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铜劳娄
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1 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2013,29(5): [ 文章编号 ] (2013) NOD8 对 LPS 诱导巨噬细胞释放 NO TNF α 和 IL 1β 的影响田莉, 郑媛媛, 胡巢凤, 颜亮 ( 暨南大学医学院病理生理学系, 国家中医药管理局重点实验室, 广东广州 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨 NOD8 对脂多糖 (LPS) 诱导巨噬细胞释放一氧化氮 (NO) 肿瘤坏死因子 α(tnf α) 和白细胞介素 1β(IL 1β) 的影响方法 :pegfp C2 及 pegfp NOD8 重组质粒分别转染小鼠巨噬细胞 RAW264.7, 以 LPS 刺激 RAW264.7 细胞 h 后, 采用 Griesreagent 法测定观察细胞分泌的 NO 水平 ;ELISA 法检测 IL 1β 和 TNF α 的含量 ; 荧光法测定活化的 caspase 1 水平 ;Westernbloting 检测 NOD8 蛋白表达及 NF κbp65 亚基的核转位情况结果 :(1) 与转染 pegfp C2 空质粒组比较, 转染 pegfp NOD8 质粒组 NOD8 蛋白表达明显增加 (2) LPS 刺激 h 后,RAW264.7 细胞释放 NO IL 1β 及 TNF α 均明显增加 ; 而在 pegfp NOD8+LPS 组 RAW264.7 细胞,NO 于 12 24h 的释放显著降低,IL 1β 于 h 的释放也明显降低,TNF α 的释放则无明显变化 (3) 在 LPS 刺激 h 后,RAW264.7 细胞 caspase 1 活化水平均明显升高, 胞浆 NF κbp65 亚基表达明显减少, 表明 p65 核转位增加 ; 而 pegfp NOD8+LPS 组可显著抑制 caspase 1 的活化以及 NF κbp65 亚基的核转位, 差异有统计学意义结论 :NOD8 可抑制 LPS 诱导的巨噬细胞 NO 与 IL 1β 释放, 其作用机制可能与 NOD8 抑制 caspase 1 及 NF κb 的活化有关 [ 关键词 ] RAW264.7 细胞 ; 脂多糖类 ;NOD8 蛋白 ; 核因子 κb; 一氧化氮 ; 白细胞介素 1β [ 中图分类号 ] R [ 文献标志码 ] A doi: /j.isn EfectofNOD8onproductionofnitricoxide,IL 1βandTNF αinlps treatedmacrophages TIANLi,ZHENGYuan yuan,huchao feng,yanliang (DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryforStateAdministrationofTraditionalChineseMedicineofthePeople sre publicofchina,schoolofmedicine,jinanuniversity,guangzhou510632,china.e mail:thcf@jnu.edu.cn) [ABSTRACT] AIM:ToinvestigatetheefectofNOD8onlipopolysaccharide(LPS) inducedreleasesofnitric oxide(no),tumornecrosisfactorα(tnf α)andinterleukin 1β(IL 1β)inRAW264.7cels.METHODS:Theplas midsofpegfp C2andpEGFP NOD8weretransfectedintoRAW264.7celsrespectively.Thetransfectedandnon trans fectedcelswerestimulatedbylpsfor0,6,12and24h.noproductionwasevaluatedbygriesreagentasay,andthe levelsofil 1βandTNF αweremeasuredbyelisa.theproteinexpresionofnod8andthenucleartranslocationofnu clearfactorκb(nf