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储叶
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1 第 29 卷第 6 期 2014 年 12 月天津科技大学学报 Journal of Tianjin University of Science & Technology Vol. 29 No. 6 Dec DOI: /j.issn 一种与胆固醇 7,8 位脱氢相关蛋白的表达研究汤睿, 申雁冰, 格日勒, 牛丹丹, 王敏 ( 工业发酵微生物教育部重点实验室, 天津市工业微生物重点实验室, 天津科技大学生物工程学院, 天津 ) 摘要 : 家蚕 (Bombyx mori) 的 Nvd-Bm 蛋白是一种与胆固醇 7,8 脱氢酶相关的蛋白. 根据 NCBI 中报道的家蚕中的胆固醇 7,8 脱氢酶基因序列 (GenBank 登录号 :AB ), 采用密码子优化及基因克隆技术, 扩增获得胆固醇 7, 8 脱氢酶目标基因 nvd-bm, 并构建了重组穿梭载体 ppic9k-nvd-bm, 通过电转化, 成功构建了含有 ppic9k-nvd-bm 的毕赤酵母 (Pichia pastoris)gs115 异源真核表达工程菌株. 经 SDS-PAGE 蛋白电泳分析表明, 含有 ppic9k-nvd-bm 的毕赤酵母 GS115 表达菌株能够成功表达目标蛋白, 为胆固醇的 7,8 脱氢产物即 7 脱氢胆固醇的生物转化奠定了基础. 关键词 : 家蚕 ; 胆固醇 7,8 脱氢酶 ; 密码子优化 ; 毕赤酵母 ; 诱导表达中图分类号 :Q812 文献标志码 :A 文章编号 : (2014) Expression of the Protein Related to Cholesterol 7,8-Dehydrogenation TANG Rui,SHEN Yanbing,GE Rile,NIU Dandan,WANG Min (Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology,College of Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin ,China) Abstract:Bombyx mori Nvd-Bm protein is associated with cholesterol 7,8-dehydrogenase. Based on DNA sequence encoded cholesterol 7,8-dehydrogenase reported on the NCBI(GenBank:AB ),cholesterol 7,8-dehydrogenase gene was cloned from Bombyx mori. Through codon optimization,cholesterol 7,8-dehydrogenase gene was obtained and the optimized gene was cloned into a yeast expression vector. Heterologously expressed target gene in P. pastoris GS115 resulted in the creation of engineered P. pastoris GS115 / ppic9k-nvd-bm strains. Expression of the target protein in the engineered P. pastoris GS115 / ppic9k-nvd-bm strains was demonstrated by SDS-PAGE. This study provided a foundation for the biological synthesis of 7-dehydrocholesterol. Key words:bombyx mori;cholesterol 7,8-dehydrogenase;codon optimization;pichia pastoris;induced expression 维生素 D 是一种作用于钙磷代谢的维生素 [1], 它能够维持人及其他动物体内的血磷和血钙的平衡, 促进骨质钙化以及肠道对钙磷等元素的吸收 [2]. 其中最重要的是维生素 D 2 ( 麦角骨化醇 ) 和维生素 D 3 ( 胆钙化醇 ). 维生素 D 3 在维生素 D 生物代谢中活性最高, 主要由高级动物的表皮和真皮内含有的 7 脱氢胆固醇经紫外线 ( 波长 265~228,nm) 照射转变而成, 也可来自如肝类鱼肝油等动物组织中 [3 5]. 而 7 脱氢胆醇主要由胆固醇经胆固醇 7,8 脱氢酶作用转变生成, 胆固醇 7,8 脱氢酶是合成维生素 D 3 的重要生物催化剂. 胆固醇 7,8 脱氢酶主要参与蜕皮动物类固醇生物合成过程第一步重要反应, 其主要功能是催化胆固醇转化为 7 脱氢胆固醇. 目前胆固醇 7,8 脱氢酶在分子水平上的作用机制尚不清楚 [6] [7].Yoshiyama 等发现, 家蚕前胸腺中的 neverland 基因 (nvd-bm) 与 7, 8 脱氢酶相关. 通过 RNA 干扰和基因敲除技术获得的 nvd-bm 缺失家蚕幼虫, 其体内蜕皮激素的产生量明显降低而影响其生长, 这一干扰可以通过补充 7 [8] [9] 脱氢胆固醇解除. 夏小斌等及 Capyk 等在秀丽隐收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家高技术研究发展计划 (863 计划 ) 资助项目 (2011AA02A211) 作者简介 : 汤睿 (1989 ), 女, 河北人, 硕士研究生 ; 通信作者 : 王敏, 教授,minw@tust.edu.cn.

