及乙二胺四乙酸二鈉 (disodium ethylenediaminetetraacetate ) 均採用試藥特級 ; 去離子水 ( 比電阻於 25 可達 18 MΩ cm 以上 ); 鹽酸四環黴素 鹽酸氯四環黴素 鹽酸羥四環黴素 脫氧羥四環黴素 4- epimer-tetracycline 4- epimer-oxytetracycline 及 4-epimer-chlortetracycline 對照用標準品 2.3. 器具及材料 : 離心管 :50 ml,pp 材質 固相萃取匣 (Solid phase extraction cartridge):oasis HLB,6 ml,500 mg, 或同級品 濾紙 :Whatman No.2, 或同級品 濾膜 : 孔徑 0.22 μm, Nylon 材質 2.4. 試劑之調製 : M 檸檬酸溶液 : 稱取檸檬酸 19 g, 以去離子水溶 2.2. 試藥 : 甲酸 甲醇 乙腈及正己烷均採用液相層析級 ; 氫氧化鈉 磷酸氫二鈉 檸檬酸 鹽酸 氫氧化鈉及乙二胺四乙酸二鈉 (disodium ethylenediaminetetraacetate ) 均採用試藥特級 ; 去離子水 ( 電阻係數可達 18 MΩ cm 以上 ); 鹽酸四環黴素 鹽酸氯四環黴素 鹽酸羥四環黴素 脫氧羥四環黴素 4-epimertetracycline 4-epimeroxytetracycline 及 4- epimer-chlortetracycline 對照用標準品 2.3. 器具及材料 : 離心管 :50 ml,pp 材質 固相萃取匣 (Solid phase extraction cartridge):oasis HLB,6 ml,500 mg, 或同級品 濾紙 :Whatman No.5, 或同級品 濾膜 : 孔徑 0.22 μm, Nylon 材質 2.4. 試劑之調製 : M 檸檬酸溶液 : 稱取檸檬酸 19 g, 以水溶解使成 10962

4 解使成 1000 ml M 磷酸氫二鈉溶液 : 稱取磷酸氫二鈉 28.4 g, 以去離子水溶解使成 1000 ml MacIlvaine 緩衝溶液 : 取 0.1 M 檸檬酸溶液 615 ml 及 0.2 M 磷酸氫二鈉溶液 385 ml, 混合後調整至 ph 含 0.01 M 乙二胺四乙酸二鈉之 MacIlvaine 緩衝溶液 : 稱取乙二胺四乙酸二鈉 3.36 g, 以 MacIlvaine 緩衝溶液 1000 ml 溶解 % 乙腈溶液 : 取乙腈與去離子水 2:8(v/v) 比例混合 % 甲醇溶液 : 取甲醇與去離子水以 5:95(v/v) 比例混合 % 三氯醋酸溶液 : 稱取三氯醋酸 25 g, 以去離子水溶解使成 1000 ml 2.5. 移動相溶液之配製 : 移動相溶液 A: 取甲酸 1 ml, 1000 ml M 磷酸氫二鈉溶液 : 稱取磷酸氫二鈉 28.4 g, 以水溶解使成 1000 ml MacIlvaine 緩衝溶液 : 取 0.1 M 檸檬酸溶液 615 ml 及 0.2 M 磷酸氫二鈉溶液 385 ml, 混合後調整至 ph 含 0.01 M 乙二胺四乙酸二鈉之 MacIlvaine 緩衝溶液 : 稱取乙二胺四乙酸二鈉 3.36 g, 以 MacIlvaine 緩衝溶液 1000 ml 溶解 % 乙腈溶液 : 取乙腈與去離子水以 2:8(v/v) 比例混合 % 甲醇溶液取甲醇與去離子水以 5:95(v/v) 比例混合 2.5. 移動相溶液之配製 : 移動相溶液 A: 取甲酸 1 ml, 10963