κb)p65subunitweredetectedbywesternbloting.thelevelofactivatedcaspase 1wasdetermined byfluorimetricmethod.results:comparedwithpegfp C2group,theproteinexpresionofNOD8wassignificantlyel evatedinpegfp NOD8+LPSgroup.ThereleasesofNO,IL 1βandTNF αwereobviouslyincreasedafterraw264.7 celsweretreatedwithlpsfor6h,12hand24h,andwhilethesecretionofnowassignificantlyreducedinthecels transfectedwithpegfp NOD8andinducedbyLPSfor12hand24h,andthereleaseofIL 1βwasalsosignificantlyre ducedat6h,12hand24h.however,nosignificantdiferenceoftnf αreleasewasobservedbetweenpegfp C2+LPS groupandpegfp NOD8+LPSgroup.Theactivationofcaspase 1inRAW264.7celsstimulatedwithLPSfor6h,12h and24hwasmarkedlyincreased,andtheexpresionofnf κbp65subunitinthecytoplasmwassignificantlydecreased, [ 收稿日期 ] [ 修回日期 ] [ 基金项目 ] 广东省自然科学基金资助项目 (No.S ); 暨南大学 211 工程三期预研项目 ; 广东省高等学校自然科学重点研究项目 (No.05Z002) 通讯作者 Tel: ;E mail:thcf@jnu.edu.cn 并列第 1 作者

2 890 indicatingthatp65nucleartranslocationwasincreased.inaddition,theactivationofcaspase 1andthenucleartransloca tionofp65weresignificantlyinhibitedinpegfp NOD8+LPSgroup.CONCLUSION:NOD8suppresesthereleasesof LPS inducednoandil 1βinRAW264.7celsbyinhibitingtheactivationofcaspase 1andNF κb. [KEY WORDS] RAW264.7cels;Lipopolysaccharides;NOD8protein;Nuclearfactor kappab;nitricoxide; Interleukin 1β 哺乳动物的免疫系统是由固有免疫和适应性免疫组成, 两者之间通过相互影响相互作用, 共同高效率地消除机体感染的病原体微生物 [1] 其中, 固有免疫是机体抵御病原微生物感染的第一道防线, 可以识别病原微生物在漫长的进化过程中共同的高度保守的结构即病原体相关分子模式, 可以识别它们的受体为模式识别受体 [2] NOD 样受体 (NOD likereceptors,nlrs) 为胞浆内的模式识别受体各种炎症细胞尤其是巨噬细胞通过识别受体释放促炎介质, 导致炎症反应 [3] 脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) 刺激巨噬细胞产生的促炎因子在炎症反应中发挥重要作用白细胞介素 1β(interleukin 1β,IL 1β) 是介导炎症反应的一种主要促炎因子 ; 肿瘤坏死因子 α(tumornecrosisfactorα,tnf α) 是炎症反应过程中最早和初级内源性介质 ; 一氧化氮 (nitricox ide,no) 是一种生物信使分子, 其生成依赖于诱导型一氧化化氮合酶 (induciblenitricoxidesynthase, inos), 在抵抗入侵的细菌真菌等微生物及在炎症反应中起着十分重要的作用 [3 4] 众所周知, 促炎症介质的释放主要是由 NF κb 通路调控,NF κb 在调节炎症和免疫反应时发挥极重要的作用目前在人类已发现 20 多个 NLRs 家族成员, NLRs 家族成员的结构域主要有 3 个 : 中央的核苷酸结合区域 (nucleotide bindingdomain,nbd; 又称为 NOD 区域 ) C 末端富含亮氨酸的重复序列 (leucine richrepeats,lrrs) 