化妆品卫生规范 Hygienic Standard for Cosmetics

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1 卫生部关于印发化妆品卫生规范 (2002 年版 ) 的通知 卫法监发 号 各省 自治区 直辖市卫生厅局, 卫生部卫生监督中心, 中国疾病预防控制中心, 有关单位 : 现将新修订的 化妆品卫生规范 (2002 年版 ) 印发给你们, 本规范自 2003 年 1 月 1 日起实施 各有关单位应严格依照本规范进行化妆品审批和监督工作 以往发布的文件要求 与本规范不一致的, 以本规范为准 中华人民共和国卫生部印章 二 二年九月十九日

2 目录第一部分总则一 范围 1 二 规范性引用文件 1 三 定义 1 四 化妆品的一般要求 1 五 对产品的要求 1 六 对原料的要求 1 七 对包装的要求 2 表 2(1) 化妆品组份中禁用物质 ( 英文排序 ) 3 表 2(1) 化妆品组份中禁用物质 ( 汉语拼音排序 ) 15 表 2(2) 化妆品组份中禁用物质 ( 拉丁文排序 ) 28 表 2(2) 化妆品组份中禁用物质 ( 汉语拼音排序 ) 31 表 3 化妆品组份中限用物质 ( 英文排序 ) 34 表 3 化妆品组份中限用物质 ( 汉语拼音排序 ) 43 表 3 化妆品组份中限用物质 ( 中文 英文 INCI 名称对照 ) 53 表 4 化妆品组份中限用防腐剂 ( 英文排序 ) 56 表 4 化妆品组份中限用防腐剂 ( 汉语拼音排序 ) 61 表 4 化妆品组份中限用防腐剂 ( 中文 英文 INCI 名称对照 ) 66 表 5 化妆品组份中限用紫外线吸收剂 ( 英文排序 ) 69 表 5 化妆品组份中限用紫外线吸收剂 ( 汉语拼音排序 ) 72 表 5 化妆品组份中限用紫外线吸收剂 ( 中文 英文 INCI 名称对照 ) 74 表 6 化妆品组份中限用着色剂 76 第二部分 毒理学试验方法 一 总则 86 二 急性经口毒性试验 87 三 急性经皮毒性试验 90

3 四 皮肤刺激性 / 腐蚀性试验 93 五 急性眼刺激性 / 腐蚀性试验 96 六 皮肤变态反应试验 99 七 皮肤光毒性试验 104 八 鼠伤寒沙门氏菌 / 回复突变试验 107 九 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 114 十 体外哺乳动物细胞基因突变试验 118 十一 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验 122 十二 体内哺乳动物骨髓细胞微核试验 125 十三 精子畸形试验 128 十四 亚慢性经口毒性试验 131 十五 亚慢性经皮毒性试验 135 十六 致畸试验 139 十七 综合慢性毒性 / 致癌性试验 142 第三部分 卫生化学检验方法 一 总则 147 二 汞 149 三 砷 153 四 铅 161 五 甲醇 167 六 微波消解法 170 七 ph 172 八 镉 174 九 锶 178 十 总氟 180 十一 总硒 182 十二 硼酸和硼酸盐 184

4 十三 去头屑洗发用品中二硫化硒 186 十四 甲醛 188 十五 巯基乙酸 190 十六 苯酚 氢醌 192 十七 性激素 197 十八 紫外吸收剂 201 十九 防腐剂 208 二十 氢化型染发剂中染料 211 二十一 氮芥 213 二十二 斑蝥素 215 二十三 α- 羟基酸 217 第四部分 微生物检验方法 一 总则 219 二 菌落总数 221 三 粪大肠菌群 224 四 绿脓杆菌 227 五 金黄色葡萄球菌 230 六 霉菌和酵母菌 232 第五部分 人体安全性和功效评价检验方法 一 总则 234 二 人体斑贴试验 235 三 人体试用试验 237 四 防晒化妆品防晒指数 (SPF 值 ) 人体测定方法 240

5 一 总则 General Principles 1 范围本规范规定了化妆品原料及其产品安全性评价的毒理学检测项目和要求 2 化妆品原料的检测化妆品的新原料, 一般需进行下列毒理学试验 : (1) 急性经口和急性经皮毒性试验 ; (2) 皮肤和急性眼刺激性 / 腐蚀性试验 ; (3) 皮肤变态反应试验 ; (4) 皮肤光毒性和光敏感试验 *( 原料具有紫外线吸收特性需做该项试验 ); (5) 致突变试验 ( 至少应包括一项基因突变试验和一项染色体畸变试验 ); (6) 亚慢性经口和经皮毒性试验 ; (7) 致畸试验 ; (8) 慢性毒性 / 致癌性结合试验 ; (9) 毒物代谢及动力学试验 *; (10) 根据原料的特性和用途, 还可考虑其它必要的试验 如果该新原料与已用于化妆品的原料化学结构及特性相似, 则可考虑减少某些试验 * 试验方法参照 GB 化妆品安全性评价程序和方法 OECD 化学物质试验指南 (OECD Guidelines for Testing of Chemicals); 3 化妆品产品的检测 3.1 检测项目在一般情况下, 新开发的化妆品产品在投放市场前, 应根据产品的用途和类别进行相应的试验, 以评价其安全性 3.2 检测项目的选择原则 由于化妆品种类繁多, 在选择试验项目时应根据实际情况确定 每天使用的化妆品需进行多次皮肤刺激性试验, 进行多次皮肤刺激性试验者不再进行急性皮肤刺激性试验间隔数日使用的和用后冲洗的化妆品进行急性皮肤刺激性试验 与眼接触可能性小的产品不需进行急性眼刺激性试验 二 急性经口毒性试验 Acute Oral Toxicity Test 1 范围本规范规定了动物急性经口毒性试验的基本原则 要求和方法 本规范适用于化妆品原料安全性毒理学检测 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No. 401, Feb ) USEPA OPPTS Harmonized Test Guidelines (Series , Aug ) 3 试验目的急性经口毒性试验是评估化妆品原料毒性特性的第一步, 通过短时间经口染毒可提供对健康危害的信息 试验结果可作为化妆品原料毒性分级和标签标识以及确定亚慢性毒性试验

6 和其它毒理学试验剂量的依据 4 定义 4.1 急性经口毒性 (Acute oral toxicity): 一次或在 24h 内多次经口给予实验动物受试物后, 动物在短期内出现的健康损害效应 4.2 经口 LD50( 半数致死量,Medium lethal dose): 经口一次给予受试物后, 引起实验动物总体中半数死亡的毒物的统计学剂量 以单位体重接受受试物的重量 (mg/kg 或 g/kg) 来表示 5 试验的基本原则以管饲法经口给予各试验组动物不同剂量的受试物, 每组用一个剂量, 染毒剂量的选择可通过预试验确定 染毒后观察动物的毒性反应和死亡情况 试验期间死亡的动物要进行尸检, 试验结束时仍存活的动物要处死并进行尸检 本方法主要适用于啮齿类动物的研究, 但也可用于非啮齿类动物的研究 6 试验方法 6.1 受试物受试物应溶解或悬浮于适宜的介质中, 建议首选水, 其次是植物油 ( 如玉米油 ), 或考虑使用其它介质 ( 如羧甲基纤维素 明胶 淀粉等 ) 对非水溶性介质, 应了解其毒理特性, 否则应在试验前先确定其毒性 每次经口染毒液体的最大容量取决于实验动物的大小, 对啮齿类动物所给液体容量一般为 1mL/100g, 水溶液可至 2mL/100g 通过调整受试物溶液浓度使各剂量组经口染毒的容量一致 6.2 实验动物和饲养环境首选健康成年大鼠和小鼠, 也可选用其它敏感动物 使用雌性动物应是未孕和未曾产仔的 实验动物体重之间相差不得超过平均体重的 20% 试验前动物要在实验动物房环境中至少适应 3~5d 时间 实验动物及实验动物房应符合国家相应规定 选用常规饲料, 饮水不限制 6.3 剂量水平根据所选方法的要求, 原则上应设 4~6 个剂量组, 每组动物一般为 10 只, 雌雄各半 各剂量组间距大小以兼顾产生毒性大小和死亡为宜, 通常以较大组距和较少量动物进行预试 如果受试物毒性很低, 也可采用一次限量法, 即用 10 只动物 ( 雌雄各半 ) 口服 5000mg/kg 体重剂量, 当未引起动物死亡, 可考虑不再进行多个剂量的急性经口毒性试验 6.4 试验步骤 试验前, 实验动物禁食过夜, 不限制饮水 若采用代谢率高的其它动物, 禁食时间可以适当缩短 正式试验时, 称量动物体重, 随机分组, 然后对各组动物用管饲法一次进行染毒, 若估计受试物毒性很低, 一次给予容量太大, 也可在 24h 内分 2~3 次染毒, 但合并作为一次剂量计算 染毒后继续禁食 3 h ~4 h 若采用分批多次染毒, 根据染毒间隔长短, 必要时可给动物一定量的食物和水 染毒后, 对每只动物都应有单独全面的记录, 染毒第 1 d 要定时观察实验动物的中毒表现和死亡情况, 其后至少每天进行一次仔细的检查 详细记录被毛和皮肤 眼睛和粘膜, 呼吸 循环 自主神经和中枢神经系统 肢体活动和行为等改变 特别注意是否出现震颤 抽搐 流涎 腹泻 嗜睡和昏迷等症状 应记录毒作用体征出现和消失的时间和死亡时间 观察期限一般不超过 14d, 但观察时间并非一成不变, 要视动物中毒反应的严重程

7 度 症状出现快慢和恢复期长短而定 若有死亡延迟迹象, 可延长观察时间 观察期内存活动物每周称重, 观察期结束存活动物应称重, 处死后进行尸检 对实验动物进行大体解剖学检查, 并记录全部大体病理改变 对死亡和存活 24h 和 24h 以上动物并存在大体病理改变的器官应进行病理组织学检查 可采用多种方法测定 LD50, 建议采用霍恩氏法 上 - 下法 概率单位 - 对数图解法和寇氏法等 6.5 试验结果评价评价试验结果时, 应将 LD50 与观察到的毒性效应和尸检所见相结合考虑,LD50 值是受试物毒性分级和标签标识以及判定受试物经消化道摄入后引起动物死亡可能性大小的依据 引用 LD50 值时一定要注明所用实验动物的种属 性别 染毒途径 观察期限等 评价应包括动物接触受试物与动物异常表现 ( 包括行为和临床改变 大体损伤 体重变化 致死效应及其它毒性作用 ) 的发生率和严重程度之间的关系 毒性分级见表 1 7 试验报告试验报告应包括如下内容 : (1) 受试物名称 理化性状 配制方法 所用浓度 ; (2) 实验动物的种属 品系和来源 ( 注明合格证号和动物级别 ); (3) 实验动物饲养环境, 包括饲料来源 室温 相对湿度 实验动物房合格证号 ; (4) 所用剂量和动物分组, 每组所用动物性别 数量及体重范围 ; (5) 染毒后动物中毒表现和死亡情况及出现时间, 大体解剖及病理所见 ; (6) 计算 LD50 的方法 ; (7) 列表报告结果和计算的 LD50 及其 95% 可信区间 ( 建议的表格形式见表 2 ); (8) 结论 表 1 经口毒性分级 LD50 (mg/kg) 毒性分级 50 高毒 >50~500 中等毒 >500~5000 低毒 >5000 实际无毒 表 2 对小鼠急性经口毒性试验结果 动物性别 剂量分组 (mg/kg) 动物数体重 (x±sd)(g) ( 只 ) 0 天 7 天 14 天 死亡动物数 ( 只 ) 死亡率 (%) LD50 及 95% 可信区间 : 雄性动物 : 雌性动物 : 8 试验结果的解释

8 通过急性经口毒性试验和 LD50 的测定可评价受试物的毒性 其结果外推到人类的有效性很有限 三 急性经皮毒性试验 Acute Dermal Toxicity Test 1 范围本规范规定了动物急性皮肤毒性试验的基本原则 要求和方法 本规范适用于化妆品原料安全性毒理学检测 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No. 402, Feb ) USEPA OPPTS Harmonized Test Guidelines (Series , Aug ) 3 试验目的急性皮肤毒性试验可确定受试物能否经皮肤吸收和短期作用所产生的毒性反应, 可为化妆品原料毒性分级和标签标识以及确定亚慢性毒性试验和其它毒理学试验剂量提供依据 4 定义 4.1 急性皮肤毒性 (Acute dermal toxicity): 经皮一次涂敷受试物后, 动物在短期内出现的健康损害效应 4.2 经皮 LD50( 半数致死量, Medium lethal dose): 经皮一次涂敷受试物后, 引起实验动物总体中半数死亡的毒物的统计学剂量 以单位体重涂敷受试物的重量 (mg/kg 或 g/kg) 来表示 5 试验的基本原则受试物以不同剂量经皮给予各组实验动物, 每组用一个剂量 染毒后观察动物的毒性反应和死亡情况 试验期间死亡的动物要进行尸检, 试验结束时仍存活的动物要处死并进行尸检 若已知受试物具有腐蚀性或强刺激性可不进行急性经皮毒性试验 6 试验方法 6.1 受试物液体受试物一般不需稀释 若受试物为固体, 应研磨成细粉状, 并用适量水或无毒 无刺激性 不影响受试物穿透皮肤 不与受试物反应的介质混匀, 以保证受试物与皮肤有良好的接触 常用的介质有橄榄油 羊毛脂 凡士林等 6.2 实验动物和饲养环境可选用健康成年大鼠 家兔或豚鼠作为实验动物, 也可使用其它种属动物进行试验 使用雌性动物应是未孕和未曾产仔的 建议实验动物体重范围为 : 大鼠 200g ~300g; 家兔 2kg ~3kg; 豚鼠 350g ~450g 实验动物皮肤应健康无破损 试验前动物要在实验动物房环境中至少适应 3d~5d 时间 实验动物及实验动物房应符合国家相应规定 选用常规饲料, 饮水不限制 6.3 剂量水平根据所选用的方法要求, 原则上应设 4~6 个剂量组, 每组动物一般为 10 只, 雌雄各半 各剂量组间距大小以兼顾产生毒性大小和死亡为宜, 通常以较大组距和较少量动物进行预试 如果受试物毒性很低, 可采用一次限量法, 即用 10 只动物 ( 雌雄各半 ) 皮肤涂抹 5000mg/kg 体重剂量, 当未引起动物死亡, 可考虑不再进行多个剂量的急性经皮毒性试验 6.4 试验步骤