5 加去離子水使成 1000 ml, 以濾膜過濾, 取濾液供作移動相溶液 A 移動相溶液 B: 取甲酸 1 ml, 加乙腈使成 1000 ml, 以濾膜過濾, 取濾液供作移動相溶液 B 2.6. 標準溶液之調製 : 取相當於含四環黴素 氯四環黴素 羥四環黴素, 以及脫氧羥四環黴素 4-epimer-tetracycline 4-epimer-oxytetracycline 4-epimer-chlortetracycline 對照用標準品各約 10 mg, 精確稱定, 分別以甲醇溶解並定容至 10 ml, 作為標準原液, 貯存於 -20 臨用時分別量取適量標準原液混合, 以 20% 乙腈溶液稀釋至 0.001~1.0 μg/ ml, 供作標準溶液 2.7. 檢液之調製 : 萃取 : 肌肉 : 將檢體細切均質後, 取約 5 g, 精確稱定, 置於離心管中 加入 MacIlvaine 緩衝溶液 15 ml, 旋渦混合 1 分鐘, 振盪 5 分鐘, 以 3200 g 離心 加去離子水使成 1000 ml, 以濾膜過濾, 取濾液供作移動相溶液 A 移動相溶液 B: 取甲酸 1 ml, 加乙腈使成 1000 ml, 以濾膜過濾, 取濾液供作移動相溶液 B 2.6. 標準溶液之配製 : 取相當於含四環黴素 氯四環黴素 羥四環黴素, 以及脫氧羥四環黴素 4-epimer-tetracycline 4-epimer-oxytetracycline 4-epimer-chlortetracycline 對照用標準品各約 10 mg, 精確稱定, 分別以甲醇溶解並定容至 10 ml, 作為標準原液, 貯存於 -20 臨用時分別量取適量標準原液混合, 以 20% 乙腈溶液稀釋至 0.001~1.0 μg/ ml, 供作標準溶液 2.7. 檢液之調製 : 萃取 : 肌肉 : 將檢體細切均質後, 取約 5 g, 精確稱定, 置於離心管中 加入 MacIlvaine 緩衝溶液 15 ml, 旋渦混合 1 分鐘, 振盪 5 分鐘, 以 4000 rpm 離心 10964

6 10 分鐘, 取上清液 殘留物再加入 MacIlvaine 緩衝溶液 15 ml, 重複萃取一次, 合併上清液 加入正己烷 15 ml, 旋渦混合 1 分鐘, 振盪 5 分鐘, 以 3200 g 離心 5 分鐘, 取下層液, 重複此步驟二次, 下層液經濾紙過濾, 供淨化用 乳汁 : 精確量取檢體 5 ml, 置於離心管中, 加入 MacIlvaine 緩衝溶液 20 ml, 旋渦混合 1 分鐘, 振盪 5 分鐘, 以 3200 g 離心 10 分鐘, 取上清液供淨化用 內臟 : 將檢體細切均質後, 取約 2 g, 精確稱定, 置於離心管中 加入 2.5% 三氯醋酸溶液 10 ml, 旋渦混合 1 分鐘, 振盪 5 分鐘, 以 3200 g 10 分鐘, 取上清液 殘留物再加入 MacIlvaine 緩衝溶液 15 ml, 重複萃取一次, 合併上清液 加入正己烷 15 ml, 旋渦混合 1 分鐘, 振盪 5 分鐘, 以 4000 rpm 離心 5 分鐘, 取下層液, 重複此步驟二次, 下層液經濾紙過濾, 供淨化用 乳汁 : 精確量取檢體 5 ml, 置於離心管中, 加入 MacIlvaine 緩衝溶液 20 ml, 旋渦混合 1 分鐘, 振盪 5 分鐘, 以 4000 rpm 離心 10 分鐘, 取上清液供淨化用 10965