及 N 末端的介导嗜同种蛋白 - 蛋白相互作用区域 caspase 募集区域 (caspasere cruitmentdomain,card) 或 pyrin 区域 (pyrindo main,pyd) [5] NOD8 与该家族的其它成员不同的是, 由 PYD 结构域和 NOD 结构域组成,C 末端缺乏作为配体识别区域的 LRRs [6 8] [7] Imamura 等构建 NOD8 及炎症相关因子重组质粒, 共转染 HEK293 细胞, 发现 NOD8 可抑制由 caspase 1 介导的 IL 1β 分泌以及凋亡相关斑点样蛋白 (apoptosis aso ciatedspeck likeproteincontainingacard,asc) 介导的 NF κb 的活化和细胞凋亡为进一步探讨 NOD8 在炎症反应中的作用, 本实验主要研究 NOD8 对 LPS 诱导巨噬细胞释放炎症因子的影响及可能机制材料和方法 1 材料质粒 pegfp C2 为本室保存 ;pegfp NOD8 真核表达质粒由本课题组构建小鼠巨噬细胞 RAW264.7 由南方医科大学惠赠 2 主要试剂细胞转染所用的阳离子聚合物 JetPRIME 为 Polyplus 产品 ;DMEM 细胞培养基 DPBS 为 Gibco 产品 ; 胎牛血清购自 HyClone; 细胞培养板为 Corning Costar 产品 ;BCA 蛋白定量试剂盒为上海申能博彩生物公司产品 ; 羊抗多克隆抗体购自 SantaCruz, 兔抗多克隆单体购自 CST, 马抗羊 IgG 抗体和羊抗兔 IgG 抗体购自鼎国生物公司 ; 小鼠 IL 1βELISA 试剂盒 (R&D); 小鼠 caspase 1 检测试剂盒 (Biovision); 硝酸纤维素膜 (Milipore); 滤纸 (Bio Rad); 考马斯蓝 R 250 Tween 20 牛血清白蛋白脱脂奶粉和 SDA PAGE 凝胶配制试剂盒均购自南京碧云天公司 ; 其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯 3 主要方法 3.1 细胞培养及重组质粒转染细胞 RAW264.7 细胞采用含 10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培养液, 加入及 U/L 青霉素和 100mg/L 链霉素, 在 37 5% CO 2 条件下进行细胞培养及传代 RAW264.7 细胞按 /L 分别接种于 24 孔板内, 待细胞生长至 60% 融合时进行转染将该 JetPRIME/DNA 复合物加入培养板, 上下轻摇混匀, 然后放置于 37 5% CO 2 培养箱培养 24h 后将培养板置于 OlympusBX 51 倒置荧光显微镜下, 用 488nm 波长紫外光激发, 发射光波长为 507nm, 观察绿色荧光蛋白的表达 3.2 Westernbloting 检测 NOD8 蛋白表达收集转染的或未转染的 RAW264.7 细胞, 用预冷的 PBS 洗 3 次, 加入含 100g/LPMSF 的细胞裂解液, 冰上孵育 30min, 离心 15min, 收集上清 Bradford 法检测蛋白浓度,5% 浓缩胶 10% 分离胶分离蛋白后, 将蛋白通过电转移的方式转移至硝酸纤维薄膜上, 用特

891 异性抗体检测 NOD8 蛋白的表达, 以 GAPDH 作为标准内参结果用 Bio Rad 图像分析仪进行分析 - 3.

3 891 异性抗体检测 NOD8 蛋白的表达, 以 GAPDH 作为标准内参结果用 Bio Rad 图像分析仪进行分析 Griesreagent 法测定 NO 2 的浓度实验分组 :(1) 阴性对照组 (negativecontrol,nc);(2)peg FP C2 对照组 ;(3)pEGFP NOD8+LPS 组 ;(4)pEG FP C2+ LPS 组根据 NO 溶解于水后可以形成亚硝酸盐的原理, 测定培养基中亚硝酸盐 (NO - 2 ) 的含量, 可以间接反应细胞上清中 NO 的含量将 RAW264.7 细胞以 cels/wel 密度接种在 24 孔细胞培养板上, 培养过夜后, 做转染处理在 LPS 刺激的和 24h, 分别提取各组的细胞上清 - 液, 检测细胞上清中 NO 2 的浓度检测前将试剂从 4 冰箱中取出, 置于室温平衡 30min 亚硝酸盐 (nitrite) 标准品梯度稀释用来绘制标准曲线稀释的标准品以及待测细胞上清液均设 3 个复孔, 按照操作说明书的步骤, 测定酶标仪 560nm 波长处吸光度 (A) 根据标准曲线计算上清液中 NO 含量 3.4 ELISA 法测定 IL 1β 和 