9 6.4.1 试验开始前 24h, 剪去或剃除动物躯干背部拟染毒区域的被毛, 去毛时应非常小心, 不要损伤皮肤以免影响皮肤的通透性 涂皮面积约占动物体表面积的 10%, 应根据动物体重确定涂皮面积 体重为 200g~300g 的大鼠约为 30cm 2 ~40cm 2, 体重为 2kg~3kg 的家兔约为 160 cm 2 ~210 cm 2, 体重为 350g~450g 的豚鼠约为 46 cm 2 ~54 cm 将受试物均匀涂敷于动物背部皮肤染毒区, 然后用一层薄胶片覆盖, 无刺激胶布固定, 防止动物舔食 若受试物毒性较高, 可减少涂敷面积, 但涂敷仍需尽可能薄而均匀 一般封闭接触 24h 染毒结束后, 应使用水或其它适宜的溶液清除残留受试物 观察期限一般不超过 14d, 但要视动物中毒反应的严重程度 症状出现快慢和恢复期长短而定 若有延迟死亡迹象, 可考虑延长观察时间 对每只动物都应有单独全面的记录, 染毒第 1 d 要定时观察实验动物的中毒表现和死亡情况, 其后至少每天进行一次仔细的检查 包括被毛和皮肤 眼睛和粘膜以及呼吸 循环 自主神经和中枢神经系统 肢体运动和行为活动等的改变 特别注意观察动物是否出现震颤 抽搐 流涎 腹泻 嗜睡 和昏迷等症状 死亡时间的记录应尽可能准确 观察期内存活动物每周称重 观察期结束存活动物应称重, 处死后进行尸检 对实验动物进行大体解剖学检查, 并记录全部大体病理改变 对死亡和存活 24h 和 24h 以上动物并存在大体病理改变的器官应进行病理组织学检查 可采用多种方法测定 LD50, 建议采用霍恩氏法 上 - 下法 概率单位 - 对数图解法和寇氏法等 6.5 试验结果评价评价试验结果时, 应将经皮 LD50 与观察到的毒性效应和尸检所见相结合考虑,LD50 值是受试物毒性分级和标签标识以及判定受试物经皮肤吸收后引起动物死亡可能性大小的依据 引用 LD50 值时一定要注明所用实验动物的种属 性别 染毒途径 观察期限等 评价应包括动物接触受试物与动物异常表现 ( 包括行为和临床改变 大体损伤 体重变化 致死效应及其它毒性作用 ) 的发生率和严重程度之间的关系 毒性分级见表 1 7 试验报告试验报告应包括如下内容 : (1) 受试物名称 理化性状 配制方法 所用浓度 ; (2) 实验动物的种属 品系和来源 ( 注明合格证号和动物级别 ); (3) 实验动物饲养环境, 包括饲料来源 室温 相对湿度 实验动物房合格证号 ; (4) 所用剂量和动物分组, 每组所用动物性别 数量及体重范围 ; (5) 染毒后动物中毒表现和死亡情况及出现时间, 大体解剖及病理所见 ; (6) 计算 LD50 的方法 ; (7) 列表报告结果和计算 LD50 及其 95% 可信区间 ( 建议的表格形式见表 2 ); (8) 结论 表 1 皮肤毒性分级 LD50 (mg/kg) 200 毒性分级高毒

10 >200~2000 中等毒 >2000~5000 低毒 >5000 实际无毒 表 2 对大鼠急性经皮毒性试验结果 动物性别 剂量分组 (mg/kg) 动物数 ( 只 ) 体重 (x±sd)(g) 0 天 7 天 14 天 死亡动物数 ( 只 ) 死亡率 (%) LD50 及 95% 可信区间 : 雄性动物 : 雌性动物 : 8 试验结果的解释急性经皮毒性试验研究和经皮 LD50 的确定提供了受试物经皮染毒的毒性 其结果外推到人类的有效性很有限 急性经皮毒性试验的结果应与经其它途径染毒的急性毒性试验结果相结合进行综合评价 四 皮肤刺激性 / 腐蚀性试验 Dermal Irritation/Corrosion Test 1 范围本规范规定了动物皮肤刺激性或腐蚀性试验的基本原则 要求和方法 本规范适用于化妆品原料及其产品安全性毒理学检测 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No.404, July 1992) USEPA OPPTS Harmonized Test Guidelines (Series , Aug ) 3 试验目的确定和评价化妆品原料及其产品对哺乳动物皮肤局部是否有刺激作用或腐蚀作用及其程度 4 定义 4.1 皮肤刺激性 (Dermal irritation): 皮肤涂敷受试物后局部产生的可逆性炎性变化 4.2 皮肤腐蚀性 (Dermal corrosion): 皮肤涂敷受试物后局部引起的不可逆性组织损伤 5 试验的基本原则将受试物一次 ( 或多次 ) 涂敷于受试动物的皮肤上, 在规定的时间间隔内, 观察动物皮肤局部刺激作用的程度并进行评分 采用自身对照, 以评价受试物对皮肤的刺激作用 急性皮肤刺激性试验观察期限应足以评价该作用的可逆性或不可逆性 6 试验方法 6.1 受试物

11 液体受试物一般不需稀释, 可直接使用原液 若受试物为固体, 应将其研磨成细粉状, 并用水或其它无刺激性溶剂充分湿润, 以保证受试物与皮肤有良好的接触 使用其它溶剂, 应考虑到该溶剂对受试物皮肤刺激性的影响 受试物为强酸或强碱 (ph 值 2 或 11.5), 可以不再进行皮肤刺激试验 此外, 若已知受试物有很强的经皮吸收毒性, 经皮 LD50 小于 200mg/kg 体重或在急性经皮毒性试验中受试物剂量为 5000mg/kg 体重仍未出现皮肤刺激性作用, 也无需进行急性皮肤刺激性试验 6.2 实验动物和饲养环境多种哺乳动物均可被选为实验动物, 首选白色家兔 应使用成年 健康 皮肤无损伤的动物, 雌性和雄性均可, 但雌性动物应是未孕和未曾产仔的 实验动物至少要用 4 只, 如要澄清某些可疑的反应则需增加实验动物数 实验动物应单笼饲养, 试验前动物要在实验动物房环境中至少适应 3d 时间 实验动物及实验动物房应符合国家相应规定 选用常规饲料, 饮水不限制 6.3 急性皮肤刺激性试验步骤 试验前约 24 h, 将实验动物背部脊柱两侧毛剪掉, 不可损伤表皮, 去毛范围左 右各约 2cm 3cm 取受试物约 0. 5 ml(g) 直接涂在皮肤上, 然后用二层纱布 (2.5cm 2.5cm) 和一层玻璃纸或类似物覆盖, 再用无刺激性胶布和绷带加以固定 另一侧皮肤作为对照 采用封闭试验, 敷用时间为 4h 对化妆品产品而言, 可根据人的实际使用和产品类型, 延长或缩短敷用时间 对用后冲洗的化妆品产品, 仅采用 2 h 敷用试验 试验结束后用温水或无刺激性溶剂清除残留受试物 如怀疑受试物可能引起严重刺激或腐蚀作用, 可采取分段试验, 将三个涂布受试物的纱布块同时或先后敷贴在一只家兔背部脱毛区皮肤上, 分别于涂敷后 3 min 60min 和 4 h 取下一块纱布, 皮肤涂敷部位在任一时间点出现腐蚀作用, 即可停止试验 于清除受试物后的 和 72 h 观察涂抹部位皮肤反应, 按表 1 进行皮肤反应评分, 以受试动物积分的平均值进行综合评价, 根据 和 72 h 各观察时点最高积分均值, 按表 2 判定皮肤刺激强度 观察时间的确定应足以观察到可逆或不可逆刺激作用的全过程, 一般不超过 14d 6.4 多次皮肤刺激性试验步骤 试验前将实验动物背部脊柱两侧被毛剪掉, 去毛范围各为 2cm 3cm, 涂抹面积 2.5 cm 2.5cm 取受试物约 0.5mL(g) 涂抹在一侧皮肤上, 当受试物使用无刺激性溶剂配制时, 另一侧涂溶剂作为对照, 每天涂抹 1 次, 连续涂抹 14d 从第二天开始, 每次涂抹前应剪毛, 用水或无刺激性溶剂清除残留受试物 一小时后观察结果, 按表 1 评分, 对照区和试验区同样处理 结果评价 : 按下列公式计算每天每只动物平均积分, 以表 2 判定皮肤刺激强度 红斑和水肿积分每天每只动物平均积分 = 受试动物数表 1 皮肤刺激反应评分 14 皮肤反应积分 红斑和焦痂形成

12 无红斑 0 轻微红斑 ( 勉强可见 ) 1 明显红斑 2 中度 ~ 重度红斑 3 严重红斑 ( 紫红色 ) 至轻微焦痂形成 4 水肿形成 无水肿 0 轻微水肿 ( 勉强可见 ) 1 轻度水肿 ( 皮肤隆起轮廓清楚 ) 2 中度水肿 ( 皮肤隆起约 1mm) 3 重度水肿 ( 皮肤隆起超过 1mm, 范围扩大 ) 4 最高积分 8 7 试验报告 试验报告应以表格形式总结, 包括如下内容 : (1) 受试物名称 理化性状 配制方法和用量 必要时说明受试物的 ph 值 ; (2) 实验动物的种属 品系 性别 体重和来源 ( 注明合格证号和动物级别 ); (3) 实验动物饲养环境, 包括饲料来源 室温 相对湿度 实验动物房合格证号 ; (4) 每个动物在每一观察时点的皮肤刺激反应积分 ; (5) 具体描述除刺激性以外的其它毒性作用 ; (6) 结论 表 2 皮肤刺激强度分级 积分均值 强 度 0 ~ < 0.5 无刺激性 0.5 ~ < 2.0 轻刺激性 2.0 ~ < 6.0 中刺激性 6.0 ~ 8.0 强刺激性 表 3 对家兔急性皮肤刺激性试验结果 动 1 h 24 h 48 h 物编号 性别 体重 (kg) 红斑 样品对照样品对照样品对照样品 水 总 红 水 肿 分 斑 肿 总 红 水 总 分 斑 肿 分 红 水 总 红 斑 肿 分 斑 水 总 红 水 肿 分 斑 肿 总 红 水 分 斑 肿 总分 总积分均值刺激强度分级

13 表 4 对家兔多次皮肤刺激性试验结果 涂抹动物数天数 ( 只 ) 天每只动物积分均值每天每只动物积分均值 刺激反应积分样品对照红斑水肿总分红斑水肿总分 8 试验结果的解释急性皮肤刺激试验结果从动物外推到人的可靠性很有限 白色家兔在大多数情况下对有刺激性或腐蚀性的物质较人类敏感 若用其它品系动物进行试验时也得到类似结果, 则会增加从动物外推到人的可靠性 试验中使用封闭式接触是一种超常的实验室条件下的试验, 在人类实际使用化妆品过程中很少存在这种接触方式 五 急性眼刺激性 / 腐蚀性试验 Acute Eye Irritation/Corrosion Test 1 范围本规范规定了动物急性眼刺激性或腐蚀性试验的基本原则 要求和方法 本规范适用于化妆品原料及其产品安全性毒理学检测 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No 405, Feb. 1987) USEPA OPPTS Harmonized Test Guidelines (Series , Aug ) 3 试验目的确定和评价化妆品原料及其产品对哺乳动物的眼睛是否有刺激作用或腐蚀作用及其程度 4 定义