7 離心 5 分鐘, 取上清液 殘留物加入 MacIlvaine 緩衝溶液 15 ml, 旋渦混合 1 分鐘, 振盪 5 分鐘, 以 3200 g 離心 5 分鐘, 合併上清液 加入正己烷 10 ml, 旋渦混合 1 分鐘, 振盪 5 分鐘, 以 3200 g 離心 5 分鐘, 重複此步驟二次, 下層液供淨化用 蜂蜜 : 將檢體混合均勻後, 取約 5 g, 精確稱定, 置於離心管中, 加入 MacIlvaine 緩衝溶液 25 ml, 旋渦混合 1 分鐘, 振盪 5 分鐘, 以 3200 g 離心 10 分鐘, 取上清液供淨化用 淨化 : 肌肉與乳汁 : 取 或 節供淨化用溶液, 注入預先以甲醇 6 ml 淨化 : 取 或 節供淨化用溶液, 注入預先以甲醇 6 ml 及去離子水 6 ml 潤洗之固相萃取匣, 10966

8 及去離子水 6 ml 潤洗之固相萃取匣, 棄流出液 以 5% 甲醇溶液 6 ml 流洗, 棄流出液 再以甲醇 6 ml 沖提, 收集沖提液, 於 40 水浴中以氮氣吹乾, 殘留物以 20% 乙腈溶液溶解並定容至 1 ml, 經濾膜過濾, 供作檢液 內臟與蜂蜜 : 取 或 節供淨化用溶液, 注入預先以甲醇 6 ml 及去離子水 6 ml 潤洗之固相萃取匣, 棄流出液 以去離子水 6 ml 及 5% 甲醇溶液 6 ml 流洗, 棄流出液 再以甲醇 6 ml 沖提, 收集沖提液, 於 40 水浴中以氮氣吹乾, 殘留物以 20% 乙腈溶液溶解並定容至 1 ml, 經濾膜過濾, 供作檢液 2.8. 基質匹配檢量線之製作 : 取空白檢體依 2.7. 節 棄流出液 以 5% 甲醇溶液 6 ml 流洗, 棄流出液 再以甲醇 6 ml 沖提, 收集沖提液, 於 40 水浴中以氮氣吹乾, 殘留物以 20% 乙腈溶液溶解並定容至 1 ml, 經濾膜過濾, 供作檢液 2.8. 基質匹配檢量線之製作 : 取空白檢體依 2.7 節 10967

9 萃取淨化及氮氣吹乾後, 分別添加不同濃度標準溶液 1 ml 溶解, 經濾膜過濾後, 依下列條件進行液相層析串聯質譜分析 就各抗生素之波峰面積, 與對應之各抗生素添加濃度, 分別製作基質匹配檢量線 液相層析串聯質譜測定條 ( 註件 ) : 移動相溶液 :A 液與 B 液以下列條件進行梯度分析時間 A(%) B(%) (min) 移動相流速 :0.2 ml/min 注入量 :5 μl 毛細管電壓 (Capillary voltage):2.5 kv 離子源溫度 (Ion source temperature):150 溶媒揮散溫度 (Desolvation temperature):500 溶媒揮散氣體流速 (Desolvation gas flow): 1000 L/hr 偵測模式 : 多重反應偵測 萃取淨化及氮氣吹乾後, 分別添加不同濃度標準溶液 1 ml 溶解, 經濾膜過濾後, 依下列條件進行液相層析串聯質譜分析 就各抗生素之波峰面積, 與對應之各抗生素添加濃度, 分別製作基質匹配檢量線 液相層析串聯質譜測定條 ( 註件 ) : 移動相溶液 :A 液與 B 液以下列條件進行梯度分析時間 A(%) B(%) (min) 移動相流速 :0.2 ml/min 注入量 :5 μl 毛細管電壓 (Capillary voltage):2.5 kv 離子源溫度 (Ion source temperature):150 溶媒揮散溫度 (Desolvation temperature):500 溶媒揮散氣體流速 (Desolvation gas flow): 1000 L/hr 偵測模式 : 多重反應偵測 10968

