乳腺癌是国内外最常见的恶性肿瘤之一, 发病率位居女性恶性肿瘤首位, 目前每年超过一百万新发病例 [1], 是世界范围内造成妇女发病和死亡的重要原因 在我国乳腺癌发病率已经超过卵巢癌而跃居中国女性恶性肿瘤发病榜首, 发病率达到 例 /10 万妇女 [2] Fas 基因属于肿瘤坏死因子受体超

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1 Fas 基因启动子区多态性与乳腺癌发病风险的相关性研究 周丰周光华陈璇 湖南师范大学附属第二医院肿瘤科长沙 摘要 : 目的 : 探讨 Fas 基因启动子区单核苷酸多态性与乳腺癌遗传易感性的 关系 方法 : 采用病例对照研究, 利用 PCR-RFLP 和测序的方法对 214 例乳腺癌 患者与 204 例健康人对照的 Fas-670A/G 位点进行基因分型 并对检测结果进行 χ 2 检验 通过实时 ELISA 检测 Fas 基因的表达水平 结果 :Fas-670A/G 和乳腺癌 群体的基因型分布与对照组有显著差异 ;GG AA AG 基因型个体之间 sfas 基因 表达水平有显著差异,GG 型个体 Fas 基因的表达水平显著高于 AA(P=0.013) AG(P=0.001) 基因型个体 结论 : 乳腺癌组中 Fas 基因的表达显著增加,Fas- 670A/G 多态性位点通过调节 Fas 基因的表达与女性患乳腺癌发病风险显著相关 且 GG 基因型增强了 Fas 基因的表达, 增加了发病风险 关键词 : 乳腺癌 ;Fas; 基因多态性 ; 基因表达 Polymorphism in Fas promoter region associated with risk to breast cancer ABSTRACT Objective: To evaluate the association between polymorphisms in Fas promoter region and susceptibility to breast cancer. Methods: In the case-control study, we genotyped Fas-670A/G and Fas-1377A/G by PCR-RFLP in 214 patients with breast cancer and 204 healthy controls. Results were analyzed using Chi-square test. Fas gene expression wwas detected by q-rt-pcr in breast cancer. Results: The distribution of Fas-670A/G genotype and allele type was significant difference between the patients and healthy controls (χ 2 =3.54, P=0.17; χ 2 =2.29, P=0.13). Subjects with GG genotype significantly increased the risk of breast cancer compared with the individuals carrying AA and AG genotype. Fas expression level in subjects with breast cancer was significantly increased compared with the healthy control. And the Fas expression in subjects with GG genotype was significantly higher than that in subjects with AA (P=0.013) GG (P=0.001) genotypes. Conclusion: Fas expression significantly increased in breast cancer. Fas was regulated by Fas-670A/G and significantly associated with susceptibility to breast cancer. GG genotype enhanced Fas expression and increased the risk to breast cancer. Key words:breast cancer; Fas; SNP; Gene expression 中图分类号 :R3; R73; Q7

