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氏蛙植
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1 第 42 卷第 3 期 2015 年北京化工大学学报 ( 自然科学版 ) Journal of Beijing University of Chemical Technology ( Natural Science) Vol. 42, No 辅酶 A 依赖的丙醛脱氢酶基因的克隆表达及其对宿主菌生长的影响 * 范如婷摇赵摇鹏摇田平芳 ( 北京化工大学生命科学与技术学院, 北京摇 ) 摘摇要 : 辅酶 A 依赖的丙醛脱氢酶 (PduP) 是以甘油为底物催化合成聚 3 鄄羟基丙酸的关键酶本研究从鼠伤寒沙门氏菌基因组中 PCR 扩增了 pdup 基因, 构建表达载体后转化肺炎克雷伯氏菌, 得到重组菌 K. p( pet 鄄 pk 鄄 pdup) SDS -PAGE 显示 PduP 实现了高效表达生长曲线表明重组菌延迟进入平稳期, 生物量较空质粒对照菌提高了 24 郾 68%,1,3 鄄丙二醇和 2,3 鄄丁二醇的产量分别达到 16 郾 58 g / L 和 15 郾 68 g / L, 甘油转化率比空质粒对照菌和原代菌分别提高了 40 郾 62% 和 34 郾 02% 上述结果表明, 过表达 pdup 重排了代谢流量, 促进了菌体生长关键词 : 丙醛脱氢酶 ; 鼠伤寒沙门氏菌 ; 肺炎克雷伯氏菌 ; 生物量 ; 甘油中图分类号 : Q933 引摇言 1 摇实验部分聚 3 鄄羟基丙酸 (P[3HP]) 是生物相容性良好的可降解新材料 [1] 在生物体内以甘油为底物催化合成 P[3HP] 涉及 3 个关键酶 : 甘油脱水酶辅酶 A 依赖的丙醛脱氢酶 ( PduP) 以及聚羟基脂肪酸合成酶 [2] 肺炎克雷伯氏菌不仅含有天然的甘油歧化途径, 而且存在刚性的 dha 调节子 [3], 能够协调甘油的氧化和还原代谢 [4], 是构建 P[3HP] 工程菌的理想宿主菌甘油代谢的中间产物 3 鄄羟基丙醛具有毒性, 能引起细胞死亡, 因此在很大程度上制约着生物量和目的产物的积累 [5] PduP 可高效转化 3 鄄羟基丙醛生成 3 鄄羟基丙酰辅酶 A [6], 接下来参与胞内三羧酸循环丙酸茁鄄丙氨酸聚羟基脂肪酸等代谢过程, 除此之外, 在某些生物体内还有碳固定的作用 [7] 迄今约有 47 种辅酶 A 依赖的丙醛脱氢酶, 来源于不同的微生物本实验克隆了来自鼠伤寒沙门氏菌 ( Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2) 的 pdup 基因 [8], 并在肺炎克雷伯氏菌中高效表达, 研究 PduP 对宿主菌生长和代谢流量的影响, 为今后构建 P[3HP] 高产菌株奠定基础 1 郾 1 摇材料 1 郾 1 郾 1 摇菌株与载体肺炎克雷伯氏菌 ( Klebsiella pneumoniae MGH78578), 中国科学院微生物所菌种保藏中心 ; 鼠伤寒沙门氏菌 LT2(Salmonella enterica serovar Ty 鄄 phimurium LT2), 美国模式培养物集存库 ( ATCC); 质粒载体 pet 鄄 pk 为本实验室保存 ( 用肺炎克雷伯氏菌中甘油脱水酶基因 dhab 的启动子 pk 替换 pet 鄄 28a 原有 T7 启动子 ); 大肠杆菌感受态细胞 DH5 琢, 博迈德生物技术有限公司 1 郾 1 郾 2 摇主要试剂限制性核酸内切酶 T4 DNA 连接酶,New Eng 鄄 land Biolabs (Beijing) 有限公司 ;DNA 分子量 Mark 鄄 er 蛋白质分子量 