2 28 天津科技大学学报第 29 卷第 6 期杆线虫 (Caenorhabditis elegans) 中发现了功能类似的基因 daf-36(genbank 登录号 :NM_ ), 并证明该酶属于 Rieske 非血红素铁加氧酶, 包含一段 Rieske[2Fe-2S] 区域以及一段非亚铁血红素关联区, 可催化胆固醇转化为 7 脱氢胆固醇, 表明 nvd-bm 基因具有编码胆固醇 7,8 脱氢酶的作用. [10] 目前, 黄时海等实现了基因 nvd-dm 在大肠杆菌中的少量表达, 表达效率偏低. 本研究主要克隆了来自家蚕的 nvd-bm 基因 (GenBank 登录号 : AB ), 采用密码子优化技术, 构建了 nvd-bm 基因的真核表达工程菌并实现了重组 Nvd-Bm 蛋白的高效表达. 研究结果为进一步进行其与伴侣蛋白的共表达研究奠定了基础. 1 材料与方法 1.1 菌株与质粒大肠杆菌 (Escherichia coli) DH5α 毕赤酵母 (Pichia pastoris)gs115 及 ppic9k 载体均由本实验室保存 ; 优化后的 nvd-bm 基因及 5 AOX1 / 3 AOX1 引物, 由金唯智公司合成. 引物 5 AOX1 的序列为 :5'-GACTGGTTCCAAT TGACAAGC-3' ; 引物 3 AOX1 的序列为 :5'- GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'. 1.2 培养基酶及试剂毕赤酵母 GS115 培养基的配制方法参见 Invitrogen 公司毕赤酵母操作手册 ; 大肠杆菌 DH5α 的培养基采用 LB 培养基 [11]. EcoRⅠ 限制性内切酶 NotⅠ 限制性内切酶 DNA Marker 低相对分子质量蛋白 Marker, 大连宝生物公司 ;T4,DNA 连接酶,Promega 公司 ;Taq PCR Master Mix, 博迈德公司 ; 酵母提取物蛋白胨, Oxiod 公司 ; 胶回收试剂盒, 北京天恩泽基因公司 ; 其他化学试剂均购自天津市北方天医化学试剂厂. 1.3 胆固醇 7,8 脱氢酶基因的获取通过查阅文献及 NCBI 中比对, 获得 nvd-bm 基因全序列 (GenBank 登录号 :AB ); 并利用 Vector NTI suite 7.0 等分子生物学软件, 在不改变其蛋白质氨基酸序列的前提下, 综合考虑密码子使用频率 GC 含量的调整不稳定序列的删除 mrna 二级结构等影响因素, 按照巴斯德毕赤酵母的偏爱性对该序列进行密码子改造优化 [12]. 并于目标基因 nvd-bm 两侧引入 EcoRⅠ 和 NotⅠ 酶切位点后, 委托金唯智公司进行全基因合成. 1.4 毕赤酵母重组表达菌株的构建用 EcoRⅠ 和 NotⅠ 将由公司合成并连有目标基因的重组克隆载体 puc57-nvd-bm 及毕赤酵母表达载体 ppic9k 进行双酶切, 回收 1.3,kbp 的片段及 ppic9k 骨架, 回收产物用 T4 DNA 连接酶进行连接转化大肠杆菌 DH5α, 筛选得到重组表达载体 ppic9k-nvd-bm, 对重组表达载体进行 PCR 鉴定及双酶切鉴定, 并将鉴定正确的转化子进行测序验证. 将筛选得到的重组表达载体 ppic9k-nvd-bm 经 BglⅡ 线性化, 电转入毕赤酵母 GS115 感受态细胞中, 电击条件 :1.5,kV 25,μF 200,Ω. 转化菌液分别涂布于含 4,g/L G418 的 YPD 平板上,30, 孵育至抗性克隆出现. 挑取抗性克隆, 通过玻璃珠和酚氯仿抽提酵母基因组, 以基因组为模板, 利用 5 AOX1/3 AOX1 引物进行 PCR 筛选成功整合的阳性克隆, 挑取阳性克隆菌株于 YPD 培养基中,30, 培养 20,h 后, 保存甘油管. 1.5 重组质粒在毕赤酵母中的诱导表达及 SDS- PAGE 分析将筛选出的阳性克隆接种于 100,mL BMGY 中, 30, 250,r/min 生长至 A 600 3, 离心收集菌体, 转接于 BMMY 培养基中 30, 培养, 以最终质量分数为 0.5% 的甲醇溶液进行诱导表达.5,d 后离心经甲醇诱导后的培养液上清液转移至干净的收集管中, 沉淀用裂解缓冲液重悬后通过酸洗玻璃珠涡旋振荡法进行细胞破碎. 分别取菌体培养液上清液及细胞破碎上清液, 通过 SDS-PAGE 分析蛋白表达情况. 2 结果与分析 2.1 胆固醇脱氢酶基因 nvd-bm 的获取及分析来源于家蚕的胆固醇 7,8 脱氢酶基因 nvd- Bm(GenBank 登录号 :AB ) 全长为 1,362,bp, GC 含量为 53.3%. 依据表达宿主毕赤酵母的密码子偏爱性, 进行该基因的密码子优化, 改变了其中的 335 个碱基对, 其 GC 含量由 53.3% 降低到 52.9%, 优化后的基因序列见图 1. NotⅠ 和 EcoRⅠ 双酶切的质粒 puc57-nvd-bm 及 ppic9k 的电泳图如图 2 所示. 从图 2 可以看出 : 泳道 1 的 1.3,kbp 片段泳道 2 的 9.3,kbp 片段, 分别与目标基因 nvd-bm 及 ppic9k 预期结果相符合, 表明已成功获得目标基因片段.