TNF α 含量培养方法按 3.1 项, 实验分组按 3.3 项, 收集细胞上清液备用将 IL 1β 及 TNF α 试剂盒从冰箱中取出放置室温下平衡 30min 将标准品瞬时离心 5s, 按照说明书, 稀释冻干标准品, 将标准品成比稀释为所需的浓度按照 IL 1β 试剂盒的操作步骤, 测量 450nm 处的吸光度值 ; 按照 TNF α 试剂盒的说明, 测量 450 nm 激发波长 570nm 发射波长处的吸光度值处理数据, 计算每一种样品 3 个孔 A 值的平均值, 参照标准曲线, 计算出各组不同时点细胞培养上清液中 IL 1β 和 TNF α 的含量 3.5 荧光法测定活化的 caspase 1 水平培养方法按 3.1 项, 实验分组按 3.3 项, 分别于 0h 6h 12h 24h 消化离心收集各组细胞用 50μL 的细胞裂解液重悬细胞, 冰上孵育 10min, 然后加入 96 孔板中 50μL/wel, 依次加入含 10mmol/LDTT 的 2 ReactionBufer50 μl/wel,1 mmol/l YVAD AFC substrate5μl/wel, 然后置于 37 温箱孵育 1~2h, 荧光酶标仪 400nm 激发波长 505nm 发射波长下测定各孔的荧光值, 计算每一种样品 3 个孔 A 值的平均值, 将该值与对照组 A 值相比, 计算出各组细胞样品中活化 caspase 1 的相对值 3.6 Westernbloting 检测巨噬细胞胞浆 NF κb 亚基 p65 蛋白表达按 3.5 项分别收集各组不同时点的细胞, 提取胞浆蛋白胰酶消化收集细胞, 用预冷的 PBS 清洗 2 次, 细胞浆提取试剂 I, 漩涡混匀 20s, 在冰上孵育 10min, 再加入胞浆提取试剂 I, g 离心 5min, 取上清, 此提取物为胞浆成分, 保存于 80 备用, 同时 BCA 测定蛋白浓度 ; Westernbloting 后续检测蛋白表达 4 统计学处理用 SPSS13.0 统计软件进行分析处理计数资料数据用均数 ± 标准差 (mean±sd) 表示, 多组间比较采用单因素方差分析 (ANOVA), 组间两两比较采用最小显著性差异法 (LSD 法 ), 以 P<0.05 为差异有统计学意义结果 1 转染前后细胞状态转染前及转染后 24h, 倒置显微镜下观察 RAW264.7 细胞形态和数量上的变化与转染前相比, 转染后 24h 内细胞的形态未发生明显变化, 但细胞的数量增多, 密度增大, 见图 1 Figure1.Thecelularmorphologybeforeandafterplasmidswere transfectedintoraw264.7cels( 200).A:before transfection;b:24haftertransfection. 图 1 质粒转染前和转染后 24hRAW264.7 细胞情况 2 NOD8 蛋白在 RAW264.7 细胞中的表达 Westernbloting 检测结果显示,pEGFP NOD8 转染组 (0.0170±0.0019) 与 pegfp C2 空质粒转染组 (0.0080±0.0007) 相比,NOD8 蛋白表达明显增加, 差异有统计学意义, 见图 2 Figure2.NOD8proteinexpresiondetectedbyWesternbloting analysis. 图 2 Westernbloting 检测 NOD8 蛋白的表达

4 892 3 过表达 NOD8 抑制 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞 NO 释放及 24h, 阴性对照组和 pegfp C2 对照组有少量 NO 释放, 而 pegfp C2+LPS 组随着时间的延长,NO 的释放量逐渐升高, 在 24h 时 NO 的释放量可达到 (34.14±1.01)μmol/L 与 pegfp C2+ LPS 组相比,pEGFP NOD8+LPS 组在 6hNO 的释放量无明显变化 (P>0.05), 在 12h 和 24hNO 的释放量明显降低, 差别有统计学意义, 见图 3 htnf α 浓度无明显变化, 差别无统计学意义 (P> 0.05), 见图 5 Figure4. EfectofNOD8ontheproductionofIL 1βinLPS stimulatedraw264.7 cels.mean±sd.n=3. ## P<0 01vsNC; P<0.05, P<0 01vspEG FP C2+LPSatthesametimepoints. 