Marker, 大连宝生物工程有限公司 ;DNA 聚合酶高纯质粒小提试剂盒和 PCR 产物回收试剂盒, 博迈德生物技术有限公司 ; 其余试剂为国产分析纯 1 郾 1 郾 3 摇培养基 LB(Luria 鄄 Bertani) 培养基 ( g / L): 胰蛋白胨 10, NaCl 10, 酵母提取物 5 固体培养基需加琼脂至终收稿日期 : 浓度 15 g / L 抗生素培养基需加入硫酸卡那霉素至基金项目 : 国家自然科学基金 ( / ) 第一作者 : 女,1990 年生, 硕士生终浓度 50 滋 g / L * 通讯联系人基本发酵培养基 ( g / L): ( NH 4 ) 2 SO 4,4 郾 0; K 2 E 鄄 mail: tianpf@ mail. buct. edu. cn HPO 4 3H 2 O,3 郾 4;MgSO 4 7H 2 O,0 郾 5;KH 2 PO 4,1 郾 3;

2 78 北京化工大学学报 ( 自然科学版 ) 摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇 2015 年 CaCO 3,0 郾 1; 酵母提取物,3 郾 0; 甘油,40; 微量元素, 1 郾 25 ml / L 微量元素 (g / L):MnCl 2 4H 2 O 0 郾 1,ZnCl 2 0 郾 07, NiCl 2 6H 2 O 0 郾 025, FeSO 4 7H 2 O 1, CoCl 2 2H 2 O 0 郾 2,CuCl 2 2H 2 O 0 郾 02,Na 2 MoO 4 2H 2 O 0 郾 035, 硼酸 0 郾 06, 饱和盐酸 4 ml / L 1 郾 2 摇实验方法 1 郾 2 郾 1 摇培养条件菌种活化 :15 mm 伊 150 mm 试管装 4 ml LB 液体培养基, 接种量为 1% ( 体积分数 ),37 益 200 r / min, 震荡培养 12 h 摇瓶发酵 :250 ml 锥形瓶装基本发酵培养基 100 ml, 棉塞封口, 接种量为 1% ( 体积分数 ),37 益 150 r / min 震荡培养 24 h, 每 3 h 取样测定 1 郾 2 郾 2 摇目的基因 pdup 的扩增根据 GenBank 公布的 S. enterica serovar Typhi 鄄 murium LT2 辅酶 A 依赖的丙醛脱氢酶基因 ( pdup) 序列设计引物, 以 S. enterica serovar Typhimurium LT2 基因组 DNA 为模板, 进行聚合酶链式反应, 扩增其基因 pdup 上下游引物酶切位点分别为 EcoR I Hind III, 以下划线部分标注 ( 见表 1) 表 1 摇引物序列 Table 1 摇 Primer sequences 编号序列 P1 5 忆 GAGTACCG GAATTCATGAATACTTCTGAACTCGACCT 3 忆 P2 5 忆 CCC AAGCTTGAGTACCTTCTCTTAGCGAATAGAACGT 3 忆摇摇 PCR 反应参数 :94 益, 4 min;94 益, 1 min,58 益, 40 s,72 益, 90 s, 重复 30 个循环 ;72 益, 10 min; 16 益保存 1 郾 2 郾 3 摇重组菌 K. p(pet 鄄 pk 鄄 pdup) 的构建用 PCR 产物回收试剂盒纯化回收基因 pdup, 用试剂盒提取质粒 pet 鄄 pk, 二者分别于 37 益以 EcoR 砖和 Hind III 同时酶切 2 h, 之后 65 益 10 min 失活 T4 DNA 连接酶 16 益连接 1 h, 连接液转化感受态细胞 E. coli DH5 琢, 涂布含有硫酸卡那霉素的固体平板筛选阳性克隆挑取单菌落培养并提取质粒进行双酶切鉴定, 