2014 年 12 月汤睿, 等 : 一种与胆固醇 7, 8 位脱氢相关蛋白的表达研究 29 图 1 家蚕胆固醇 7,8 脱氢酶基因 nvd-bm 依据毕赤酵母偏爱性优化后的基因序列 Fig.

puc57-nvd-bm 双酶切产物 ;2. ppic9k 双酶切产物图 2 puc57-nvd-bm 和 ppic9k 的 NotⅠ/EcoRⅠ 双酶切鉴定 Fig. 2 NotⅠ/EcoRⅠrestriction analysis of puc57-nvd-bm and ppic9k 2.

取图 3 中的 ppic9k-nvd-bm 重组质粒进行双酶切验证, 结果如图 4 所示. 图 4 中均出现了 1.3,kbp 片段, 进一步表明目标基因 nvd-bm 已成功插入毕赤酵母表达质粒 ppic9k 中. 选取图 4 中验证正确的菌株交由公司进行测序, 测序结果与目标基因完全一致, 表明重组表达载体 ppic9k-nvd-bm 构建成功.

3 2014 年 12 月汤睿, 等 : 一种与胆固醇 7, 8 位脱氢相关蛋白的表达研究 29 图 1 家蚕胆固醇 7,8 脱氢酶基因 nvd-bm 依据毕赤酵母偏爱性优化后的基因序列 Fig. 1 Optimized gene nvd-bm of Bombyx mori cholesterol 7,8-dehydrogenase based on Pichia pastoris preference M1. Wide Range DNA Marker(100~6,000,bp);M2. 1,kbp DNA Marker;1. puc57-nvd-bm 双酶切产物 ;2. ppic9k 双酶切产物图 2 puc57-nvd-bm 和 ppic9k 的 NotⅠ/EcoRⅠ 双酶切鉴定 Fig. 2 NotⅠ/EcoRⅠrestriction analysis of puc57-nvd-bm and ppic9k 2.2 表达载体的构建重组质粒 ppic9k-nvd-bm 的 PCR 验证电泳图如图 3 所示. 由图 3 可以看出 : 图中的 1.8,kbp 片段, 与 ppic9k-nvd-bm 菌液 PCR 预期结果相符合, 表明目标基因 nvd-bm 已成功插入毕赤酵母表达质粒 ppic9k 中. 取图 3 中的 ppic9k-nvd-bm 重组质粒进行双酶切验证, 结果如图 4 所示. 图 4 中均出现了 1.3,kbp 片段, 进一步表明目标基因 nvd-bm 已成功插入毕赤酵母表达质粒 ppic9k 中. 选取图 4 中验证正确的菌株交由公司进行测序, 测序结果与目标基因完全一致, 表明重组表达载体 ppic9k-nvd-bm 构建成功. M. Wide Range DNA Marker(100~6,000,bp); 1 3. ppic9k-nvd-bm PCR 产物 ;4. 对照图 3 重组质粒 ppic9k-nvd-bm 的 PCR 分析 Fig. 3 PCR analysis of the recombined plasmid ppic9knvd-bm M. 1 kbp DNA Marker;1 3. ppic9k-nvd-bm 双酶切产物图 4 重组质粒 ppic9k-nvd-bm 的 NotⅠ/EcoRⅠ 双酶切鉴定 Fig. 4 NotⅠ/EcoRⅠrestriction analysis of the recombined plasmid ppic9k-nvd-bm