图 4 NOD8 对 LPS 诱导 RAW264.7 细胞释放 IL 1β 的影响 Figure3.EfectofNOD8onthereleaseofNOinLPS stimulated RAW264.7cels.Mean±SD.n=3. ## P<0.01vs NC; P<0.01vspEGFP C2+LPSatthesametime points. 图 3 NOD8 对 LPS 诱导 RAW264.7 细胞释放 NO 的影响 4 过表达 NOD8 抑制 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞 IL 1β 释放 h, 阴性对照组和 pegfp C2 对照组细胞上清中 IL 1β 的含量无明显变化, 而 pegfp C2 +LPS 组随时间的增加,IL 1β 的浓度逐渐升高与 pegfp C2+LPS 组相比,pEGFP NOD8+LPS 组在 6 h 12h 和 24hIL 1β 的释放量均明显降低, 差别有统计学意义, 见图 4 5 过表达 NOD8 对 LPS 诱导 RAW264.7 细胞释放 TNF α 的影响随着时间的增加, 阴性对照组和 pegfp C2 对照组细胞上清 TNF α 的含量并无明显增加, 而 pegfp C2+LPS 组在 6 12 和 24hTNF α 释放量均显著增加, 各时点 TNF α 的释放量无明显差异 pegfp NOD8+LPS 组与 pegfp C2+LPS 组相比, Figure5.EfectofNOD8onthereleaseofTNF αinlps stimu latedraw264.7cels.mean±sd.n=3. ## P< 0 01vsNC. 图 5 NOD8 对 LPS 诱导 RAW264.7 细胞释放 TNF α 的影响 6 过表达 NOD8 抑制 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞 caspase 1 的活化 LPS 刺激 RAW264.7 细胞 h 后 caspase 1 活化水平均明显升高 ; 与 pegfp C2+LPS 组相比,

893 pegfp NOD8+LPS 组 caspase 1 活化水平在各时点均显著下降, 且呈时间依赖性而阴性对照组和 pegfp C2 对照组 caspase 1 活化水平在各时点无显著差异 (P>0.05), 见图 6 Figure6.EfectofNOD8ontheactivationofcaspase 1inLPS inducedraw264.7cels.mean±sd.n=3.

5 893 pegfp NOD8+LPS 组 caspase 1 活化水平在各时点均显著下降, 且呈时间依赖性而阴性对照组和 pegfp C2 对照组 caspase 1 活化水平在各时点无显著差异 (P>0.05), 见图 6 Figure6.EfectofNOD8ontheactivationofcaspase 1inLPS inducedraw264.7cels.mean±sd.n=3. ## P< 0.01vsNCatthesametimepoints; P<0.05, P <0.01vspEGFP C2+LPSatthesametimepoints. 图 6 NOD8 对 LPS 诱导 RAW264.7 细胞 caspase 1 活化水平的影响 7 过表达 NOD8 抑制 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞 p65 核转位 Westernbloting 结果表明, 正常情况下,p65 主要存在于胞浆内 ;LPS 刺激后, 胞浆中的 p65 的蛋白表达在 6 12 和 24h 逐渐减少, 且呈时间依赖性与 pegfp C2+LPS 组相比,pEGFP NOD8+LPS 组胞浆内的 p65 表达在 6 12 和 24h 不断增加, 并呈时间依赖性这说明 NOD8 可抑制 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞 p65 核转位 (P<0.01), 见图 7 讨论近年来文献报道有 NLRs 家族参与固有免疫抵御病原体感染 [9] NLRs 主要分布在胞浆内识别病原体相关分子模式和内源性分子 [5,10 14] 近年发现大部分 NLRs 可通过识别微生物, 激活其信号转导通路, 募集吞噬细胞导致炎症介质的产生以及调控获得性免疫反应其中 NOD1 和 NOD2 分别识别细菌肽聚糖结构和胞壁酰二肽, 诱导 NF κb 的激活 [6] NLRs 家族大部分成员具有促炎作用, 但是近年来的 Figure7.EfectofNOD8onp65proteinexpresionincytoplasm ofraw264.7 celsdetected bywestern bloting. Mean±SD.n=3. P<0.05, P<0.01vspEG FP C2+LPSatthesametimepoints; ## P<0.01vs pegfp C+LPS(0h). 