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1 一.Th17 细胞 联科生物技术有限公司杭州市拱墅区科技工业功能区祥茂路 36 号 (310011) Th17 细胞的性质和检测 产生 IL-17 的 CD4+T 细胞, 即 Th-17 细胞, 是与 Th1 和 Th2 细胞分化途径不同的另一个 Th 细胞亚群 目前研究分化的机理可能有两种, 一种是 IL-23 依赖,STAT-1, T-bet, STAT4 和 STAT6 非依赖的途径 已发现 Th1 和 Th2 的特殊效应分子, 如 IFN-γ 和 IL-4, 都对 Th17 细胞的发生起负调控作用 第二种机理, 已证实在缺乏 IL-23 情况下, 初始 CD4 细胞用 TGF-β1 和 IL-6 处理可以分化成 Th17 细胞,IL-1β 和 TNF-α 可以增强其分化 虽然 IL-23 在 Th17 细胞的分化过程中可以缺乏, 但在其存活和增殖的过程中是必须的 EAE( 实验性变态反应性脑脊髓炎 ) 实验中,IL-23 极化的 IL-17 效应细胞过继转移在疾病进程中是必须的 而且, 负调控信号 IFN-γ 的抑制作用, 引起病理性 Th17 效应细胞增殖和自身免疫疾病恶化加快 二 Th-17 细胞的发育 三 IL-17 IL-17 是 CD4+T 细胞来源的细胞因子, 增强炎症反应, 与风湿性关节炎 哮喘 多发性硬化症 牛 皮癣和移植注射相关 cdna 编码的人 IL-17 分离自 CD4+T 细胞文库, 编码的蛋白与 HVS13 有 72% 的 氨基酸同源性, 与小鼠 CTLA-8 有 63% 的同源性 HVS13 是 T 淋巴细胞猿疱疹病毒 (Herpesvirus saimiri)

2 的一个开放阅读框 人的 IL-17 是一种 kd 的糖蛋白同型二聚体 活化的外周血 CD4+T 细胞产生高水平的 IL-17 同型二聚体 IL-17 在人的成纤维细胞中增强细胞内粘附分子 (ICAM-1) 的表达 人 IL-17 也刺激上皮 内皮和成纤维细胞分泌 IL-6 IL-8 G-CSF 和 PGE2 在人 IL-17 存在的情况下, 成纤维细胞能保持 CD34 阳性造血祖细胞的增殖性, 诱导其发育成为中性粒细胞 小鼠 大鼠 和人的 IL-17 都能诱导小鼠干细胞分泌 IL-6, 显示所有的 IL-17 同型都能够识别小鼠 IL-17 受体 四 Th17 细胞表达的细胞因子 : 包括 IL-17A, IL-17F, IL-22 & IL-17A/F 异型二聚体 除了 IL-17A, 分化的 Th17 细胞再次活化时还能产生 IL-17F 和 IL-22 IL-17F 与 IL-17A 一样, 与炎症疾病相关 IL-17A 和 IL-17F 已经发现在多种自身免疫病的组织中表达, 如风湿性关节炎 多发性硬化症 牛皮癣 急性肠炎和哮喘 已有报道 IL-17 处理气道上皮细胞 静脉内皮细胞 成纤维细胞可以诱导 IL-6, IL-8, GROa, ENA-78, TGF-β, MCP-1, G-CSF, GM-CSF 和 ICAM-1 的产生 IL-17 家族共有 6 个成员,IL-17F 与 IL-17A 的同源性最高 (50% 的氨基酸同源性 ), 有两个基因位 于相同的染色体区域 近来的研究表明 Th17 分化的过程中 IL-17A 和 IL-17F 存在协调调节 人类外周 血淋巴细胞中检测到 IL-17F 和 IL-17A 的表达, 尤其是活化的人类 CD4+T 细胞 与 IL-17A 类似, IL-17F 也是二硫键连接的同型二聚体糖蛋白 IL-17F 同型二聚体包括经典的半胱氨酸结花样 (cysteine knot motif),tgf-β 骨形成素蛋白和神经生长因子超家族的结构中也有此花样 半胱氨酸结花样的存在提示异型二聚体结构的可能性, 比如 TGF-β 和抑制素 / 激动素 近来两个研究团队 (Chen Dong et al 和 Neil Wolfman et al.) 确认了这一假设, 即 IL-17F 和 IL-17A 在 HEK293 细胞中的共表达不仅形成了 IL-17A 和 IL-17F 同型二聚体, 还有具有生物活性的 IL-17F/IL-17A 异型二聚体 而且, 活化的人 CD4+T 细胞也产生 IL-17A/F 异源二聚体 比较 IL-17A, IL-17F 和 IL-17A/F 的相对作用强度, 三种都可以诱导 GRO-a 的分泌,IL-17A 的作用最强,IL-17A/F 异型二聚体次之, 最后是 IL-17F ( 比 IL-17A 的效果低 100 倍 ) 在分泌蛋白的相对丰度来说, 培养物中活化的人类 CD4+T 细胞分泌 IL-17F