30 天津科技大学学报第 29 卷第 6 期 2.3 转化毕赤酵母重组子的筛选和鉴定含有 ppic9k-nvd-bm 的毕赤酵母工程菌进行基因组 PCR 验证, 结果如图 5 所示. 图 5 出现的 1.8,kbp 片段, 与重组毕赤酵母 GS115 基因组 PCR 预期结果相符, 表明目标基因 nvd-bm 均已成功整合至毕赤酵母 GS115 基因组中.

4 10 4, 与预期相对分子质量一致 ; 另外, 由于在毕赤酵母中表达的蛋白会受到不同程度的糖基化作用, 因而电泳中观测到的蛋白相对分子质量会比目标蛋白出现不同程度的偏大. 进一步经蛋白质谱鉴定, 证明其蛋白一级序列与目标蛋白相符, 表明目标蛋白得到表达, 表达量较高. 3 讨论 M. Wide Range DNA Marker(100~6,000,bp);1 3.

4 30 天津科技大学学报第 29 卷第 6 期 2.3 转化毕赤酵母重组子的筛选和鉴定含有 ppic9k-nvd-bm 的毕赤酵母工程菌进行基因组 PCR 验证, 结果如图 5 所示. 图 5 出现的 1.8,kbp 片段, 与重组毕赤酵母 GS115 基因组 PCR 预期结果相符, 表明目标基因 nvd-bm 均已成功整合至毕赤酵母 GS115 基因组中的位置存在明显的特异性条带, 由于转录翻译起始于载体自身的起始密码子, 翻译时会同时将载体上的起始密码子至目标基因的起始密码子间的一段序列一并翻译出, 而该段氨基酸序列相对分子质量约为 , 故表达的蛋白相对分子质量会比实际蛋白相对分子质量偏大, 约为 , 与预期相对分子质量一致 ; 另外, 由于在毕赤酵母中表达的蛋白会受到不同程度的糖基化作用, 因而电泳中观测到的蛋白相对分子质量会比目标蛋白出现不同程度的偏大. 进一步经蛋白质谱鉴定, 证明其蛋白一级序列与目标蛋白相符, 表明目标蛋白得到表达, 表达量较高. 3 讨论 M. Wide Range DNA Marker(100~6,000,bp);1 3. 含 ppic9k-nvd- Bm 基因组 PCR 产物 ;4. 毕赤酵母 GS115 基因组对照图 5 含 ppic9k-nvd-bm 的毕赤酵母 GS115 基因组 PCR 分析 Fig. 5 Genomic PCR analysis of recombined P.,pastoris GS115,containing ppic9k-nvd-bm 2.4 胆固醇 7, 8 脱氢酶的表达已构建的含有 ppic9k-nvd-bm 的毕赤酵母工程菌经甲醇诱导后, 分别收集菌体培养液上清液及沉淀. 沉淀经细胞破碎后, 将菌体培养液上清液及细胞破碎上清分别经蛋白电泳上样缓冲液重悬煮沸进行 SDS-PAGE 分析. 结果如图 6 所示. M. 低相对分子质量蛋白 MarkerⅡ;1. ppic9k-nvd-bm 菌体培养上清液 ;2. ppic9k-nvd-bm 细胞破碎上清液 ;3. ppic9k 菌体培养上清液 ; 4. ppic9k 细胞破碎上清液图 6 重组胆固醇 7,8 脱氢酶 Nvd-Bm 表达的 SDS- PAGE 凝胶分析 Fig. 6 Analysis of recombined cholesterol 7,8-dehydrogenase Nvd-Bm using SDS-PAGE 由图 6 可知 : 第 2 泳道, 即含有 ppic9k-nvd-bm 的毕赤酵母工程菌培养液在相对分子质量约为 6.4 化学法合成 7 脱氢胆固醇的生产工艺一般需要 4 步合成反应, 转化率为 62% 左右, 反应途径长副产物多反应条件不易控制 [13]. 生物转化法具体高效绿色的特性, 使其成为许多化学药物和医药中间体化 [14] 学合成工艺的替代技术. 目前虽已有关于基因 nvd-dm 在大肠杆菌中表达的相关报道, 但由于其未依据大肠杆菌的偏爱性进行密码子优化, 故表达效率偏低. 另外, 由于目标基因来自于昆虫细胞, 其转录翻译更适合在真核表达体系中进行. 本研究对获得的胆固醇 7,8 脱氢酶基因 nvd-bm(genbank 登录号 :AB ) 于毕赤酵母中进行了外源表达, 并依据毕赤酵母偏爱性进行了密 [11] 码子优化, 优化后的基因与黄时海等于大肠杆菌中进行的外源表达相比, 有效地提高了胆固醇 7,8 脱氢酶 Nvd-Bm 的表达效率. 本研究还构建了重组质粒 ppic9k-nvd-bm, 并通过电转化方法, 构建了含有 ppic9k-nvd-bm 的毕赤酵母 GS115 工程菌,SDS- PAGE 蛋白电泳分析表明, 目标蛋白 Nvd-Bm 均已成功表达, 但均主要存在于胞内. 下一步工作可通过改造 ppic9k-nvd-bm 重组质粒信号肽序列引导目标蛋白高效胞外分泌, 进一步提高其分泌表达量. 此外, 7,8 脱氢酶的基因组成目前尚不清晰, 仅获得其编码基因表达蛋白, 往往难以表现出酶活性. 因此本课题组将进一步研究其与伴侣蛋白的共表达, 为胆固醇 7,8 脱氢酶的活性检测奠定基础. 参考文献 : [1] 王国海, 梁亚丽, 杜全宇. 儿童佝偻病的防治研究进展