10 (multiple reaction monitoring, MRM) 偵測離子對 進樣錐電壓 (cone voltage) 與碰撞能量 (collision energy ) 如附表 註 : 上述測定條件分析不適時, 可依所使用之儀器, 設定適合之測定條件 2.9. 鑑別試驗及含量測定 : 精確量取檢液及標準溶液各 5 μl, 分別注入液相層析串聯質譜儀中, 依 2.8. 節條件進行分析 就檢液與標準溶液所得波峰之滯留時間及多重反應偵測相對離子強度鑑別之 ( 註 ), 並依下列計算式, 求出檢體中各抗生素之含量 (ppm): 檢體中各抗生素之含量 (ppm) = C V M C: 由基質匹配檢量線求得檢液中各抗生素之濃度 (μg/ml) V: 檢體最後定容之體積 (ml) M: 取樣分析檢體之重量 (g) 註 : 相對離子強度由定性 離子對與定量離子對 之波峰面積比而得 ( 100% ), 容許範圍如下 : (multiple reaction monitoring, MRM) 偵測離子對 進樣錐電壓 (cone voltage) 與碰撞能量 (collision energy ) 如附表 註 : 上述測定條件分析不適時, 可依所使用之儀器, 設定適合之測定條件 2.9. 鑑別試驗及含量測定 : 精確量取檢液及標準溶液各 5 μl, 分別注入液相層析串聯質譜儀中, 依 2.8. 節條件進行分析 就檢液與標準溶液所得波峰之滯留時間及多重反應偵測相對離子強度鑑別之 ( 註 ), 並依下列計算式, 求出檢體中各抗生素之含量 (ppm): 檢體中各抗生素之含量 (ppm) = C V M C: 由基質匹配檢量線求得檢液中各抗生素之濃度 (μg/ml) V: 檢體最後定容之體積 (ml) M: 取樣分析檢體之重量 (g) 註 : 相對離子強度由 2 組離子對之波峰面積比而得 ( 100% ), 容許範圍如下 : 10969

11 相對離子強度容許範圍 (%) (%) >50 ±20 >20~50 ±25 >10~20 ±30 10 ±50 附註 : 1. 四環黴素等 7 品項抗生素之檢出限量於肌肉及腎臟均為 2.5 ppb 乳汁均為 1 ppb 肝臟均為 5 ppb 及蜂蜜均為 0.5 ppb 2. 食品中有影響檢驗結果之物質時, 應自行探討 相對離子強度 容許範圍 (%) (%) >50 ±20 >20~50 ±25 >10~20 ±30 10 ±50 附註 : 1. 四環黴素等 7 品項抗生素之檢出限量於肌肉均為 2.5 ppb, 於乳汁均為 1 ppb 2. 食品中有影響檢驗結果之物質時, 應自行探討 10970

12 附表 四環黴素等 7 品項抗生素之多重反應偵測 分析物 離子對 進樣錐電壓 碰撞能量 英文名 中文名 前驅離子 (m/z)> 產物離子 (m/z) (V) (ev) Tetracycline 四環黴素 445 > 410* 445 > Oxytetracycline 羥四環黴素 461 > 426* 461 > Chlortetracycline 氯四環黴素 479 > 444* 479 > Doxycycline 脫氧羥四環黴素 445 > 428* 445 > epimer-tetracycline > 410* 445 > epimer-oxytetracycline > 426* 461 > epimer-chlortetracycline > 444* 479 > * 定量離子對 行政院勞工委員會公告 中華民國 101 年 3 月 28 日 勞中二字第 號 主旨 : 預告訂定 技能職類證書發證及管理辦法 依據 : 行政程序法第一百五十一條第一項 公告事項 : 一 訂定機關 : 行政院勞工委員會 二 訂定依據 : 職業訓練法第三十一條之二規定 10971

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