14 4.1 眼睛刺激性 (Eye irritation): 眼球表面接触受试物后所产生的可逆性炎性变化 4.2 眼睛腐蚀性 (Eye corrosion): 眼球表面接触受试物后引起的不可逆性组织损伤 5 试验的基本原则受试物以一次剂量滴入每只实验动物的一侧眼睛结膜囊内, 以未作处理的另一侧眼睛作为自身对照 在规定的时间间隔内, 观察对动物眼睛的刺激和腐蚀作用程度并评分, 以此评价受试物对眼睛的刺激作用 观察期限应能足以评价刺激效应的可逆性或不可逆性 6 试验方法 6.1 受试物液体受试物一般不需稀释, 可直接使用原液, 染毒量为 0.1mL 若受试物为固体或颗粒状, 应将其研磨成细粉状, 并用水充分湿润, 染毒量应为体积 0.1mL 或重量不大于 100mg( 染毒量应进行记录 ) 受试物为强酸或强碱 (ph 值 2 或 11.5), 或已证实对皮肤有腐蚀性或强刺激性时, 可以不再进行眼刺激性试验 气溶胶产品需喷至容器中, 收集其液体再使用 6.2 实验动物和饲养环境首选健康成年白色家兔 至少使用 3 只家兔 试验前动物要在实验动物房环境中至少适应 3d 时间 在试验开始前的 24h 内要对试验动物的两只眼睛进行检查 ( 包括使用荧光素钠检查 ) 有眼睛刺激症状 角膜缺陷和结膜损伤的动物不能用于试验 实验动物及实验动物房应符合国家相应规定 选用常规饲料, 饮水不限制 6.3 试验步骤 轻轻拉开家兔一侧眼睛的下眼睑, 将受试物 0.1 ml(100mg) 滴入 ( 或涂入 ) 结膜囊中, 使上 下眼睑被动闭合 1s, 以防止受试物丢失 另一侧眼睛不处理作自身对照 滴入受试物后 24h 内不冲洗眼睛 若认为必要, 在 24h 时可进行冲洗 若上述试验结果显示受试物有刺激性, 需另选用 3 只家兔进行冲洗效果试验, 即给家兔眼滴入受试物后 30s 用足量 流速较快但又不会引起动物眼损伤的水流冲洗至少 30s 临床检查和评分 : 在滴入受试物后 h 以及第 4d 和第 7d 对动物眼睛进行检查 如果 72 h 未出现刺激反应, 即可终止试验 如果发现累及角膜或有其它眼刺激作用,7d 内不恢复者, 为确定该损害的可逆性或不可逆性需延长观察时间, 一般不超过 21d 除了对角膜 虹膜 结膜进行观察外, 其它损害效应均应当记录并报告 在每次检查中均应按表 1 眼损害的评分标准记录眼刺激反应的积分 可使用放大镜 手持裂隙灯 生物显微镜或其它适用的仪器设备进行眼刺激反应检查 在 24h 观察和记录结束之后, 对所有动物的眼睛应用荧光素钠作进一步检查 对用后冲洗的产品 ( 如洗面奶 发用品 ) 只做 30s 冲洗试验, 即滴入受试物后, 眼闭合 1s, 至第 30s 时用足量 流速较快但又不会引起动物眼损伤的水流冲洗 30s, 然后按 进行检查和评分 表 1 眼损害的评分标准 眼损害 积分 角膜 : 混浊 ( 以最致密部位为准 ) 无溃疡形成或混浊散在或弥漫性混浊, 虹膜清晰可见半透明区易分辨, 虹膜模糊不清

15 出现灰白色半透明区, 虹膜细节不清, 瞳孔大小勉强可见角膜混浊, 虹膜无法辨认 虹膜 : 正常皱褶明显加深, 充血 肿胀 角膜周围有中度充血, 瞳孔对光仍有反应出血 肉眼可见破坏, 对光无反应 ( 或出现其中之一反应 ) 结膜 : 充血 ( 指睑结膜 球结膜部位 ) 血管正常血管充血呈鲜红色血管充血呈深红色, 血管不易分辨弥漫性充血呈紫红色水肿无轻微水肿 ( 包括瞬膜 ) 明显水肿, 伴有部分眼睑外翻水肿至眼睑近半闭合水肿至眼睑大半闭合 结果评价化妆品原料 以给受试物后动物角膜 虹膜或结膜各自在 和 72h 观察时点的刺激反应积分的均值和恢复时间评价, 按表 2 眼刺激反应分级判定受试物对眼的刺激强度 化妆品产品 以给受试物后动物角膜 虹膜或结膜各自在 或 72h 观察时点的刺激反应的最高积分和恢复时间评价, 按表 3 眼刺激反应分级判定受试物对眼的刺激强度 8 试验报告试验报告应包括如下内容 : (1) 受试物名称 理化性状 配制方法和用量, 必要时说明受试物的 ph 值 ; (2) 实验动物的种属 品系和来源 ( 注明合格证号和动物级别 ); (3) 实验动物饲养环境, 包括饲料来源 室温 相对湿度 实验动物房合格证号 ; (4) 列表显示每只动物在每一观察时点 ( 如染毒 1,24,48 和 72h) 的刺激反应 ( 建议的表格形式见表 4), 将实验条件不冲洗和 30 秒冲洗的结果分别列表 ; (5) 具体描述除眼部以外的其它作用 ; (6) 描述在各观察时点积分时的检查方法 ( 如手持裂隙灯 用荧光素钠 ); (7) 结论 表 2 眼刺激性反应分级 可逆眼损伤 2A 级 ( 轻刺激性 ) 2/3 动物的刺激反应积分均值 : 角膜浑浊 1; 虹膜 1; 结膜充血 2; 结膜水肿 2 和上述刺激反应积分在 7 天完全恢复 2B 级 ( 刺激性 ) 2/3 动物的刺激反应积分均值 : 角膜浑浊 1; 虹膜 1; 结膜充血 2;

16 结膜水肿 2 和上述刺激反应积分在 <21 天完全恢复 不可逆眼损伤 任 1 只动物的角膜 虹膜和 / 或结膜刺激反应积分在 21 天的观察期间没有完全恢复 2/3 动物的刺激反应积分均值 : 角膜浑浊 3 和 / 或虹膜 >1.5 表 3 眼刺激性反应分级 可逆眼损伤 微刺激性 动物的角膜 虹膜积分 =0; 结膜充血或结膜水肿积分 2, 且积分在 <7 天内降至 0 轻刺激性 动物的角膜 虹膜 结膜积分在 7 天降至 0 刺激性 动物的角膜 虹膜 结膜积分在 8~21 天内降至 0 不可 1 动物的角膜 虹膜和 / 或结膜积分在第 21 天时 >0;2 2/3 动物的逆眼腐蚀性眼刺激反应积分 : 角膜浑浊 3 和 / 或虹膜 =2 损伤注 : 当角膜 虹膜 结膜积分为 0 时, 可判为无刺激性 表 4 对家兔眼睛刺激性试验结果 实验条件 : 不冲洗 30 秒冲洗 动 眼刺激性反应积分 物编号 部位 样品 1h 24h 48h 72h 4d 7d 对 样 对 样 对 样 对 样 对 照 品 照 品 照 品 照 品 照 样对照品 结 1 膜 虹 膜 角 膜 结 2 膜 虹 膜 角 膜 结 3 膜 虹 膜 角 膜

17 刺激反应分级 9. 试验结果的解释急性眼刺激性试验结果从动物外推到人的可靠性很有限 白色家兔在大多数情况下对有刺激性或腐蚀性的物质较人类敏感 若用其它品系动物进行试验时也得到类似结果, 则会增加从动物外推到人的可靠性 六 皮肤变态反应试验 Skin Sensitisation Test 1 范围本规范规定了动物皮肤变态反应试验的基本原则 要求和方法 本规范适用于化妆品原料及其产品安全性毒理学检测 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No 406, July 1992) USEPA OPPTS Harmonized Test Guidelines (Series , Aug.1998) 3 试验目的确定重复接触化妆品及其原料对哺乳动物是否可引起变态反应及其程度 4 定义 4.1 皮肤变态反应 ( 过敏性接触性皮炎 )(Skin sensitization,allergic contact dermatitis) 是皮肤对一种物质产生的免疫源性皮肤反应 在人类这种反应可能以瘙痒 红斑 丘疹 水疱 融合水疱为特征 动物的反应不同, 可能只见到皮肤红斑和水肿 4.2 诱导接触 (Induction exposure) 指机体通过接触受试物而诱导出过敏状态的试验性暴露 4.3 诱导阶段 (Induction period) 指机体通过接触受试物而诱导出过敏状态所需的时间, 一般至少一周 4.4 激发接触 (Challenge exposure) 机体接受诱导暴露后, 再次接触受试物的试验性暴露, 以确定皮肤是否会出现过敏反应 5 试验的基本原则实验动物通过多次皮肤涂抹 ( 诱导接触 ) 或皮内注射受试物 10d~14d( 诱导阶段 ) 后, 给予激发剂量的受试物, 观察实验动物并与对照动物比较对激发接触受试物的皮肤反应强度 5.1 实验动物和饲养环境一般选用健康 成年雄性或雌性豚鼠, 雌性动物应选用未孕或未曾产仔的 实验动物及实验动物房应符合国家相应规定 选用常规饲料, 饮水不限制, 需注意补充适量 Vc 5.2 动物试验前准备试验前动物要在实验动物房环境中至少适应 3d~5d 时间 将动物随机分为受试物组和对

18 照组, 按所选用的试验方法, 选择适当部位给动物备皮 ( 去毛 ), 避免损伤皮肤 试验开始和结束时应记录动物体重 5.3 无论在诱导阶段或激发阶段均应对动物进行全面观察包括全身反应和局部反应, 并作完整记录 5.4 试验方法可靠性的检查使用已知的能引起轻度 / 中度致敏的阳性物每隔半年检查一次 局部封闭涂皮法至少有 30% 动物出现皮肤过敏反应 ; 皮内注射法至少有 60% 动物出现皮肤过敏反应 阳性物一般采用 2,4- 二硝基氯代苯, 肉桂醛,2- 巯基苯并噻唑或对氨基苯酸乙酯 6 试验方法 6.1 局部封闭涂皮试验 (Buehler Test, BT) 动物数试验组至少 20 只, 对照组至少 10 只 剂量水平诱导接触受试物浓度为能引起皮肤轻度刺激反应的最高浓度, 激发接触受试物浓度为不能引起皮肤刺激反应的最高浓度 试验浓度水平可以通过少量动物 (2~3 只 ) 的预试验获得 水溶性受试物可用水或用无刺激性表面活性剂作为赋形剂, 其它受试物可用 80% 乙醇 ( 诱导接触 ) 或丙酮 ( 激发接触 ) 作赋形剂 试验步骤 试验前约 24 h, 将豚鼠背部左侧去毛, 去毛范围为 4 cm 2 ~6 cm 诱导接触 : 将受试物约 0.2mL(g) 涂在实验动物去毛区皮肤上, 以二层纱布和一层玻璃纸覆盖, 再以无刺激胶布封闭固定 6 h 第 7d 和第 14d 以同样方法重复一次 激发接触 : 末次诱导后 14~28d, 将约 0.2mL 的受试物涂于豚鼠背部右侧 2cm 2cm 去毛区 ( 接触前 24h 脱毛 ), 然后用二层纱布和一层玻璃纸覆盖, 再以无刺激胶布固定 6h 激发接触后 24h 和 48h 观察皮肤反应, 按表 1 评分 试验中需设阴性对照组, 使用 和 的方法, 在诱导接触时仅涂以溶剂作为对照, 在激发接触时涂以受试物 对照组动物必须和受试物组动物为同一批 在实验室开展变态反应试验初期, 或使用新的动物种属或品系时, 需同时设阳性对照组 表 1 变态反应试验皮肤反应评分 皮肤反应 积 分 红斑和焦痂形成 无红斑 0 轻微红斑 ( 勉强可见 ) 1 明显红斑 ( 散在或小块红斑 ) 2 中度 ~ 重度红斑 3 严重红斑 ( 紫红色 ) 至轻微焦痂形成 4 水肿形成 无水肿 0 轻微水肿 ( 勉强可见 ) 1 中度水肿 ( 皮肤隆起轮廓清楚 ) 2

19 重度水肿 ( 皮肤隆起约 1mm 或超过 1mm) 3 最高积分 结果评价 当受试物组动物出现皮肤反应积分 2 时, 判为该动物出现皮肤变态反应阳性, 按表 3 判定受试物的致敏强度 如激发接触所得结果仍不能确定, 应于第一次激发后一周, 给予第二次激发, 对照组作同步处理或按 6.2 的方法进行评价 6.2 豚鼠最大值试验 (Guinea Pig Maximinatim Test, GPMT) 采用完全福氏佐剂 (Freund Complete Adjvant, FCA) 皮内注射方法检测致敏的可能性 动物数试验组至少用 10 只, 对照组至少 5 只 如果试验结果难以确定受试物的致敏性, 应增加动物数, 试验组 20 只, 对照组 10 只 剂量水平诱导接触受试物浓度为能引起皮肤轻度刺激反应的最高浓度, 激发接触受试物浓度为不能引起皮肤刺激反应的最高浓度 试验浓度水平可以通过少量动物 (2~3 只 ) 的预试验获得 试验步骤 诱导接触 ( 第 0d) 受试物组 : 将颈背部去毛区 (2cm 4cm) 中线两侧划定三个对称点, 每点皮内注射 0.1mL 下述溶液 第 1 点 1:1(V/V)FCA/ 水或生理盐水的混合物第 2 点耐受浓度的受试物第 3 点用 1:1(v/v)FAC/ 水或生理盐水配制的受试物, 浓度与第 2 点相同对照组 : 注射部位同受试物组第 1 点 1:1(V/V)FCA/ 水或生理盐水的混合物第 2 点未稀释的溶剂第 3 点用 1:1(v/v)FAC/ 水或生理盐水配制的浓度为 50%(w/v) 的溶剂 诱导接触 ( 第 7d): 将涂有 0.5g(mL) 受试物的 2cm 4cm 滤纸敷贴在上述再次去毛的注射部位, 然后用两层纱布, 一层玻璃纸覆盖, 无刺激胶布封闭固定 48h 对无皮肤刺激作用的受试物, 可加强致敏, 于第二次诱导接触前 24h 在注射部位涂抹 10% 十二烷基硫酸钠 (SLS)0.5mL 对照组仅用溶剂作诱导处理 激发接触 ( 第 21d) 将豚鼠躯干部去毛, 用涂有 0.5g(mL) 受试物的 2cm 2cm 滤纸片敷贴在去毛区, 然后再用两层纱布, 一层玻璃纸覆盖, 无刺激胶布封闭固定 24h 对照组动物作同样处理 如激发接触所得结果不能确定, 可在第一次激发接触一周后进行第二次激发接触 对照组作同步处理 观察及结果评价