5 2014 年 12 月汤睿, 等 : 一种与胆固醇 7, 8 位脱氢相关蛋白的表达研究 31 [J]. 现代临床医学,2010,36(1):3 4. [2] Jones G,Strugnell S A,De Luca H F. Current understanding of the molecular actions of vitamin D[J]. Physiological Reviews,1998,78(4): [3] 杨蓉, 包玉倩. 维生素 D 与肥胖的研究进展 [J]. 上海医学,2011,34(11): [4] 杨德智, 魏时来, 李发弟. 维生素 D 生理功效研究进展 [J]. 广东饲料,2012,21(7): [5] Holick M F,Chen T C,Lu Z,et al. Vitamin D and skin physiology:a D-lightful story[j]. Journal of Bone and Mineral Research,2007,22(S2): [6] Yamanaka N,Hua Y J,Mizoguchi A,et al. Identification of a novel prothoracicostatic hormone and its receptor in the silkworm Bombyx mori[j]. The Journal of Biological Chemistry,2005,280: [7] Yoshiyama T,Namiki T,Mita K,et al. Neverland is an evolutionally conserved Rieske-domain protein that is essential for ecdysone synthesis and insect growth[j]. Development,2006,133(13): [8] 夏小斌, 吴孔阳, 李湘萍, 等. 生物法合成 7 脱氢胆固醇研究进展 [J]. 食品工业科技,2009,30(11): [9] Capyk J K,D'Angelo I,Strynadka N C,et al. Characterization of 3-ketosteroid 9α-hydroxylase,a Rieske oxygenase in the cholesterol degradation pathway of Mycobacterium tuberculosis[j]. The Journal of Biological Chemistry,2009,284: [10] 黄时海, 李湘萍, 吴孔阳, 等. 7,8 脱氢酶基因的克隆与表达 : 中国, [P] [11] 萨姆布鲁克 J, 拉塞尔 D W. 分子克隆实验指南 [M]. 黄培堂, 译. 3 版. 北京 : 科学出版社,2002: [12] 赵翔, 霍克克, 李育阳. 毕赤酵母的密码子用法分析 [J]. 生物工程学报,2000,16(3): [13] 查娟, 高启楠, 张丹丹, 等. 7 脱氢胆固醇的合成工艺研究 [J]. 绍兴文理学院学报,2009,29(10): [14] Yoshiyama-Yanagawa T,Enya S,Shimada-Niwa Y,et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme[j]. The Journal of Biological Chemistry,2011,286: 责任编辑 : 周建军

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