将重组质粒 pet 鄄 pk 鄄 pdup 电转化 K. pneu 鄄 moniae 获得重组菌 K. p(pet 鄄 pk 鄄 pdup) 1 郾 2 郾 4 摇重组菌的发酵将重组菌 K. p( pet 鄄 pk 鄄 pdup) 进行发酵, 以 K. pneumoniae 野生菌 ( K. p1st) 和含有空质粒 pet 鄄 pk 的 K. pneumoniae( K. p( pet 鄄 pk)) 为对照组将 3 株菌在 LB 培养基中活化, 之后转接基本发酵培养基, 每 3 h 取样测吸光度 OD 600 绘制生长曲线, 测定甘油剩余量 1,3 鄄丙二醇和 2,3 鄄丁二醇产量, 并于 24 h 取样做 SDS 鄄 PAGE 测定 PduP 酶活以分析蛋白表达情况 1 郾 2 郾 5 摇 PduP 酶活测定方法取 24 h 发酵液 10 ml,12000 r / min 离心收集菌体, 用 5 ml PBS 缓冲液 ( ph7 郾 0) 重悬菌体, 超声破碎细胞, 工作条件为 80 W, 工作 3 s, 间隔 2 s, 循环 80 次, 即得粗酶液酶活反应体系为 2 ml, 包括 150 mmol / L 正丙醛 200 滋 L,20 mmol / L NAD 滋 L, 粗酶液 200 滋 L,26 mmol / L 辅酶 A 200 滋 L,PBS 缓冲液 (ph7 郾 0)1 郾 2 ml 37 益水浴 5 min, 通过检测 340 nm 处吸光值的增量来确定反应体系中 NADH 的生成量酶活单位定义 :37 益下, 每 min 催化生成 1 滋 mol NADH 的酶量即为一个酶活力单位之后用 5 ml 考马斯亮蓝 G250 试剂标定 200 滋 L 粗酶液中的总蛋白含量, 得到重组酶的比活力 2 摇结果与讨论 2 郾 1 摇重组菌 K. p(pet 鄄 pk 鄄 pdup) 的构建以 S. enterica serovar Typhimurium LT2 基因组 DNA 为模板, 利用引物 PCR 扩增 pdup 基因, 在接近 1500 bp 附近有条带 ( 如图 1a), 与目的基因 pdup (1395 bp) 的大小相同基因片段与质粒载体酶切连接后转化感受态细胞 E. coli DH5 琢, 抗性平板涂布后, 挑取 14 个单菌落进行菌落 PCR 鉴定, 对鉴定结果正确的 5 个单菌落培养保存, 提取质粒双酶切鉴定, 得到质粒载体 ( 约 5500 bp) 和 pdup 基因 ( 约 1500 bp), 表明重组质粒 pet 鄄 pk 鄄 pdup 构建成功 ( 如图 1b) 将重组质粒电转化 K. pneumoniae 获得重组菌 K. p ( pet 鄄 pk 鄄 pdup) 2 郾 2 摇重组菌蛋白表达及 PduP 酶活重组菌 K. p(pet 鄄 pk 鄄 pdup) 对照菌 K. p1st( 野生菌 ) 和 K. p( pet 鄄 pk) 的蛋白表达情况如图 2 所示 SDS 鄄 PAGE 表明, 重组菌辅酶 A 依赖的丙醛脱氢酶 ( PduP) 得到了高效表达, 大小为 51 郾 43 KDa 为进一步考察重组酶的表达情况, 对重组菌和对照菌进行了 PduP 的酶活测定, 结果如图 3 所示重组菌 24 h PduP 酶活力相比于野生菌和空质粒对照菌分别提高了 7 郾 58 倍和 5 郾 31 倍, 酶活数据

第 3 期摇摇摇摇摇摇范如婷等 : 辅酶 A 依赖的丙醛脱氢酶基因的克隆表达及其对宿主菌生长的影响 79 M DNA 分子量标记 ( DL2000);pduP PCR 产物 ;1 5 双酶切鉴定图 1 摇基因 pdup 与重组质粒 pet 鄄 pk 鄄 pdup 双酶切电泳图 Fig.