20 激发接触结束, 除去涂有致敏率 % 致敏强度受试物的滤纸后 和 72h, 0~ 8 弱观察皮肤反应, ( 如需要清除 9~ 28 轻受试残留物可用水或选用不 29~ 64 中改变皮肤已有 65~ 80 强反应和不损伤皮肤的溶剂 ) 按 81~100 极强表 2 评分 当受试物组动物皮肤反应积分 1 时, 应判为变态反应阳性, 按表 3 对受试物进行致敏强度分级 表 2 变态反应试验皮肤反应评分 0 = 未见皮肤反应 1 = 散在或小块红斑 2 = 中度红斑和融合红斑 3 = 重度红斑和水肿 表 3 致敏强度 注 : 当致敏率为 0 时, 可判为未见皮肤变态反应 7 试验报告报告应包括如下内容 : (1) 受试物名称 理化性状 配制方法 所用浓度 ; (2) 实验动物的种属 品系 来源 ( 注明合格证号和动物级别 ) 性别 数量; (3) 实验动物饲养环境, 包括饲料来源 室温 相对湿度 实验动物房合格证号 ; (4) 试验方法 ; (5) 试验开始和结束时动物体重 ; (6) 结果 : 以表格形式报告各组动物皮肤反应情况和致敏率等 ( 建议的表格形式见表 4 5); (7) 结论 表 4 对豚鼠皮肤变态反应试验结果 (BT 法 ) 组别 动物数 诱导剂量 激发剂量 观察时间 皮肤反应强度红斑 水肿 (h) 的动物数 % 阴性 24 对照 48 受试 24 物组 48 阳性 24

21 对照 48 注 : 在皮肤反应强度栏中应填写当皮肤反应积分为 时, 发生反应的动物数占受试动物数的比例, 阳性对照试验日期 : 表 5 对豚鼠皮肤变态反应试验结果 (GPMT 法 ) 组别 动物数诱导剂量 激发剂量 观察皮肤反应强度时间 (h) 的动物数 % 阴性 对照 受试 物组 阳性 对照 注 : 在皮肤反应强度栏中应填写当皮肤反应积分为 时, 发生反应的动物数占受试动物数的比例, 阳性对照试验日期 : 8 试验结果的解释试验结果应能得出受试物的致敏能力和强度 这些结果只能在很有限的范围内外推到人类 引起豚鼠强烈反应的物质在人群中也可能引起一定程度的变态反应, 而引起豚鼠较弱反应的物质在人群中也许不能引起变态反应 七 皮肤光毒性试验 Skin Phototoxicity Test 1 范围本规范规定了皮肤光毒性试验的基本原则, 要求和方法 本规范适用于化妆品原料及其产品安全性毒理学检测 2 试验目的评价化妆品原料及其产品引起皮肤光毒性的可能性 3 定义光毒性 (Phototoxicity): 皮肤一次接触化学物质后, 继而暴露于紫外线照射下所引发的一种皮肤毒性反应, 或者全身应用化学物质后, 暴露于紫外线照射下发生的类似反应 4 试验的基本原则将一定量受试物涂抹在动物背部去毛的皮肤上, 经一定时间间隔后暴露于 UVA 光线下, 观察受试动物皮肤反应并确定该受试物有否光毒性 5 试验方法 5. 1 受试物液体受试物一般不用稀释, 可直接使用原液 若受试物为固体, 应将其研磨成细粉状并用水或其它溶剂充分湿润, 在使用溶剂时, 应考虑到溶剂对受试动物皮肤刺激性的影响 对于化妆品产品而言, 一般使用原霜或原液 阳性对照物选用 8- 甲氧基补骨脂 (8-methoxypsoralen,8-Mop) 5. 2 实验动物和饲养条件

22 使用成年白色家兔或白化豚鼠, 尽可能雌雄各半 选用 6 只动物进行正式试验 试验前 动物要在实验动物房环境中至少适应 3d~5d 时间 实验动物及实验动物房应符合国家相应规定 选用常规饲料, 饮水不限制, 需注意补充 适量 Vc 5. 3 UV 光源 UV 光源 : 波长为 320nm~400nm 的 UVA, 如含有 UVB, 其剂量不得超过 0.1J/cm 强度的测定 : 用前需用辐射计量仪在实验动物背部照射区设 6 个点测定光强度 (mw/cm 2 ), 以平均值计 照射时间的计算 : 照射剂量为 10J/cm 2, 按下式计算照射时间 2 照射剂量 (10000mJ / cm ) 照射时间 ( 秒 ) = 2 光强度 (mj / cm / sec) 注 :1 mw/cm 2 = 1 mj/cm 2 /sec 5.4 试验步骤 进行正式光毒试验前 18h~24h, 将动物脊柱两侧皮肤去毛, 试验部位皮肤需完好, 无损伤及异常 备 4 块去毛区 ( 见图 1), 每块去毛面积约为 2cm 2cm 将动物固定, 按表 1 所示, 在动物去毛区 1 和 2 涂敷 0.2mL(g) 受试物 所用受试物浓度不能引起皮肤刺激反应 ( 可通过预试验确定 ),30min 后, 左侧 ( 去毛区 1 和 3) 用铝箔复盖, 胶带固定, 右侧用 UVA 进行照射 结束后分别于 和 72h 观察皮肤反应, 根据表 2 判定每只动物皮肤反应评分 为保证试验方法的可靠性, 至少每半年用阳性对照物检查一次 即在去毛区 1 和 2 涂阳性对照物, 方法同 图 1 动物皮肤去毛区位置示意图表 1 动物去毛区的试验安排 去毛区编号试验处理 1 涂受试物, 不照射 2 涂受试物, 照射 3 不涂受试物, 不照射 4 不涂受试物, 照射 表 2 皮肤刺激反应评分 皮肤反应 积 分 红斑和焦痂形成 无红斑 0 轻微红斑 ( 勉强可见 ) 1 明显红斑 2 中度 ~ 重度红斑 3 严重红斑 ( 紫红色 ) 至轻微焦痂形成 4

23 水肿形成 无水肿 0 轻微水肿 ( 勉强可见 ) 1 轻度水肿 ( 皮肤隆起轮廓清楚 ) 2 中度水肿 ( 皮肤隆起约 1mm) 3 重度水肿 ( 皮肤隆起超过 1mm, 范围扩大 ) 4 最高积分 8 6 结果评价单纯涂受试物而未经照射区域未出现皮肤反应, 而涂受试物后经照射的区域出现皮肤反应分值之和为 2 或 2 以上的动物数为 1 只或 1 只以上时, 判为受试物具有光毒性 7 试验报告报告应包括下列内容 : (1) 受试物名称 理化性状 配制方法 所用浓度 ; (2) 动物种属 品系 性别 体重 来源 ( 注明合格证号和动物级别 ); (3) 实验动物饲养环境, 包括饲料来源 室温 相对湿度 实验动物房合格证号 ; (4) 光源的生产厂 规格 ; (5) 光强度和照射时间以及试验方法 ; (6) 结果 : 以列表方式报告动物出现皮肤反应的积分 ( 见表 3 和表 4); (7) 结论 表 3 对豚鼠皮肤光毒性试验结果 动物编号 性别 体重 (g) 1h h 皮肤反应积分 48h 注 :1,2,3,4 为表 1 所示试验区 表 4 阳性对照物对豚鼠皮肤光毒性试验结果 72h 动物编号 性别 体 (g) 重 1h h 皮肤反应积分 48h 注 :1,2,3,4 为表 1 所示试验区 实验日期 : 72h 八 鼠伤寒沙门氏菌 / 回复突变试验 Salmonella Typhimurium / Reverse Mutation Assay 1 范围本规范确定了鼠伤寒沙门氏菌 / 回复突变试验的基本原则 要求和方法 本规范适用于化妆品原料及其产品的基因突变检测

24 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No.471,Adopted:21,July 1997) 3 定义 3.1 回复突变 (Reverse mutation) 细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型 (prototroph) 3.2 基因突变 (Gene mutation) 在化学致突变物作用下细胞 DNA 中碱基对的排列顺序发生变化 3.3 碱基置换突变 (Base substitution mutation) 引起 DNA 链上一个或几个碱基对的置换 碱基置换有转换 (transition) 和颠换 (transversion) 两种形式 转换是 DNA 链上的一个嘧啶被另一嘧啶所替代, 或一个嘌呤被另一嘌呤所代替 颠换是 DNA 链上的一个嘧啶被另一嘌呤所替代, 或一个嘌呤被另一嘧啶所代替 3.4 移码突变 ( Frameshift mutation) 引起 DNA 链上增加或缺失一个或多个碱基对 3.5 鼠伤寒沙门氏菌 / 回复突变试验 ( Salmonella typhimurium/reverse mutation assay) 利用一组鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型试验菌株测定引起沙门氏菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的组氨酸缺陷型 (his-) 原养型 (his+) 回复突变的试验方法 3.6 S9 经多氯联苯 (PCB 混合物 ) 或苯巴比妥钠和 β- 萘黄酮结合诱导的大鼠制备肝匀浆, 在 9000g 下离心 10min 后的肝匀浆上清液 4 原理鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸, 故在缺乏组氨酸的培养基上, 仅少数自发回复突变的细菌生长 假如有致突变物存在, 则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型, 因而能生长形成菌落, 据此判断受试物是否为致突变物 某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变, 故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的 S9 混合液 5 仪器和设备培养箱 恒温水浴 振荡水浴摇床 压力蒸汽消毒器 干热烤箱 低温冰箱 (-80 ) 或液氮生物容器 普通冰箱 天平 ( 精密度 0.1g 和 g) 混匀振荡器 匀浆器 菌落计数器 低温高速离心机, 玻璃器皿等 6 培养基和试剂 mmol/L 组氨酸 -0.5mmol/L 生物素溶液成分 : L- 组氨酸 (MW 155) 78mg D- 生物素 (MW 244) 122mg 加蒸馏水至 1000mL 配制 : 将上述成分加热, 以溶解生物素, 然后在 0.068MPa 下高压灭菌 20min 贮于 4 冰箱 6.2 顶层琼脂培养基成分 : 琼脂粉 1.2g 氯化钠 1.0g 加蒸馏水至 200mL

25 配制 : 上述成分混合后, 于 0.103MPa 下高压灭菌 30min 实验时, 加入 0.5mmol/L 组氨酸 0.5mmol/L 生物素溶液 20mL 6.3 Vogel-Bonner (V-B) 培养基 E 成分 : 枸椽酸 (C6H8O7 H2O) 100g 磷酸氢二钾 (K2HPO4) 500g 磷酸氢铵钠 (NaNH4HPO4 4H2O) 175g 硫酸镁 (MgSO4 7H2O) 10g 加蒸馏水至 1000mL 配制 : 先将前三种成分加热溶解后, 再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中, 加蒸馏水至 1000mL 于 0.103MPa 下高压灭菌 30min 储于 4 冰箱 % 葡萄糖溶液成分 : 葡萄糖 200g 加蒸馏水至 1000mL 配制 : 加少量蒸馏水加温溶解葡萄糖, 再加蒸馏水至 1000mL 于 0.068MPa 下高压灭菌 20min 储于 4 冰箱 6.5 底层琼脂培养基成分 : 琼脂粉 7.5g 蒸馏水 480mL V-B 培养基 E 10mL 20% 葡萄糖溶液 10mL 配制 : 首先将前两种成分于 0.103MPa 下高压灭菌 30min 后, 再加入后两种成分, 充分混匀倒底层平板 按每皿 25mL 制备平板, 冷凝固化后倒置于 37 培养箱中 24h, 备用 6.6 营养肉汤培养基成分 : 牛肉膏 2.5g 胰胨 5.0g 磷酸氢二钾 (K2HPO4) 1.0g 加蒸馏水至 500mL 配制 : 将上述成分混合后, 于 0.103MPa 下高压灭菌 30min 储于 4 冰箱 6.7 盐溶液 (1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2) 成分 : 氯化钾 (KCl) 61.5g 氯化镁 (MgCl2 6H2O) 40.7g 加蒸馏水至 500mL 配制 : 在水中溶解上述成分后, 于 0.103MPa 下高压灭菌 30min 储于 4 冰箱 mol/L 磷酸盐缓冲液 (ph7.4) 成分 : 磷酸二氢钠 (NaH2PO4 2H2O) 2.965g 磷酸氢二钠 (Na2HPO4 12H2O) g 加蒸馏水至 500mL 配制 : 溶解上述成分后, 于 0.103MPa 下高压灭菌 30min 储于 4 冰箱 6.9 S9 混合液成分每毫升 S9 混合液 肝 S9 100μl