2 乳腺癌是国内外最常见的恶性肿瘤之一, 发病率位居女性恶性肿瘤首位, 目前每年超过一百万新发病例 [1], 是世界范围内造成妇女发病和死亡的重要原因 在我国乳腺癌发病率已经超过卵巢癌而跃居中国女性恶性肿瘤发病榜首, 发病率达到 例 /10 万妇女 [2] Fas 基因属于肿瘤坏死因子受体超家族成员 [3], 是调控细胞凋亡的关键因子之一, 其调节异常与多种肿瘤的发生 发展关系密切 [4] 位于 Fas 基因启动子区的 Fas-1377A/G,-670A/G 多态性位点影响启动子活性, 可导致细胞凋亡信号失调, 然而不同地区针对 Fas 基因启动子多态性与乳腺癌的发病风险的相关性研究结果并不一致 [5-7] 而且在乳腺癌中关于 Fas 基因启动子多态性影响乳腺癌发病风险的机制尚未见报道 本研究旨在通过 PCR-RFLP 探讨 Fas-1377A/G,-670A/G 基因多态性与乳腺癌发病风险的相关性, 并利用 ELISA 技术对其机制进行初步研究 1. 材料与方法 1.1 研究对象本研究共有 204 例健康对照 (2013 年 年到湘雅医院体检的健康女性 ), 年龄 32~61 岁 ;214 例原发乳腺癌患者 ( 年到湘雅医院治疗的乳腺癌患者 ) 术后均经病理证实, 其中小叶原位癌 23 例 导管内癌 67 例 粘液腺癌 38 例 浸润性导管癌 86 例 ;Ⅰ 期 61 例 Ⅱ 期 94 例 Ⅲ 期 46 例 Ⅳ 期 13 例 ; 年龄 岁 所有研究对象均为湖南地区汉族女性, 所有乳腺癌患者均为散发病例 乳腺癌患者纳入标准 : 术后能进行病理诊断者 ; 术前未经放 化疗 ; 同意参样本采集 正常对照纳入标准 : 经体检无肿瘤 心脑血管疾病 无其他家族病史 每个研究对象采集 5mL 外周静脉血用于基因组 DNA 提取和 ELISA 操作 1.2 PCR-RFLP 基因分型及测序验证取外周血 2mL, 按照天根生物科技公司的血液 DNA 提取试剂盒说明进行基因 组 DNA 提取, 基因组 DNA 保存于 -20 o C 备用 ; 扩增 Fas-1377A/G 和 -670A/G 片段的 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成 PCR 反应体系 25 μl, 含 100 ng 模板 DNA,10 μmol/l 上 下游引物各 1 μl,2 Taq PCR MasterMix 12.5 μl( 天根生化科技北京有限公司 ), 加 ddh 2 O 至 25 μl 反应条件:95 预变性 3 min,94 变性 30 s, 退火温度为 64,72 延伸 30 s, 共 30 个循环后,72 最终延伸 10

3 min 20 μlpcr 产物用限制性核酸内切酶 Mva I 和 BstUⅠ( 北京纽英伦生物技术有限公司 ) 于 37 孵育 10 h, 酶切产物于 3.0% 琼脂糖凝胶电泳 (90 V,35 min) 后用凝胶成像系 (Bio- Rad) 统观察酶切结果 随机抽取 100 个样本进行 sanger 测序验证酶切分型的结果, 结果完全一致 1.3 ELISA 检测血清中 sfas 的分泌水平取外周血 3 ml, 分离血清保存于 -80 冰箱中备用, 利用 ELISA 试剂盒 (France Diaclone) 采用夹心法检测血液中 sfas 的分泌水平 ( 按照说明书进行操作 ) 1.4 统计学分析以 χ 2 检验比较病例组和健康对照组之间 Fas 各基因型分布的差异 以独立性 t 检验比较病例组和健康对照组之间 sfas 分泌水平的差异 所有的统计检验均为双侧概率检验, 以 P<0.05 作为具有统计学显著性差异的标准 所用统计软件为 spss 结果 2.1 基因多态性与乳腺癌发生的关系 PCR-RFLP 检测 Fas 基因启动子区,Fas-1377A/G,-670A/G 多态性位点 ; 并通过 sanger 测序验证, 测序结果和基因分型结果完全一致 结果显示 -670A/G 与乳腺癌的发病风险具有显著相关性 (P<0.05)( 见表 1), 在不同亚型中分布无显著差异 表 1 Fas -670A/G -1377A/G 基因型与乳腺癌发病风险之间的关系 位点 -670A/G -1377A/G 基因等位正常乳腺正常对照乳腺癌 P 值型基因对照癌 P 值 AA 52(25.5) 49(22.9) A AG 135(66.2) 128(59.8) * G GG 17(8.3) 37(17.3) 60( (22.0 AA A ) ) ( (57.5 AG G ) )