图 7 Westernbloting 检测 NOD8 对 LPS 诱导 RAW264.7 细胞胞浆 p65 表达的影响研究表明 NLRs 家族部分成员起抗炎作用 [15] 有报道指出,NLRP7 可以抑制 caspase 1 介导的 IL 1β 加工,NLRP2 可以抑制 ASC 介导的 NF κb 的激活 [16] 最近有研究表明 NOD8 转基因小鼠受到鼠伤寒沙门菌感染时,IL 1β 的表达并不增加 [7] 对 NOD8 抗炎作用及机制的研究将为炎症性疾病的防治开辟广阔前景 LPS 作为炎症的强激活剂, 可激活巨噬细胞, 活化的巨噬细胞可以产生大量炎症细胞因子如 IL 1β 和 TNF α, 引起 inos 的表达增加, 从而释放大量具有组织损伤毒性的自由基 NO 等, 导致强烈的氧化应激反应最终造成细胞的凋亡和坏死 [4] 本研究通过 NOD8 对 LPS 诱导巨噬细胞释放炎症因子的影响, 来探讨 NOD8 在炎症中的作用结果发现,LPS 刺激 h 后,RAW264.7 细胞释放 NO IL 1β 及 TNF α 均明显增加 ; 而在 pegfp NOD8+LPS 组,NO 于 12h 24h 的释放显著降低 ;IL 1β 于 h 的释放也明显减少 ; 而 TNF α 的释放则无明显变化从上述结果我们可以发现, 与 pegfp C2+LPS 组相比,pEGFP NOD8+LPS 组 NO 于 6h 的分泌量并无

6 894 降低, 分析其原因可能在于 NO 早期释放较少 NOD8 对 TNF α 的表达无显著影响, 这一现象可能与 NOD8 发挥作用的途径有关通过构建 NOD8 和多种炎症因子的质粒共转染 HEK293 细胞后, 发现 NOD8 可以抑制 caspase 1 介导 IL 1β 的分泌和 ASC 介导的 NF κb 的活化和细胞凋亡 [6] 进一步发现 NOD8 抑制 caspase 1 前体的催化活性是通过 NOD 结构域 ;NOD 结构域通过抑制 caspase 1 前体的催化活性或 caspase 1 的自我寡聚化反应, 抑制 caspase 1 的活化另外,NOD8 的 PYD 结构域可以抑制 ASC 介导的 NF κb 的活化和细胞凋亡以及 ASC 增强 caspase 1 介导产生 IL 1β 的能力 ;NOD8 的 PYD 结构域是 ASC 的一种生理抑制剂 [17], 其可能通过阻止 ASC 聚集抑制 ASC 的多种功能 [7] 但 NOD8 不能抑制由星形孢菌素 Fas 配体以及 TNF α 诱导 HEK293T Y 细胞的细胞凋亡 [6] ; 因此 NOD8 可能抑制 caspase 1 的活性和 ASC 介导的 NF κb 激活及细胞凋亡而发挥抗炎活性所以, 我们接下来利用荧光检测法检测 caspase 1 的活化水平以及 Westernbloting 检测核因子亚基 p65 的核转位, 进一步探讨 NOD8 在巨噬细胞炎症中抑制炎症因子的可能相关机制结果证实 NOD8 可以抑制 LPS 诱导的巨噬细胞 caspase 1 的活化, 且呈时间依赖效应 LPS 刺激巨噬细胞后, 胞浆中的 p65 蛋白表达在 6 12 和 24h 逐渐减少而 pegfp NOD8+LPS 组胞浆内的 p65 表达与 pegfp C2+LPS 组相比,p65 核转位在 h 逐渐减少, 并呈时间依赖效应, 说明 NOD8 可抑制 LPS 诱导 RAW264.7 细胞 p65 核位移综上所述, 说明 NOD8 可抑制 LPS 诱导巨噬细胞释放 NO 和 IL 1β, 其作用机制可能是通过抑制 caspase 1 活化以及 NF κbp65 亚基核转位, 抑制 NF κb 活化, 从而减少巨噬细胞炎症因子的释放随着对 NOD8 抗炎作用的深入研究,NOD8 可作为炎症性疾病治疗的新靶点, 将有助于预防和治疗炎症性疾病 [ 参考文献 ] [1] KawaiT,AkiraS.TherolesofTLRs,RLRsandNLRsin pathogenrecognition[j].intimmunol,2009,21(4): [2] 席琼, 胡巢凤, 张芸, 等.RIP2 对大肠杆菌的抗菌作用研究 [J]. 