26 盐溶液 20μl 灭菌蒸馏水 380μl 0.2mol/L 磷酸盐缓冲液 500μl 辅酶 II(NADP) 4μmol 6- 磷酸葡萄糖 (G-6-P) 5μmol 配制 : 将辅酶 II 和 6- 磷酸葡萄糖置于灭菌三角瓶内称重, 然后按上述相反的次序加入各种成分, 使肝 S9 加到已有缓冲液的溶液中 该混合液必须临用现配, 并保存于冰水浴中 实验结束, 剩余 S9 混合液应该丢弃 6.10 菌株鉴定用和特殊用途试剂 组氨酸 生物素平板成分 : 琼脂粉 15g 蒸馏水 944mL (V-B) 培养基 E 20mL 20% 葡萄糖 20mL 灭菌盐酸组氨酸水溶液 (0.5g/100mL) 10mL 灭菌 0.5mmol/L 生物素溶液 6mL 配制 : 高压灭菌琼脂和水后, 将灭菌 20% 葡萄糖,V-B 培养基和组氨酸溶液加进热的琼脂溶液中 待溶液稍为冷却后, 加入灭菌生物素, 混匀, 浇制平板 氨苄青霉素平板和氨苄青霉素 / 四环素平板成分 : 琼脂粉 15g 蒸馏水 940mL (V-B) 盐溶液 20mL 20% 葡萄糖 20mL 灭菌盐酸组氨酸溶液 (0.5g/100mL) 10mL 灭菌 0.5mmol/L 生物素溶液 6mL 氨苄青霉素溶液 (8mg/mL 于 0.02mol/LNaOH 中 ) 3.15mL 四环素溶液 (8mg/mL 于 0.02mol/L HCl 中 ) 0.25mL 配制 : 琼脂和水高压灭菌 20min, 将无菌的葡萄糖 VB 盐溶液和组氨酸 生物素溶液加进热的溶液中去, 混匀 冷却至大约 50, 无菌条件下加入四环素溶液和 / 或氨苄青霉素溶液 应该在倾注琼脂平板后几天内, 制备主平板 营养琼脂平板成份 : 琼脂粉 7.5g 营养肉汤培养基 500mL 配制 : 于 0.103MPa 下高压灭菌 30min 后倾注平板 7 试验菌株及其生物学特性鉴定 7.1 试验菌株采用 TA97 TA98 TA100 和 TA102 一组标准测试菌株 7.2 生物学特性鉴定新获得的或长期保存的菌种, 在试验前必须进行菌株的生物特性鉴定 菌株鉴定的判断标准, 如表 1 所示 表 1 试验菌株鉴定的判断标准

27 菌株 组氨酸缺陷 脂多糖屏障缺损 氨苄青霉素抗性 切除修复缺损 四环素抗性 自发回变菌落数 * TA TA TA TA * 在体外代 + 表示 + 表示 + 表示 + 表示 + 表示 谢活化条 注 需要组氨 具有 rfa 具有 R 因 具有 具有 paq1 件下自发 酸 突变 子 uvrb 突变 质粒 回变菌落 数略增 组氨酸缺陷原理 : 组氨酸缺陷型试验菌株本身不能合成组氨酸, 只能在补充组氨酸的培养基上生长, 而在缺乏组氨酸的培养基上, 则不能生长 鉴定方法 : 将测试菌株增菌液分别于含组氨酸培养基平板和无组氨酸平板上划线, 于 37 下培养 24h 后观察结果 结果判断 : 组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上生长, 而在无组氨酸平板上则不能生长 脂多糖屏障缺损原理 : 具有深粗糙 (rfa) 的菌株, 其表面一层脂多糖屏障缺损, 因此一些大分子物质如结晶紫能穿透菌膜进入菌体, 从而抑制其生长, 而野生型菌株则不受其影响 鉴定方法 : 吸取待测菌株增菌液 0.1mL 于营养琼脂平板上划线, 然后将浸湿的 0.1% 结晶紫溶液滤纸条与划线处交叉放置 37 下培养 24h 后观察结果 结果判断 : 假若待测菌在滤纸条与划线交叉处出现一透明菌带, 说明该待测菌株具有 rfa 突变 氨苄青霉素抗性原理 : 含 R 因子的试验菌株对氨苄青霉素有抗性 因为 R 因子不太稳定, 容易丢失, 故用氨苄青霉素确定该质粒存在与否 鉴定方法 : 吸取待测菌株增菌液 0.1mL, 在氨苄青霉素平板上划线,37 下培养 24h 后观察结果 结果判断 ; 假若测试菌在氨苄青霉素平板上生长, 说明该测试菌具有抗氨苄青霉素作用, 表示含 R 因子, 否则, 表示测试菌不含 R 因子或 R 因子丢失 紫外线敏感性原理 : 具有 uvrb 突变的菌株对紫外线敏感, 当受到紫外线照射后, 不能生长, 而具有野生型切除修复酶的菌株, 则能照常生长 鉴定方法 : 吸取待测菌株增菌液 0.1mL 于营养琼脂平板上划线, 用黑纸盖住平板的一半, 置紫外灯下照射 (15W, 距离 33cm)8 秒钟 置 37 下孵育 24h 后观察结果 结果判断 : 具有 uvrb 突变的菌株对紫外线敏感, 经辐射后细菌不生长, 而具有完整的切除修复系统的菌株, 则照常生长 四环素抗性原理 : 具有 paqi 的菌株对四环素有抗性

28 鉴定方法 : 吸取待测菌株增菌液 0.1mL 于氨苄青霉素 / 四环素平板上划线, 置 37 下孵 育 24h 后观察结果 结果判断 : 假若测试菌照常在氨苄青霉素 / 四环素平板上生长, 表明该测试菌株对氨苄 青霉素和四环素两者有抗性, 具有 paqi 质粒, 否则, 说明测试菌株不含 paqi 质粒 自发回变原理 : 每种试验菌株都以一定的频率自发地产生回变, 称为自发回变 这种自发回变是每种试验菌株的一项特性 鉴定方法 : 将待测菌株增菌液 0.1mL 加到 2mL 含组氨酸 生物素的顶层琼脂培养基的试管内, 混匀后铺到于底层琼脂平板上, 待琼脂固化后, 置 37 培养箱中孵育 48h 后记数每皿回变菌落数 结果判断 : 每种标准测试菌株的自发回变菌落数应符合表 1 要求 经体外代谢活化后的自发回变菌落数, 要比直接作用下的略高 回变特性 诊断性试验原理 : 每种试验菌株对诊断性诱变剂回变作用的性质以及 S9 混合液的效应不一 鉴定方法 : 按照平板掺入试验的操作步骤进行 将受试物换成诊断性诱变剂 结果判断 : 标准菌株对某些诊断性诱变剂特有的回变结果参见表 2 表 2 测试菌株的回变性 诱变剂 剂量 S9 TA97 TA98 TA100 TA102 (μg) 柔毛霉素叠氮化钠 ICR inh inh inh 2230 链霉黑素 inh inh inh 2772 丝裂霉素 C ,4,7- 三硝基 -9- 芴酮 4- 硝基 -O- 次苯二胺 4- 硝基喹啉 -N- 氧化物甲基磺酸甲酯 2- 氨基芴苯并 (a) 芘 注 :inh 表示抑菌 表中数值均已扣除溶剂对照回变菌落数 8 大鼠肝微粒体酶的诱导和 S9 的制备 8.1 诱导 最广泛应用的大鼠肝微粒体酶的诱导剂是多氯联苯 (PCB 混合物 ), 选择健康雄性大鼠体 重 200g 左右, 一次腹腔注射诱导剂, 剂量为 500mg/kg 体重 诱导剂溶于玉米油中, 浓度为 200mg/mL 苯巴比妥钠和 β- 萘黄酮结合也可做为诱导剂 8.2 S9 制备 动物诱导后第五日断头处死 处死前 12h 停止饮食, 但可自由饮水 首先, 用 75% 酒精 消毒动物皮毛, 剖开腹部 在无菌条件下, 取出肝脏, 去除肝脏的结缔组织, 用冰浴的

29 0.15mol/L 氯化钾溶液淋洗肝脏, 放入盛有 0.15mol/L 氯化钾溶液的烧杯里 按每克肝脏加入 0.15mol/L 氯化钾溶液 3mL 用电动匀浆器制成肝匀浆, 再在低温高速离心机上, 在 4 条件下, 以 9000g 离心 10min, 取其上清液 (S9) 分装于塑料管中 每管装 2 ml ~3 ml 储存于液氮生物容器中或 -80 冰箱中备用 上述全部操作均在冰水浴中和无菌条件下进行 制备肝 S9 所用一切手术器械 器皿等, 均经灭菌消毒 S9 制备后, 其活力需经诊断性诱变剂进行鉴定 9 溶剂的选择如果受试物为水溶性, 可用灭菌蒸馏水作为溶剂 ; 如为脂溶性, 应选择对试验菌株毒性低且无致突变性的有机溶剂, 常用的有二甲基亚砜 (DMSO) 丙酮 95% 乙醇 一般操作中, 为了减少误差和溶剂的影响, 常按每皿使用剂量用同一溶剂配成不同的浓度, 固定加入量为 100μl 10 剂量的设计决定受试物最高剂量的标准是对细菌的毒性及其溶解度 自发回变数的减少, 背景菌变得清晰或被处理的培养物细菌存活数减少, 都是毒性的标志 对原料而言, 一般最高剂量组可为 5mg/ 皿 对产品而言, 有杀菌作用的受试物, 最高剂量可为最低抑菌浓度, 无杀菌作用的受试物, 最高剂量可为原液 受试物至少应设四个剂量组 每个剂量均做三个平行平板 11 试验操作步骤 11.1 增菌培养取营养肉汤培养基 5mL, 加入无菌试管中, 将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内,37 振荡 (100 次 /min) 培养 10h 该菌株培养物应每毫升不少于 1~ 活菌数 11.2 平板掺入法实验时, 将含 0.5mmol/L 组氨酸 -0.5mmol/L 生物素溶液的顶层琼脂培养基 2.0mL 分装于试管中,45 水浴中保温, 然后每管依次加入试验菌株增菌液 0.1mL, 受试物溶液 0.1mL 和 S9 混合液 0.5mL( 需代谢活化时 ), 充分混匀, 迅速倾入底层琼脂平板上, 转动平板, 使之分布均匀 水平放置待冷凝固化后, 倒置于 37 培养箱里孵育 48h 记数每皿回变菌落数 实验中, 除设受试物各剂量组外, 还应同时设空白对照 溶剂对照 阳性诱变剂对照和无菌对照 12 数据处理和结果判断记录受试物各剂量组 空白对照 ( 自发回变 ) 溶剂对照以及阳性诱变剂对照的每皿回变菌落数, 并求平均值和标准差 如果受试物的回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的两倍或两倍以上, 并呈剂量 - 反应关系者, 则该受试物判定为致突变阳性 受试物经上述四个试验菌株测定后, 只要有一个试验菌株, 无论在加 S9 或未加 S9 条件下为阳性, 均可报告该受试物对鼠伤寒沙门氏菌为致突变阳性 如果受试物经四个试验菌株检测后, 无论加 S9 和未加 S9 均为阴性, 则可报告该受试物为致突变阴性 13 试验报告试验报告应包括以下内容 : (1) 受试物名称 理化性状 配制方法 使用溶剂 ; (2) 试验菌株 : 所用试验菌株 ;

30 (3) 代谢活化系统 : 所用诱导剂 ; (4) 试验方法 : 简述操作步骤, 除受试物剂量分组外, 还应说明空白对照 溶剂对照和阳性对照, 阳性结果判定标准 ; (5) 结果 : 以列表方式报告受试物的 Ames 实验结果 ( 表 1); (6) 结论 表 1 Ames 试验菌株的回变结果 ( 平均值 ± 标准差 ) 剂量 TA97 TA98 TA100 TA102 组别 (mg/ -( S9) -( S9) -( S9) -( S9) 皿 ) +( S9) +( S9) +( S9) +( S9) 受试物 自发回变 溶剂对照 阳性物对照 九 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test 1 范围本规范规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则 要求和方法 本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997) 3 试验目的本试验是用于检测培养的哺乳动物细胞染色体畸变, 以评价受试物致突变的可能性 4 定义染色体型畸变 (Chromosome-type aberration): 染色体结构损伤, 表现为在两个染色单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变 染色单体型畸变 (Chromatid-type aberration): 染色体结构损伤, 表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤 染色体数目改变 (Numerical aberration): 所用细胞株的正常染色体数目的变化 结构畸变 (Structural aberration): 在细胞分裂的中期相阶段, 用显微镜检出的染色体结构改变, 表现为缺失 断片 互换等 有丝分裂指数 (Mitotic index): 中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值 ; 是一项反映细胞增殖程度的指标 5 试验基本原则