4 GG 31(15.2 ) 44(20.5 ) 注 :* 表示正常对照组和乳腺癌组之间基因型分布有显著差异 2.2sFas 分泌水平与乳腺癌之间的关系经 ELISA 检测, 乳腺癌患者 sfas 的分泌水平显著高于健康对照, 按照 - 670A/G 分组进行统计分析,GG 基因型个体的 sfas 分泌水平显著高于 AA AG 基因型个体 (P<0.05), 见图 1 图 1 不同基因型乳腺癌患者血清中 sfas 的分泌水平注 :* 表示正 GG 基因型乳腺癌患者 sfas 分泌水平显著高于 AA AG 基因型患者 3. 讨论 Fas 及其配体 FasL 结合后可以激活凋亡信号级联反应, 导致细胞凋亡 研究发现 Fas/FasL 系统的功能紊乱是肿瘤细胞逃避机体免疫防御反应的主要机制之一 Fas 基因启动子区 -1377A/G,-670A/G 位点的多态性可影响 Fas 基因的表达, 导致细胞凋亡信号异常, 在肿瘤的发生 发展中起着重要作用 本实验发现 Fas-670A/G 与乳腺癌的发病发现具有显著相关性 (P<0.05),GG 基因型使得乳腺癌的发病风险增加 sfas 作为 Fas 基因的一个重要的剪接体, 由于缺乏跨膜蛋白可与 Fas 竞争结合 FasL 起到抑制凋亡的作用 这种对凋亡的竞争性抑制作用是肿瘤细胞免疫逃逸的重要途径, 在肿瘤的发生和发展起着重要作用 [8-9] 本实验通过 ELISA 检测 sfas 的分泌水平发现, 病例组 sfas 的分泌水平显著高于健康对照组 结果与陈

5 清波 [10] 黄国民 [11] 的研究结果一致 在根据 -670A/G 位点按照基因型分组 sfas 分 泌水平分析中发现 GG 基因型乳腺癌患者 sfas 表达水平显著高于 AA AG 基因型个 体, 这可能是由于 G 等位基因导致 Fas 基因启动子区结合位点发生改变导致启动 子结合元件不同从而影响了 Fas 基因的表达 重要的是按照 -670A/G 分组进行 sfas 分泌水平的与 -670A/G 基因型与乳腺癌的发病风险的统计学结果一致, 这说 明 -670A/G 对 Fas 基因的调节作用可能是 -670A/G 与乳腺发病风险相关的主要机制 但是在其调节机制上尚需进一步进行深入研究 综上所述, 本研究证实凋亡相 关基因 Fas-670A/G 多态性位点通过调节 Fas 基因的表达与女性患乳腺癌发病风险 显著相关 本研究的结果将有助于预测乳腺癌发生风险, 提高乳腺癌的预防 早期诊断和治疗水平 致谢 : 非常感谢湘雅医院乳腺科和体检中心为本实验样本收集提供的方便, 某某为样品处理和论文的修改提供的帮助 参考文献 [1]. Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics. CA Cancer [J]. Clin, 2011, 61(2): [2]. Cao W, Wang X, Li J. Hereditary Breast Cancer in the Han Chinese Population [J].Epidemiol, 2013, 23(2): [3]. Muschen M, Warskulat U, Beckmann MW, et al. Defining CD95 as a tumor suppressor gene [J]. Mol Med, 2000, 78(6): [4]. Huang QR, Morris D, Manolios N et al. Identification and characterization of polymorphisms in the promoter region of the human Apo-1/FAS(CD95) gene[j]. Molecular Immunology, 1997, 34(8-9): [5]. 胡英, 黄欣, 王秀娟等. Fas-670 基因多态与青海地区乳腺癌风险的关系 [J]. 广东医学, 2014, 3(13): [6]. 张柏林, 孙瞳, 刘海洁等. FAS 和 FASL 基因多态性增加乳腺癌发病风险 [J]. 中国医药导刊, 2009, 11(12): [7]. 许晔琼, 何帮顺, 邓齐文等. Fas/FasL 基因多态性与乳腺癌发生的相关性 [J]. 临床检验杂志, 2013, 31(12): [8]. 杨文武, 刘元姣, 张蔚等. Fas/FasL 在肿瘤免疫逃逸中作用的研究进展 [J]. 实用癌症杂志, 2002, 17(6): [9]. N ato li G, Ianni A, Co stanzo A, et al. Resistance to F as mediated apoptosis in human hepatoma cells[j]. Oncogene, 1995, 11 (6): [10]. 陈云波, 王心明, 姜瑛等. 可溶性 Fas(sFas) 对乳腺癌发生发展中的影响 [J]. 中国实验诊断学, 2006, 10(7): [11]. 黄国民, 佟芷宜, 乔士兴等. 乳腺癌患者血清可溶性 Fas 水平变化及其意义 [J]. 中国实验诊断学, 2007, 11(1):57-59.

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