2 摇 SDS 鄄 PAGE analysis of protein expression in recombinant strains 图 3 摇重组菌和对照菌 PduP 酶活 Fig.

p(pet 鄄 pk) 的生长曲线如图 4 所示重组菌 K. p( pet 鄄 pk 鄄 pdup) 的生物量与原代菌 (K. p1st) 基本持平, 但相比于带有空质粒载体的对图 4 摇重组菌的生长曲线 Fig.

p( pet 鄄 pk 鄄 pdup) 相比, 后者由于过表达 pdup 基因, 且 PduP 酶活性较高, 在一定程度上能高效转化 3 鄄羟基丙醛 ( 具有细胞毒性 ), 降低了细胞毒性, 推测是菌体生物量提高的原因之一 2 郾 4 摇重组菌甘油消耗及代谢产物对重组菌 K. p(pet 鄄 pk 鄄 pdup) 对照菌 K. p1st K.

3 第 3 期摇摇摇摇摇摇范如婷等 : 辅酶 A 依赖的丙醛脱氢酶基因的克隆表达及其对宿主菌生长的影响 79 M DNA 分子量标记 ( DL2000);pduP PCR 产物 ;1 5 双酶切鉴定图 1 摇基因 pdup 与重组质粒 pet 鄄 pk 鄄 pdup 双酶切电泳图 Fig. 1 摇 Electrophoretograms of pdup and digested pet 鄄 pk 鄄 pdup M 蛋白质 Marker; 1 重组菌 K. p(pet 鄄 pk 鄄 pdup); 2 对照菌 K. p(pet 鄄 pk); 3 野生菌 K. p1st 图 2 摇重组菌与对照菌的 SDS 鄄 PAGE 图 Fig. 2 摇 SDS 鄄 PAGE analysis of protein expression in recombinant strains 图 3 摇重组菌和对照菌 PduP 酶活 Fig. 3 摇 PduP activity of different strains 证明重组菌 PduP 蛋白确实高效表达且具有生物活性 2 郾 3 摇重组菌的生长情况为考察 PduP 的过表达对宿主菌生长代谢的影响, 将重组菌和对照菌分别进行 24 h 发酵, 测定菌体浓度重组菌 K. p ( pet 鄄 pk 鄄 pdup), 对照菌 K. p1st K. p(pet 鄄 pk) 的生长曲线如图 4 所示重组菌 K. p( pet 鄄 pk 鄄 pdup) 的生物量与原代菌 (K. p1st) 基本持平, 但相比于带有空质粒载体的对图 4 摇重组菌的生长曲线 Fig. 4 摇 Growth curves of recombinant strains 照菌却增长很多, 并且相对较晚进入平稳期,9 h 以后, 生物量比空质粒对照菌提高约 24 郾 68% 对照菌 K. p( pet 鄄 pk) 与重组菌 K. p( pet 鄄 pk 鄄 pdup) 相比, 后者由于过表达 pdup 基因, 且 PduP 酶活性较高, 在一定程度上能高效转化 3 鄄羟基丙醛 ( 具有细胞毒性 ), 降低了细胞毒性, 推测是菌体生物量提高的原因之一 2 郾 4 摇重组菌甘油消耗及代谢产物对重组菌 K. p(pet 鄄 pk 鄄 pdup) 对照菌 K. p1st K. p(pet 鄄 pk) 进行发酵, 每 3 h 取样, 气相色谱检测甘油 1,3 鄄丙二醇 2,3 鄄丁二醇含量, 如图 5 所示重组菌甘油消耗量介于野生菌和携带空质粒对照菌之间, 相差不大发酵后期 1,3 鄄丙二醇和 2,3 鄄丁二醇的产量分别达到 16 郾 58 g / L 和 15 郾 68 g / L, 均超过空质粒对照菌, 甚至超过野生菌 ; 甘油总转化率分别比空质粒对照菌和野生菌提高了 40 郾 62% 和 34 郾 02% 在肺炎克雷伯氏菌中, 甘油经氧化代谢首先生成丙酮酸进而转化为 2,3 鄄丁二醇 ; 甘油的还原代谢产物则为 1,3 鄄丙二醇和 3 鄄羟基丙酰辅酶 A 由于具有天然的刚性 dha 调节子 [3,9], 甘油的氧化还原代 [10 - 谢应保持相对平衡 11] 过表达 pdup 基因增强了甘油还原途径的代谢流量, 同时 2,3 鄄丁二醇产量也有较大提高, 说明在 dha 调节子作用下, 氧化途径也 [12 - 得到了相应增强 13], 从而促进胞内能量和物质代谢, 是生物量提高的另一重要因素 3 摇结论 (1) 用 PCR 方法克隆了鼠伤寒沙门氏菌的 pdup 基因, 构建重组载体后转化肺炎克雷伯氏菌并成功表达 (2) 与携带空质粒的对照菌相比, 过表达 PduP

4 80 北京化工大学学报 ( 自然科学版 ) 摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇 2015 年 [2] 摇 Andree 茁 en B, Lange A B, Robenek H, et al. Conversion of glycerol to poly (3 鄄 hydroxypropionate) in recombinant Escherichia coli[j]. Applied and Environmental Microbi 鄄 ology, 2010, 76(2): [3] 摇 Zheng P, Wereath K, Sun J, et al. Overexpression of genes of the dha regulon and its effects on cell growth, glycerol fermentation to 1, 3 鄄 