31 在加入和不加入代谢活化系统的条件下, 使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中 用中期分裂相阻断剂 ( 如秋水仙素或秋水仙胺 ) 处理, 使细胞停止在中期分裂相, 随后收获细胞, 制片, 染色, 分析染色体畸变 6 试验方法 6.1 试剂和受试物制备 阳性对照物 : 可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物, 阳性对照物应是已知的断裂剂, 能引起可检出的 并可重复的阳性结果 当外源性活化系统不存在时, 可使用甲磺酸甲酯 ( methyl methanesulphonate (MMS) ) 甲磺酸乙酯 ( ethyl methanesulphonate(ems)) 乙基亚硝基脲(ethyl nitrosourea) 丝裂霉素 C(mitomycin C) 4- 硝基喹啉 -N- 氧化物 (4-nitroquinoline-N-oxide) 当外源性活化系统存在时, 可使用苯并 (a) 芘 [benzo(a)pyrene] 环磷酰胺(cyclophosphamide) 阴性对照物 : 应设阴性对照, 即仅含和受试物组相同的溶剂, 不含受试物, 其它处理和受试物组完全相同 此外, 如未能证实所选溶剂不具有致突变性, 溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异, 还应设空白对照 受试物 受试物的配制 : 固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中, 用前稀释至适合浓度 ; 液体受试物可以直接加入试验系统和 / 或用前稀释至适合浓度 受试物应在使用前新鲜配制, 否则就必须证实贮存不影响其稳定性 溶剂的选择 : 溶剂必须是非致突变物, 不与受试物发生化学反应, 不影响细胞存活和 S9 活性 首选溶剂是培养液 ( 不含血清 ) 或水 二甲基亚砜 (DMSO) 也是常用溶剂, 使用时浓度不应大于 0.5% 受试物浓度设置 (1) 最高浓度的选择 : 决定最高浓度的因素是细胞毒性 受试物在试验系统中的溶解度以及 ph 或渗克分子浓度 (osmolality) 的改变 (2) 细胞毒性的确定 : 应使用指示细胞完整性和生长情况的指标, 在活化系统存在或不存在的两种条件下确定细胞毒性, 例如细胞覆盖程度 (degree of confluency) 存活细胞计数(viable cell counts) 或有丝分裂指数 (mitotic index) 应在预试验中确定细胞毒性和溶解度 (3) 剂量设置 :1 至少应设置 3 个可供分析的浓度 当有细胞毒性时, 其浓度范围应包括从最大毒性至几乎无毒性 ; 通常浓度间隔系数不大于 2 ~ 10 2 在收获细胞时, 最高浓度应能明显降低细胞覆盖程度 细胞计数或有丝分裂指数 ( 均应大于 50%) 3 对于那些相对无细胞毒性的化合物, 最高浓度应是 5μl/mL, 5mg/mL 或 0.01mol/L 4 对于相对不溶解的物质, 当浓度低于不溶解浓度时仍无毒性, 则最高剂量应是, 当处理期结束时, 在最终培养液中溶解度限值以上的一个浓度 在某些情况下 ( 即仅当高于最低不溶解浓度时才发生细胞毒性 ), 应使用一个以上可看见沉淀的浓度 最好在试验处理开始和结束时均评价溶解度, 因为由于细胞 S9 等的存在, 在试验系统内在暴露过程中溶解度可能变化 不溶

32 解性可用肉眼鉴别, 但沉淀不能影响观察 培养液 : 采用 MEM(Eagle), 并加入非必需氨基酸和抗菌素 ( 青 链霉素, 按 100IU/mL), 胎牛血清或小牛血清按 10% 加入 也可选用其它合适的培养液 活化系统通常使用的是 S9 混合物 (S9 mix) S9 是从经酶诱导剂 (Aroclor 1254 或苯巴比妥钠和 β- 萘黄酮联合使用 ) 处理的啮齿动物肝脏获得的 S9 的制备同 Ames 试验 S9 的使用浓度为 1%~10%( 终浓度 ) S9 mix 中所加辅助因子的量由各实验室自行决定, 但需对 S9mix 的活性进行鉴定, 必须能明显活化阳性对照物 也可使用下述 S9 MgC12 (0.4 mol/l) KC1(1.65mol/L) 葡萄糖 -6- 磷酸辅酶 Ⅱ( 氧化型,NADP) 用无血清 MEM 培养液补足至 1mL. 6.2 试验步骤 0.125ml 0.02 ml 0.02 ml 1.791mg mg 细胞 : 使用中国地鼠卵巢 (CHO) 细胞株或中国地鼠肺 (CHL) 细胞株 试验时, 应同时设阳性对照物, 阴性对照物和至少 3 个可供分析的受试物浓度组 试验前一天, 将一定数量的细胞接种于培养皿 ( 瓶 ) 中, 放 CO2 培养箱内培养 试验需在加入和不加入 S9 mix 的条件下进行 试验时, 吸去培养皿 ( 瓶 ) 中的培养液, 加入一定浓度的受试物 S9 mix( 不加 S9 mix 时, 需用培养液补足 ) 以及一定量不含血清的培养液, 放培养箱中处理 2h~6h 结束后, 吸去含受试物的培养液, 用 Hanks 液洗细胞 3 次, 加入含 10% 胎牛血清的培养液, 放回培养箱, 于 24h 内收获细胞 于收获前 2h~4h, 加入细胞分裂中期阻断剂 ( 如用秋水仙素, 作用时间为 4h, 终浓度为 1μg/mL) 当受试物为原料时, 如果在上述加入和不加入 S9 mix 的条件下均获得阴性结果, 则尚需补加另外的试验, 即在不加 S9 mix 的条件下, 使受试物与试验系统的接触时间延长至 24h 当难以得出明确结论时, 应更换试验条件, 如改变代谢活化条件 受试物与试验系统接触时间等重复试验 收获细胞时, 用 0.25% 胰蛋白酶溶液消化细胞, 待细胞脱落后, 加入含 10% 胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用, 混匀, 放入离心管以 1000r/min~1200r/min 的速度离心 5min~7min, 弃去上清液, 加入 0.075mol/L KC1 溶液低渗处理, 继而以新配制的甲醇和冰醋酸液 ( 容积比为 3:1) 进行固定 按常规制片, 用姬姆萨染液染色 作染色体分析时, 对每一处理组选 200 个 ( 阳性对照可选 100 个 ) 分散良好的中期分裂相 ( 染色体数为 2n±2) 进行染色体畸变分析 在分析时应记录每一观察细胞的染色体数目, 对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型 6.3 统计处理 : 对染色体畸变细胞率用 X 2 检验, 以评价受试物的致突变性 6.4 结果评价 : 在下列两种情况下可判定受试物在本试验系统中具有致突变性 : (1) 受试物引起染色体结构畸变数的增加具有统计学意义, 并有与剂量相关的增加 (2) 受试物在任何一个剂量条件下, 引起具有统计学意义, 并有可重复性的阳性反应 在评价时应把生物学和统计学意义结合考虑 7 试验报告试验报告应包括以下内容 :

33 (1) 受试物名称 有关的理化性状 所用溶剂及其配制 剂量选择 ( 应说明受试物对细胞毒性的测定方法 溶解情况等 ); (2) 细胞株名称 ; (3) 实验条件和方法 1 代谢活化系统 : 制备 S9 时所用酶的诱导剂 选用的动物品种和来源 S9mix 的配方 ; 2 对照物 : 阳性对照物名称和选用浓度 ; 阴性 ( 溶剂 ) 对照物名称及使用浓度 3 培养液 : 所用培养液名称 血清类别和使用浓度 ; 4 接种时的细胞密度以及所用培养皿 ( 瓶 ) 的规格 ; 5 中期分裂阻断剂 : 名称 所用浓度 作用时间 ; 6 处理时间 : 受试物与试验系统的接触时间 ; 7 简述制片方法 分析的中期分裂相数目 结果评价方法 (4) 结果 1 受试物最高剂量的确定及试验结果 : 细胞毒性的测定 ( 建议的表格见表 1); 溶解情况 ( 建议的表格见表 2); 对 ph 和渗克分子 (osmolality) 浓度的影响 ( 如果有影响 ) 2 各处理组和对照组染色体畸变率 ( 建议的表格见表 3) 3 本实验室的阳性对照组和阴性对照组 ( 常用溶剂, 如 DMSO) 在本实验室历史上的染色体畸变率范围 均值和标准差 ( 说明样品数 ) (5) 结论 表 1 受试物对细胞的毒性 受试物浓度 活细胞计数法 分裂指数法 细胞覆盖 μg/ml 接种细胞数 活细胞数 存活率 计数细 中期分 分裂指数 程度 /ml /ml % 胞数 裂相数 受试物浓度 μg/ml 表 2 受试物在所选溶剂中溶解情况记录 溶剂名称 有否沉淀 ( 轻微可见 ) 表 3 受试物的检测结果 组别 终浓度 观察细胞数畸变细胞数畸变率 (%) μg/ml +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9

34 阴性对照 受试物 阳性对照 8 结果解释阳性结果表明受试物引起培养的哺乳动物体细胞染色体结构畸变 阴性结果表明在本试验条件下, 受试物不引起培养的哺乳动物体细胞染色体结构畸变 十 体外哺乳动物细胞基因突变试验 In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test 1 范围本规范规定了体外哺乳类细胞基因突变试验的基本原则 要求和方法 本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No. 476, 1997) 3 试验目的该测试系统用于检测化妆品原料及其产品引起的突变, 包括碱基对突变 移码突变和缺失等, 从而评价受试物引起突变的可能性 4 定义正向突变 (Forward mutation): 从原型至突变子型的基因突变, 这种突变可引起酶和功能蛋白的改变 突变频率 (Mutant frequency): 所观察到的突变细胞数与存活细胞数之比值 5 试验原理在加入和不加入代谢活化系统的条件下, 使细胞暴露于受试物一定时间, 然后将细胞再传代培养, 突变细胞在含有 6- 硫代鸟嘌呤 ( 6-thioguanine, 6-TG ) 或三氟胸苷 (trifluorothymidine,tft) 的选择性培养液中能继续分裂并形成集落 基于突变集落数, 计算突变频率以评价受试物的致突变性 6 试验方法 6.1 试剂和受试物制备 受试物 受试物的配制 : 固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中, 用前稀释至适合浓度 ; 液体受试物可以直接加入试验系统 / 或用前稀释至适合浓度 受试物应在使用前新鲜配制, 否则就必须证实储存不影响其稳定性 溶剂的选择 : 溶剂必须是非致突变物, 不与受试物发生化学反应, 不影响细胞存活和 S9 活性 首选溶剂是水或水溶性溶剂 二甲基亚砜 (DMSO) 也是常用溶剂, 但使用时浓度不应大于 0.5% 受试物浓度设置 最高浓度的选择 : 决定最高浓度的因素是细胞毒性 受试物在试验系统中的溶解度以及 ph 或渗克分子浓度 (osmolality) 的改变

35 细胞毒性的确定 : 应使用指示细胞完整性和生长情况的指标, 在活化系统存在或不存在两种条件下确定细胞毒性, 例如相对集落形成率或相对细胞总生长情况 (total growth) 应在预试验中确定细胞毒性和溶解度 剂量设置至少应设置 4 个可供分析的浓度 当有细胞毒性时, 其浓度范围应包括从最大毒性至几乎无毒性 通常浓度间隔系数不大于 10 如最高浓度是基于细胞毒性, 那么该浓度组的细胞相对存活率 ( 相对集落形成率 ) 或相对细胞总生长情况应为 10%~20%( 不低于 10%) 对于那些细胞毒性很低的化合物, 最高浓度应是 5µL/mL, 5mg/mL 或 0.0lmol/L 对于相对不溶解的物质, 其最高浓度应达到或超过在细胞培养状态下的溶解度限值 最好在试验处理开始和结束时均评价溶解度, 因为由于 S9 等的存在, 试验系统内在暴露过程中溶解度可能发生变化 不溶解性可用肉眼鉴别, 但沉淀不应影响观察 对照 : 在每一项试验中, 在代谢活化系统存在和不存在的条件下均应设阳性对照和阴性 ( 溶剂 ) 对照 阳性对照 : 当使用代谢活化系统时, 阳性对照物必须是要求代谢活化 并能引起突变的物质 在没有代谢活化系统时, 阳性对照物可使用甲磺酸乙酯 (ethyl methanesulfonate-ems) 甲磺酸甲酯(methyl methanesulphonate,mms), 乙基亚硝基脲 (ethyl nitrosourea-enu) 等 在有代谢活化系统时, 可以使用 3- 甲基胆蒽 ( 3-methylcholanthrene ) 环磷酰胺 ( cyclophosphamide ) N- 亚硝基胍 (N-nitroso-dimethylamine) 7,12- 二甲基苯蒽等 也可使用其他适宜的阳性对照物 阴性对照物 : 阴性对照 ( 包括溶剂对照 ) 除不含受试物外, 其他处理应与受试物相同 此外, 当不具有实验室历史资料证实所用溶剂无致突变作用和无其他有害作用时, 还应设空白对照 细胞 :HPRT 位点突变分析常用中国仓鼠肺细胞株 (V-79) 和中国仓鼠卵巢细胞株 (CHO) TK 位点突变分析常用小鼠淋巴瘤细胞株 (L5178Y) 和人类淋巴母细胞株 (TK6) 培养液 : 应根据实验所用系统和细胞类型来选择适宜的培养基 对于 V-79 或 CHO 细胞, 常用 MEM(Eagle) 培养基加入 10% 胎牛血清和适量抗菌素 对于 L5178Y 或 TK6 细胞, 常用 RPMI 1640 培养基加入 10% 马血清和适量抗菌素 活化系统 : 同体外哺乳类细胞染色体畸变试验 选择剂 :6- 硫代鸟嘌呤 (6-TG): 建议使用终浓度为 5mg/mL 三氟胸苷(TFT): 建议使用终浓度为 3mg/mL 6.2 试验步骤 HPRT 位点突变分析 试验前 1d, 接种细胞于培养瓶中, 置于 37 C 孵箱培养 试验时吸去培养瓶中的培养液, 加入一定浓度的受试物 S9-mix( 不加入 S9-mix 的样品, 用培养液补足 ) 及一定量的不含血清培养液, 置孵箱中处理 3h~6h 后, 吸去培养液, 用 Hank s 液洗细胞三次, 加入含胎牛血清的培养液 在受试物与细胞作用后当天和第 3d 将细胞按低密度分种, 在第 7d 接种细胞, 每个剂量 3 瓶 7d 后染色以测定细胞存活率 另将一定数量细胞接种于每个培养瓶中, 每个剂量 8 瓶,3h 后加入 6-TG( 终浓度为 5mg/mL),10d 后染色, 计数突变细胞集落 试验结果用 x 2 检验进行统计分析