中国病理生理杂志,2011,27(5): [3] LiF,FuY,LiuB,etal.Steviosidesuppresedinflamma torycytokinesecretionbydownregulationofnf κb and MAPKsignalingpathwaysinLPS stimulatedraw264.7 cels[j].inflammation,2012,35(5): [4] LiuCL,ChengL,KoCH,etal.Bioasay guidedisola tionofanti inflammatorycomponentsfromtherootofreh manniaglutinosaanditsunderlyingmechanismviainhibi tionofinospathway[j].jethnopharmacol,2012,143 (3): [5] InoharaN,ChamailardM,McdonaldC,etal.NOD LRRproteins:roleinhost microbialinteractionsandin flammatorydisease[j].annurevbiochem,2005,74: [6] WangY,HasegawaM,ImamuraR,etal.PYNOD,ano velapaf 1/CED4 likeproteinisaninhibitorofascand caspase 1[J].IntImmunol,2004,16(6): [7] ImamuraR,WangY,KinoshitaT,etal.Anti inflamma toryactivityofpynodanditsmechanism inhumansand mice[j].jimmunol,2010,184(10): [8] 曾琪, 张芸, 田莉, 等.P53 结合位点对 NOD8 基因的调控 [J]. 中国病理生理杂志,2011,27(12): [9] LichJD,TingJP.CATERPILLER(NLR)familymem bersaspositiveandnegativeregulatorsofinflammatoryre sponses[j].procamthoracsoc,2007,4(3): [10]FritzJH,FereroRL,PhilpotDJ,etal.Nod likepro teinsinimmunity,inflammationanddisease[j].natim munol,2006,7(12): [11] KannegantiTD, LamkanfiM, NunezG. Intracelular NOD likereceptorsinhostdefenseanddisease[j].im munity,2007,27(4): [12]MeylanE,TschoppJ,KarinM.Intracelularpaternrec ognitionreceptorsinthehostresponse[j].nature,2006, 442(7098): [13] TingJP,KastnerDL,HofmanHM.CATERPILLERs, pyrinandhereditaryimmunologicaldisorders[j].natrev Immunol,2006,6(3): [14]YuHB,FinlayBB.Thecaspase 1inflammasome:apilot ofinnateimmuneresponses[j].celhostmicrobe,2008, 4(3): [15] HindsMG,NortonRS,VauxDL,etal.Solutionstructure ofabaculoviralinhibitorofapoptosis(iap)repeat[j]. NatStructBiol,1999,6(7): [16] KinoshitaT,WangY,HasegawaM,etal.PYPAF3,a PYRIN containingapaf 1 likeprotein,isafeedbackreg ulatorofcaspase 1 dependentinterleukin 1betasecretion [J].JBiolChem,2005,280(23): [17] DowdsTA,MasumotoJ,ChenFF,etal.Regulationof cryopyrin/pypaf1signalingbypyrin,thefamilialmediter raneanfevergeneproduct[j]. Biochem BiophysRes Commun,2003,302(3):

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