propanediol and plasmid sta 鄄 bility in Klebsiella pneumoniae [ J]. Process Biochemis 鄄 try, 2006, 41(10): [4] 摇 Wei D, Wang M, Jiang B, et al. Role of dihydroxyace 鄄 tone kinases I and II in the dha regulon of Klebsiella pneu 鄄 moniae[ J]. Journal of Biotechnology, 2014, 177: [5] 摇 Luo L H, Kim C H, Heo S Y, et al. Production of 3 鄄 hydroxypropionic acid through propionaldehyde dehydro 鄄 genase PduP mediated biosynthetic pathway in Klebsiella pneumoniae [ J ]. Bioresource Technology, 2012, 103 (1): 1-6. [6] 摇 Sabet 鄄 Azad R, Linares 鄄 Past 佴 n J A, Torkelson L, et al. Coenzyme A 鄄 acylating propionaldehyde dehydrogenase (PduP) from Lactobacillus reuteri: Kinetic characteriza 鄄 tion and molecular modeling[ J]. Enzyme and Microbial Technology, 2013, 53(4): [7] 摇 Teufel R, Kung J W, Kockelkorn D, et al. 3 鄄 hydroxypropionyl 鄄 coenzyme A dehydratase and acryloyl 鄄 coenzyme A reductase, enzymes of the autotrophic 3 鄄 hydroxypropionate / 4 鄄 hydroxybutyrate cycle in the Sul 鄄 folobales[ J]. Journal of Bacteriology, 2009, 191 (14): [8] 摇 Leal N A, Havemann G D, Bobik T A. PduP is a coen 鄄图 5 摇甘油剩余及主要代谢产物产量 zyme 鄄 a 鄄 acylating propionaldehyde dehydrogenase associat 鄄 Fig. 5 摇 Glycerol residue and major metabolite production ed with the polyhedral bodies involved in B 12 鄄 dependent 的重组菌较晚进入平稳期, 生物量提高了 24 郾 68%, 1, 2 鄄 propanediol degradation by Salmonella enterica sero 鄄与野生菌基本持平表明 PduP 的过表达不会对宿 var Typhimurium LT2 [ J ]. Archives of Microbiology, 主菌生长造成负荷 2003, 180(5): (3) 发酵后期重组菌 1,3 鄄丙二醇和 2,3 鄄丁二醇产量分别达到 16 郾 58 g / L 和 15 郾 68 g / L, 均超过空质粒对照菌, 甘油转化率分别比空质粒对照菌和野生 [9] 摇 Maervoet V E T, De Maeseneire S L, Soetaert W K, et al. Unraveling the dha cluster in Citrobacter werkmanii: comparative genomic analysis of bacterial 1, 3 鄄 propane 鄄 diol biosynthesis clusters[ J]. Bioprocess and Biosystems 菌提高了 40 郾 62% 和 34 郾 02%, 表明在 dha 调节子作 Engineering, 2014, 37(4): 用下, 甘油氧化还原途径的代谢流量得到了重排 [10] Sun J, van den Heuvel J, Soucaille P, et al. Comparative genomic analysis of dha regulon and related genes for an 鄄参考文献 : aerobic glycerol metabolism in bacteria [ J]. Biotechnology [1] 摇 Wang Q, Yang P, Liu C, et al. Biosynthesis of poly (3 鄄 hydroxypropionate) from glycerol by recombinant Esche 鄄 richia coli[ J]. Bioresource Technology, 2013, 131: Progress, 2003, 19(2): [11] Dobson R, Gray V, Rumbold K. Microbial utilization of crude glycerol for the production of value 鄄 added products 551. [ J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,