36 6.2.2 TK 位点突变分析 (L5178Y 细胞,96 孔板法 ) 处理 : 取生长良好的细胞, 调整密度为 /ml, 按 1% 体积加入受试物,37 震摇处理 3 小时 离心, 弃上清液, 用 PBS 或不含血清的培养基洗涤细胞 2 遍, 重新悬浮细胞于含 10% 马血清的 RPMI 1640 培养液中, 并调整细胞密度为 /ml PE0(0 天的平板接种效率 ) 测定 : 取适量细胞悬液, 作梯度稀释至 8 个细胞 /ml, 接种 96 孔板 ( 每孔加 0.2 ml, 即平均 1.6 个细胞 / 孔 ), 每个剂量作 1~2 块板,37,5% CO2, 饱和湿度条件下培养 12d, 计数每块平板有集落生长的孔数 表达 : 步骤 所得细胞悬液作 2d 表达培养, 每天计数细胞密度并保持密度在 10 6 /ml 以下 PE2( 第 2d 的平板接种效率 ) 测定 : 第 2d 表达培养结束后, 取适量细胞悬液, 按步骤 作梯度稀释并接种 96 孔板, 培养 12d 后计数每块平板有集落生长的孔数 TFT 抗性突变频率 (MF) 测定 : 第 2d 表达培养结束后, 取适量细胞悬液, 调整细胞密度为 /ml, 加入 TFT( 三氟胸苷, 终浓度为 3µg/mL), 混匀, 接种 96 孔板 ( 每孔加 0.2 ml, 即平均 2000 个细胞 / 孔 ), 每个剂量作 2~4 块板,37,5% CO2, 饱和湿度条件下培养 12d, 计数有突变集落生长的孔数 计算 平板效率 (PE0 和 PE2) -ln(ew/tw) 式中 :EW 为无集落生长的孔数 ;TW 为总孔数 ; PE = 为每孔接种细胞数 相对存活率 (%RS) PE0( 处理 ) 相对存活率 (%RS)= PE0( 对照 ) 突变频率 (MF) MF( 10-6 ) = -ln(ew/tw)/n PE2 式中 :EW 为无集落生长的孔数 ;TW 为总孔数 ; n 为每孔接种细胞数 (2000) 7 结果评价在下列两种情况下可判定受试物在本试验系统中为阳性结果 : (1) 受试物引起突变频率具有统计学意义 并与剂量相关的增加 (2) 受试物在任何一个剂量条件下, 引起具有统计学意义, 并有可重复性的阳性反应 阴性结果的判定需在 %RS 达 ±20%( 即已产生明显细胞毒性 ) 的情况下未见突变频率显著增加时方可作出 在评价时应把生物学和统计学意义结合考虑 阳性结果表明受试物可引起所用哺乳类细胞的基因突变 可重复的阳性剂量 反应关系意义更大 阴性结果表明在本试验条件下, 受试物不引起所用哺乳类细胞的基因突变 8 试验报告试验报告应包括以下内容 : (1) 受试物名称 有关的理化性状 所用溶剂及其配制 剂量选择 ( 应说明受试物对细胞毒性的测定方法 溶解情况等 );

37 (2) 细胞株名称 ; (3) 实验条件和方法 1 代谢活化系统 : 制备 S9 时所用的诱导剂 动物品种和来源 S9mix 的配方 ; 2 对照物 : 阳性对照物名称和使用浓度 ; 阴性 ( 溶剂 ) 对照物名称及使用浓度 ; 3 培养液 : 所用培养液名称 血清类别和使用浓度 ; 4 接种时的细胞密度以及所用培养瓶的规格 ; 5 处理时间 : 受试物与实验系统的接触时间 ; 6 表达时间 ; 7 结果评价方法 (4) 结果 1 受试物最高剂量的确定及结果 : 包括细胞毒性的测定 ; 溶解情况 ; 对 ph 和渗克分子浓度的影响 ( 如果有影响 ) 2 试验结果 : 试验组和对照组的突变频率及统计结果 3 阳性对照组和阴性对照组 ( 包括常用溶剂, 如 DMSO) 在本实验室历史上的突变频率范围 均值和标准差 ( 说明样品数 ) (5) 结论 十一 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验 In Vivo Mammalian Bone Marrow Cell Chromosome Aberration Test 1 范围本规范规定了哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验的基本原则 要求和方法 本规范适用于检测化妆品原料及其产品的遗传毒性 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No. 475, April 1997) 3 试验目的本试验是一项致突变性试验, 检测整体动物骨髓细胞染色体畸变, 以评价受试物致突变的可能性 4 定义染色体型畸变 (Chromosome-type aberration): 染色体结构损伤, 表现为在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组的改变 染色单体型畸变 (Chromatid-type aberration): 染色体结构损伤, 表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤 染色体数目改变 (Numerical-fype aberration): 哺乳动物细胞正常染色体数目的改变 5 试验基本原则使哺乳动物 ( 如大鼠或小鼠 ) 经口或其它适宜途径染毒, 动物处死前用细胞分裂中期阻断剂处理, 处死后制备骨髓细胞染色体标本, 分析染色体畸变 6 试验方法 6.1 实验动物和饲养环境 : 选用健康成年大鼠或小鼠, 每组每种性别至少 5 只 实验动物及实验动物房应符合国家相应规定 6.2 受试物

38 6.2.1 受试物配制 : 固体受试物应溶解或悬浮于适合的溶剂中, 并稀释至一定浓度 液体受试物可直接使用或予以稀释 受试物应在使用前新鲜配制, 否则就必须证实贮存不影响其稳定性 溶剂的选择 : 溶剂在所选用浓度下, 不引起毒性效应, 不与受试物发生化学反应 首选为水溶性溶剂 剂量设置 : 应进行预试验以选择最高剂量 当有毒性时, 可以引起死亡或者抑制骨髓细胞有丝分裂指数 (50% 以上 ) 为指标确定最高剂量 在第一次采集样品时, 需设置 3 个可供分析的剂量, 在第二次采集样品时, 则仅需设置最高剂量组 如果一次剂量为 2000mg/kg 体重时仍未引起毒性效应, 则只设 2000mg/kg 体重剂量组 6.3 对照 : 在每项试验中, 对每种性别均应设阴性对照组和阳性对照组 除不使用受试物外, 其它处理与受试物组一致 阴性对照 : 除设溶剂对照 ( 即仅含溶剂 ) 外, 如果没有文献资料或历史性资料证实所用溶剂不具有有害作用或致突变作用, 还应设空白对照组 阳性对照 : 阳性对照物应能引起染色体结构畸变率明显高于背景资料 染毒途径可以不同于受试物 所选用的阳性对照物最好与受试物类别有关 可以使用下述物质 : 三亚乙基密胺 (triethylenemelamine) 甲磺酸乙酯(ethyl methanesulphonate) 乙基亚硝基脲 (ethyl nitrosonrea) 丝裂霉素 C(mytomycin C) 和环磷酰胺 (cyclophosphamide) 6.4 染毒方式 : 可采用经口或其它适宜的染毒方式 一般情况下, 染毒 1 次, 但分两次采集样品, 即每组动物分两个亚组, 亚组 1 于染毒后 12h~18h 处死并采集第一次样品 ; 亚组 2 于亚组 1 处死后 24h 采集第二次样品 如果采用多次染毒, 于末次染毒后 12h~18h 采集样品 于处死动物采集样品前腹腔注射细胞分裂中期阻断剂 ( 如用秋水仙素, 于处死前 4h, 按 4mg/kg 体重给药 ) 6.5 试验步骤 用颈椎脱臼法处死动物, 取出股骨, 剔除肌肉等组织 剪去股骨两端, 用注射器吸取 5mL 生理盐水, 从股骨一端注入, 用 10mL 离心管, 从股骨另一端接取流出的骨髓细胞悬液 将细胞悬液以 1000r/min 的速度离心 5 min ~7 min, 去除上清液 加入 0.075mol/L KCl 溶液 7ml, 用滴管将细胞轻轻地混匀, 放入 37 水浴中低渗处理 7min, 加入 2mL 固定液 ( 冰醋酸 : 甲醇 =1:3), 混匀, 以 1000r/min 速度离心 5 min ~7min, 弃去上清液 加入 7mL 固定液, 混匀, 固定 7min, 以 1000r/min 的速度离心 7min, 弃去上清液 用同法再固定 1~2 次, 弃去上清液 加入数滴新鲜固定液, 混匀 用混悬液滴片, 自然干燥 用姬姆萨染液染色 6.6 读片和结果处理 确定有丝分裂指数 : 包括所有处理组 阳性和阴性对照组 ( 每只动物计数 1000 个细胞 ) 计数畸变细胞 : 对每只动物选择 100 个分散良好的中期分裂相, 在显微镜油镜下进行读片 在读片时应记录每一观察细胞的染色体数目, 对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型 所得各组的染色体畸变率用 X 2 检验进行统计学处理, 以评价试验组

39 和对照组之间是否有显著差异 6.7 结果评价当受试物引起染色体畸变数具有统计学意义, 并有与剂量相关的增加或者在一个剂量组出现染色体畸变细胞数明显增高, 则判定具有致突变性 当结果不能得出, 应改变试验条件进一步进行测试 在评价时应综合考虑生物学意义和统计学意义 7 试验报告报告应包括下列项 (1) 受试物名称 理化性质 所用溶剂及配制 ; (2) 动物种属和品系 体重 数量 性别 来源 ( 注明合格证号和动物级别 ); (3) 实验动物饲养环境, 包括饲料来源 室温 相对湿度 实验动物房合格证号 ; (4) 剂量和组别 : 选择剂量的原则 剂量和组别 阴性和阳性对照物及剂量 ; (5) 试验条件和方法 : 染毒途径和染毒方案 细胞毒性测定方法 所用的细胞分裂中期阻断剂及其剂量和采样时间 简述制备染色体的方法 ; (6) 观察和分析的细胞数 ; (7) 畸变类型和数量及畸变率 ; (8) 结论 8 结果解释阳性结果证明受试物具有引起该种受试动物骨髓细胞染色体畸变的能力 阴性结果表明在本试验条件下受试物不引起该种受试动物骨髓细胞染色体畸变 十二 体内哺乳动物骨髓细胞微核试验 In Vivo Mammalian Bone Marrow Cytogenetics Test: Micronucleus Assay 1 范围本规范规定了哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验的基本原则 要求和方法 本规范适用于化妆品原料的染色体畸变检测 2 规范性引用文件 GB 实验动物与饲料标准 OECD Guidelines for Testing of Chemicals(No.481,Adopted:21,July 1997) 3 定义微核 (Micronucleus): 染色单体或染色体的无着丝点断片, 或因纺锤体受损而丢失的整个染色体, 在细胞分裂后期, 仍然遗留在细胞质中 末期之后, 单独形成一个或几个规则的次核, 被包含在子细胞的胞质内, 因比主核小, 故称为微核 4 原理凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化学物, 都可用微核试验来检测 各种类型的骨髓细胞都可形成微核, 但有核细胞的胞质少, 微核与正常核叶及核的突起难以鉴别 嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段, 此时红细胞的主核已排出, 因胞质内含有核糖体, 姬姆萨染色呈灰蓝色, 成熟红细胞的核糖体已消失, 被染成淡桔红色 骨髓中嗜多染红细胞数量充足, 微核容易辨认, 而且微核自发率低,