3 同型二聚体的水平比 IL-17A 同型二聚体高 10 倍, 提示大部分的 IL-17A 是以 IL-17A/F 异型二聚体的形式存在的 小鼠中,IL-17A/F 异型二聚体 ( 单独或与 TNF-α 协同 ) 调控 IL6 和 KC( 人 GROa 的小鼠同源物 ) 的表达, 这种调控作用依赖于 IL-17RA 和 TRAF6 IL-17A/F 这种新的异型二聚体细胞因子, 被认为有调控炎症反应的作用 五 IL-17 的细胞内检测 Human IL-17A ELISPOT: 左图 : 人 PBMCs 培养 24 小时 ( 无刺激剂 ) 右图 :PMA/Ionomycin 活化 24h 的人 PBMCs 再活化的 Th17 细胞 IL-17F 表达 : 体外分化的 Th17 细胞在 monensin 存在的情况下再活化,CD4 染色后用 Alexa Fluor 647 anti-mouse IL-17F (clone ebio18f10) 胞内染色 ( 左图 ) 或同型对照染色 ( 右图 )

4 Th17 细胞再活化后共表达 IL-17F 和 IL-17A:(IL-17F vs. IL-17A): 体外分化的 Th17 细胞在 monensin 存在的情况下再活化,CD4 染色 固定 破膜 Alexa Fluor 647 anti-mouse IL-17F (clone ebio18f10) 和 PE anti-mouse IL-17A (clone ebio17b7) 染色 ( 左图 ) 或 IL-17A 同型对照染色 ( 右图 ) 六 RORγ(t) 诱导 Th17 细胞的产生 RORγ 与 RORα 和 RORβ 同是维甲酸相关孤儿受体家族的成员, 该家族是配体依赖的转录因子, 参与多种生理过程 RORγ 表达于肝 肺 肌肉 心脏和肾等组织 它的发现是源于 RORγt,RORγ 的可变转录产物, 广泛表达于淋巴器官间隔细胞 ( 称为 CD4+CD8+ 双阳性细胞 ), 这群细胞诱导外周和淋巴组织中 Th17 细胞的产生 RORγt 与 RORγ 在氨基端有三个不同的氨基酸 Ivaylo 等 (Cell. 126 : , 2006) 发现 RORγt 是诱导炎症 Th17 细胞产生的转录因子 其表达于肠固有层细胞, 这些细胞大部分组成型产生 IL-17 RORγt 缺失的小鼠没有该细胞 Th17 的体外分化和体内介导炎症疾病产生所必须的细胞因子都需要 RORγt 的诱导 七 人和小鼠的 RORγ(t) 胞内检测 RORγ(t) (clone AFKJS-9): CD4+ T 细胞分选自 RORgt 缺陷型 ( 左图 ) 或野生型 ( 中图 ) 小鼠脾脏和淋巴结,Th17 极 化培养 3 天,CD4 PE-Cy5.5, IL-17A APC 和 RORγ(t) PE (clone AFKJS-9) 染色 对 CD4+IL-17A+ 部分分别设门分析

5 RORγ(t) ( 右图 ), 蓝色为缺陷型, 粉色为野生型 数据来自 D.R. Littman 实验室 RORγ(t) (clone AFKJS-9): 正常人 PBMC CD4+ T 细胞,Th17 极化培养 3 天,CD4 FITC, IL-17A APC 和 Rat IgG2a PE 同型对照染色或 RORγ(t) PE (clone AFKJS-9) 染色 单参数图表示 RORγ(t) 的表达情况 : 同型对照 ( 黑色 ) CD4+IL-17A+( 粉色 ) CD4+IL-17A-( 蓝色 ) CD4-IL-17A-( 绿色 ) Western Blot 检测小鼠 RORγ(t) RORγ(t) (clone B2D): 左图 : 小鼠胸腺 ( 左 ) 和脾脏 ( 右 ) 核细胞裂解液, 上样量 1x10 5 cells/lane, 2 µg/ml B2D 抗体 HRP anti-rat IgG 检测 右图 : 非转染细胞 ( 左 ) 和小鼠 ROR gamma- 转染的 293T 细胞 ( 右 ) 核裂解液, 上样量 1X10 5 cells/lane, 2 µg/ml B2D 抗体 HRP anti-rat IgG 检测 注意 : ROR gamma 在转染细胞中的电泳分子量稍大于胸腺裂解液, 因其除 ROR gamma 外还带有一个标签

6 八 Th1, Th2 & Th-17 细胞的表型 Th1, Th2 & Th-17 细胞的表型 细胞类型 Th1 Th2 Th-17 表面标志 CD CD IFN-γR + IL-12Rβ2 + IFN-γ 上调其表达 - + IL-23R + + IFN-γ 下调其表达 Tim-3 + -? 细胞因子 IFN-γ IL-2 + +/- - IL IL IL-6 +/- + IL (m) - IL IL IL-17A IL-17F IL IL IL IL TNF-α 发生部位 Thymus, ThP Thymus, ThP Thymus, ThP 主要功能 病毒和细胞内病原清除 调控寄生虫感染 炎症反应调节 体外极化诱导 IL-12, anti-il-4 IL-4, anti-il-12 TGF-β/IL-6 anti-il-4; IL-23 anti-ifn-γ,

7 分化抑制因子 IL-4 IL-12, IFNγ IL-4, IFNγ and Type I IFN ROR-γt, STAT3, STAT5. 相关转录因子 STAT-1, STAT-4, T-bet. GATA-3 抑制. STAT-6, GATA-3 STAT-4, STAT-6, T-bet, GATA-3 非依赖 STAT-1 抑制. SOCS 信号 敏感 敏感 不太敏感? CD28 信号 依赖 依赖 ICOS 信号 非依赖 依赖 T reg 信号 敏感? 敏感? 不太敏感?

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