5 第 3 期摇摇摇摇摇摇范如婷等 : 辅酶 A 依赖的丙醛脱氢酶基因的克隆表达及其对宿主菌生长的影响 , 39(2): [12] Ashok S, Raj S M, Ko Y, et al. Effect of puuc overex 鄄 pression and nitrate addition on glycerol metabolism and anaerobic 3 鄄 hydroxypropionic acid production in recombi 鄄 nant Klebsiella pneumoniae 驻 glpk 驻 dhat [ J]. Metabolic Engineering, 2013, 15: [13] Kumar V, Sankaranarayanan M, Jae K, et al. Co 鄄 pro 鄄 duction of 3 鄄 hydroxypropionic acid and 1, 3 鄄 propanediol from glycerol using resting cells of recombinant Klebsiella pneumoniae J2B strain overexpressing aldehyde dehydro 鄄 genase [ J ]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 96(2): Cloning and expression of CoA 鄄 dependent propionaldehyde dehydrogenase in Klebsiella pneumoniae and its influences on cell growth FAN RuTing 摇 ZHAO Peng 摇 TIAN PingFang * ( College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing , China) Abstract: CoA 鄄 dependent propionaldehyde dehydrogenase (PduP) is a key enzyme in glycerol 鄄 based biosynthesis of poly 鄄 3 鄄 hydroxypropionic acid. In this study, the pdup gene from Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2 was amplified by the polymerase chain reaction (PCR) and cloned into Klebsiella pneumoniae, resulting in a recom 鄄 binant strain named K. p(pet 鄄 pk 鄄 pdup). Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS 鄄 PAGE) analysis showed a high level of PduP expression. In contrast to the control strain K. p(pet 鄄 pk) which harbored an empty vector pet 鄄 pk, the strain K. p(pet 鄄 pk 鄄 pdup) entered a stationary phase later and the biomass increased by 24 郾 68% after fermentation for 24 h. Moreover, this recombinant strain produced 1,3 鄄 propanediol at a concentration of 16 郾 58 g / L and 2,3 鄄 butanediol at a concentration of 15 郾 68 g / L. Compared with K. p(pet 鄄 pk) and wild type, the total glycerol conversion rate of K. p ( pet 鄄 pk 鄄 pdup) increased by 40 郾 62% and 34 郾 02%, respectively. Overall these results indicate that the PduP overexpression reallocated the metabolic flux and thus stimulated cell growth. Key words: propionaldehyde dehydrogenase; Salmonella enterica serovar Typhimurium; Klebsiella pneumoniae; bi 鄄 omass; glycerol

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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