40 因此, 骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群 5 试验的基本原则通过适当的途径使动物接触受试物, 一定时间后处死动物, 取出骨髓, 制备涂片, 经固定 染色, 在显微镜下计数含微核的嗜多染红细胞 6 仪器和器械生物显微镜 解剖剪 镊子 止血钳 注射器 灌胃针头 载玻片 盖玻片 (24mm 50mm) 塑料吸瓶 纱布 滤纸等 7 试剂 7.1 小牛血清 ( 灭活 ) 将滤菌的小牛血清置于 56 恒温水浴保温 30min 灭活 灭活的小牛血清通常保存于冰箱冷冻室里 7.2 姬姆萨 (Giemsa) 染液成分 :Giemsa 染料 3.8g 甲醇 375mL 甘油 125mL 配制 : 将染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨, 再加入甲醇至 375mL 和甘油, 混合均匀, 放置 37 恒温箱中保温 48h 保温期间, 振摇数次, 促使染料的充分溶解, 取出过滤, 两周后用 7.3 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液 (ph7.4) 成分 : 磷酸氢二钠 (Na2HPO4 12H2O) g 磷酸二氢钾 (KH2PO4) 1.814g 加蒸馏水至 1000mL 配制 : 将上述两种成分溶于蒸馏水中 以 ph 试纸检验 ph 值 7.4 Giemsa 应用液取一份 Giemsa 染液与 6 份 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液混合而成 临用现配 8 实验动物和饲养环境小鼠是微核试验的常规动物 体重为 25g ~30g 也可选用成年大鼠, 体重为 150g ~200g 实验动物及实验动物房应符合国家相应规定 9 剂量分组一般取受试物 LD50 的 1/2 1/5 1/10 1/20 等剂量, 以求获得微核的剂量 - 反应关系曲线 当受试物的 LD50 大于 5g/kg 体重时, 可取 5g/kg 体重为最高剂量, 一般至少设 3 个剂量 每个剂量组 10 只动物, 雌 雄性各半 另外, 还应设溶剂对照和阳性物对照组 常用环磷酰胺作为阳性物对照, 剂量可为 40mg/kg 体重 根据受试物的理化性质 ( 水溶性和 / 或脂溶性 ) 确定受试物所用的溶剂, 通常用水 植物油或食用淀粉等 10 染毒途径和方式染毒途径视实验目的而定, 建议采用经口灌胃方式 采用 30h 两次给药法, 即两次给受试物间隔 24h, 第二次给受试物后 6h 取材 11 试验方法 11.1 骨髓的制取动物颈椎脱臼处死后, 打开胸腔, 沿着胸骨柄与肋骨交界处剪断, 剥掉附着其上的肌肉,

41 擦净血污, 横向剪开胸骨, 暴露骨髓腔, 然后用止血钳挤出骨髓液 11.2 涂片将骨髓液滴在载玻片一端的小牛血清液滴里, 仔细混匀 一般来讲, 两节胸骨髓液涂一张片子为宜 然后, 按血常规涂片法涂片, 长度约 2cm ~3cm 在空气中晾干 若立即染色, 需在酒精灯火焰上方, 稍微烘烤一下 11.3 固定将干燥的涂片放入甲醇液中固定 5min 即使当日不染色, 也应固定后保存 11.4 染色将固定过的涂片放入 Giemsa 应用液中, 染色 10min ~15min, 然后立即用 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液冲洗 11.5 封片用滤纸及时擦干染片背面的水滴, 再用双层滤纸轻轻按压染片, 以吸附染片上残留的水分, 再在空气中晃动数次, 以促其尽快晾干, 然后放入二甲苯中透明 5min, 取出滴上适量光学树脂胶, 盖上盖玻片, 写好标签 11.6 观察与计数先用低倍镜, 后用高倍镜粗略检查, 选择细胞分布均匀, 细胞无损, 着色适当的区域, 再在油浸镜下计数 虽然不计数含微核的有核细胞, 但需用有核细胞形态染色完好做好判断制片优劣的标准 本法观察含微核的嗜多染红细胞 嗜多染红细胞呈灰蓝色, 成熟红细胞呈淡桔红色 微核大多数呈单个圆形, 边缘光滑整齐, 嗜色性与核质相一致, 呈紫红色或蓝紫色 每只动物至少计数 1000 个嗜多染红细胞 微核率指含有微核的嗜多染红细胞数, 以千分率 ( ) 表示之 若一个嗜多染红细胞中出现两个或两个以上微核, 仍按一个有微核细胞计数 12 数据处理和结果判断 12.1 数据处理报告各组微核细胞率的均数和标准差, 利用适当的统计学方法如 Poinsson 分布 u 检验比较受试物各剂量组与溶剂对照组的微核率 12.2 结果判定根据 OECD Guidelines for Testing of Chemicals 的准则, 如果受试物试验组与溶剂对照组相比, 统计学上有显著性差异, 并有剂量 反应关系则可认为微核试验阳性 13 试验报告试验报告应包括以下内容 : (1) 受试物名称 理化性状 配制方法 所用溶剂 ; (2) 动物种属和品系 体重 数量 性别 来源 ( 注明合格证号和动物级别 ); (3) 实验动物饲养环境, 包括饲料来源 室温 相对湿度 实验动物室合格证号 ; (4) 剂量分组, 染毒途径和方式 ; (5) 试验方法 : 简述操作步骤, 所用统计学方法, 结果判定标准 ; (6) 结果 : 以列表方式报告受试物对动物骨髓细胞微核发生率 ( 表 1); (7) 结论 表 1 对动物骨髓嗜多染红细胞微核发生率

42 组别剂量动物数受检细胞数含微核细胞数微核率 P 值 受试物 (g/kg 体重 ) ( 只 ) ( 个 ) ( 个 ) ( ) 溶剂对照 阳性物对照 (mg/kg 体重 ) 十三 精子畸形试验 Sperm Malformation Test 1 范围本规范规定了动物精子畸形试验的基本原则 要求和方法 本规范适用于化妆品原料的遗传毒性检测 2 引用标准 GB 试验动物与饲料标准 GB 食品安全性毒理学评价程序 3 定义精子畸形 (sperm malformation) 指精子形态的异常改变 4 原理已知精子畸形是决定精子形成的基因发生突变的结果 常染色体和 Y- 性连锁基因突变及某些染色体重排, 如性 - 常染色体易位, 也可使精子发生畸形 小鼠精子畸形试验能评价受试物对精子生成 发育的影响, 可检测受试物在体内对生殖细胞的遗传毒性作用 5 试验的基本原则通过适当的途径使动物接触受试物, 经过一定时间后处死动物, 取其附睾, 制备涂片, 经固定 染色, 在显微镜下计数畸形精子 6 仪器和器械生物显微镜 解剖剪 镊子 表面皿 离心管 小漏斗 吸管 滴管 载玻片 擦镜纸等 7 试剂 7.1 1% 伊红染色液称取伊红 1g 溶于 100mL 蒸馏水中 7.2 生理盐水 甲醇 (A.R) 8 实验动物和饲养环境常规使用动物是雄性小鼠 6 周 ~8 周龄, 体重为 30g ~35g 实验动物及实验动物房应符合国家相应规定 9 剂量分组

43 受试物至少设三个剂量组 分别取 1/2 1/5 1/10 或 1/20LD50 剂量 当受试物的 LD50 大于 5g/kg 体重时, 可取 5g/kg 体重为最高剂量 另外设阴性 ( 溶剂 ) 对照组和阳性物对照组 常用溶剂为水 生理盐水 植物油 ( 玉米油 花生油 ) 等 阳性物对照组可采用环磷酰胺 40mg/kg/ 日 每组至少有 5 只存活动物 10 染毒途径和方式染毒途径视实验目的而定 常用途径为经口灌胃方式 受试物各剂量组 阴性对照组和阳性物对照组的动物, 均连续染毒 5d, 每日一次 一般于首次染毒后的第 35d 处死动物 11 试验方法 11.1 制片用颈椎脱臼法处死小鼠, 剖开腹腔, 暴露睾丸, 分离两侧附睾, 用眼科剪剖开附睾组织, 与适量生理盐水混匀, 涂片 11.2 固定待涂片干燥后, 放入甲醇 (A.R) 液中固定 5min 取出晾干 11.3 染色将涂片于 1% 伊红染液中染色 1h, 然后用蒸馏水轻轻冲洗, 晾干 11.4 观察与计数首先, 在低倍镜下选择背景清晰 精子分布均匀 重叠较少的区域, 然后, 在高倍镜下观察结构完整的 1000 个精子, 计数其中畸形的精子 精子畸形主要表现在头部 按 Wyrobeks 的分类标准, 主要类型有 : 无钩 香蕉形 无定形 胖头 尾折叠 双头及双尾 无尾精子 头部重叠的或整个与另一个重叠的精子均不计数 判断双头 双尾精子时, 要注意与两条精子的部分重叠相区别 12 数据处理和结果判断每只动物应按精子畸形类型分别记录, 以便计算各实验组的精子畸形发生率和精子畸形类型的构成比 利用 Wilcoxon 秩和检验法和其他适当的统计学方法 将受试物各剂量组精子畸形发生率分别与阴性对照组进行比较 精子畸形试验阳性的判断标准是畸形发生率至少为阴性对照组的倍量或经统计学处理有显著性差异, 并存在剂量 - 反应关系者 一般正常小鼠的精子畸形率为 0.8%~3.4%, 但每个实验室应有自己稳定的精子自发畸形率 13 试验报告试验报告应包括以下内容 : (1) 受试物名称 理化性状 配制方法 所用溶剂 ; (2) 动物种属和品系 体重 数量 来源 ( 注明合格证号和动物级别 ); (3) 实验动物饲养环境, 包括饲料来源 室温 相对湿度 实验动物室合格证号 ; (4) 剂量分组, 染毒途径和方式 ; (5) 试验方法 : 简述操作步骤, 所用统计学方法 ; (6) 结果 : 以列表方式报告受试物对动物精子畸形发生率和精子畸形类型分析的结果 ( 表 1 和表 2); (7) 结论

44 表 1 精子畸形发生率 组别 剂量 (g/kg) 动物数 ( 只 ) 受检精子总数 ( 个 ) 畸变精子数 ( 个 ) 畸变率 (%) P 值 受试物 溶剂对照 阳性物对照 (mg/kg) 注 : 畸变率以均数 ± 标准差表示 表 2 精子畸形类型分析 组别 剂量 (g/k g) 动物数 ( 只 ) 受检精子精子畸形分类及比例 (%) 总数 ( 个 ) 无钩香蕉形胖头无定型其他总计 受试物 溶剂对照 阳性物对照 (mg/kg) 十四 亚慢性经口毒性试验 Subchronic Oral Toxicity Test 1 范围本规范规定了啮齿类动物亚慢性经口毒性试验的基本原则 要求和方法 本规范适用于检测化妆品原料的亚慢性经口毒性 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No. 408, May 1981 ) 3 试验目的在估计和评价化妆品原料的毒性时, 获得受试物急性毒性资料后, 还需进行亚慢性经口毒性试验 通过该试验不仅可获得一定时期内反复接触受试物后引起的健康效应 受试物作用靶器官和受试物体内蓄积能力资料, 并可估计接触的无有害作用水平, 后者可用于选择和确定慢性试验的接触水平和初步计算人群接触的安全性水平 4 定义 4.1 亚慢性经口毒性 (Subchronic oral toxicity)

45 是指在实验动物部分生存期内, 每日反复经口接触受试物后所引起的不良反应 4.2 无有害作用水平 (No-adverse-effect level ) 是指在试验中不引起任何有害作用的最大染毒剂量, 可用每日单位动物体重接触受试物的重量 (mg/kg) 表示 当受试物是混入动物饲料或饮水中进行染毒时, 可用每公斤饲料或每毫升饮水中受试物重量 (mg/kg, mg/ml) 表示 5 试验的基本原则以不同剂量受试物每日经口给予各组实验动物, 连续染毒 90d, 每组采用一个染毒剂量 染毒期间每日观察动物的毒性反应 在染毒期间死亡的动物要进行尸检 染毒结束后所有存活的动物均要处死, 并进行尸检以及适当的病理组织学检查 6 试验方法 6.1 实验动物和饲养环境 动物种系的选择常规选择啮齿类动物, 首选大鼠 一般选用 6 周 ~8 周龄的大鼠 动物体重的变动范围不应超出平均动物体重的 10% 若该试验为慢性试验的预备试验, 则在两个试验中所用的动物种系应当相同 动物的性别和数量每一剂量组实验动物至少应有 20 只 ( 雌雄各半 ), 但是考虑到亚慢性试验的重要性, 应适当增加每组雌雄动物数 若计划在试验过程中处死动物, 则应增加计划处死的动物数 试验结束时的动物数需达到能够有效评价受试物毒性作用的数量 此外, 可另设一追踪观察组, 选用 20 只动物 ( 雌雄各半 ), 给予最高剂量受试物, 染毒 90d, 在全程染毒结束后继续观察一段时间 ( 一般不少于 28d), 以了解毒性作用的持续性 可逆性或迟发毒作用 饲养环境实验动物及实验动物房应符合国家相应规定 选用常规饲料, 饮水不限制 6.2 剂量分组试验时至少要设三个染毒组和一个对照组 除不接触受试物外, 对照组的其它条件均与试验组相同 最高染毒剂量的设计应在引起中毒效应的前提下又不致造成动物过多死亡, 否则将会影响结果的评价 低剂量组应不出现任何毒性作用 若掌握人群接触水平, 则最低染毒剂量应高于人群的实际接触水平 中间剂量组应引起较轻的可观察到的毒性作用 若设多个中间剂量组, 则各组的染毒剂量应引起不同程度毒性作用 在中 低剂量组和对照组中, 动物死亡率应很低, 以保证得到有意义的评价结论 对那些毒性较低的物质来说, 当通过饲料染毒时应特别注意确保大量的受试物混入不会对动物正常营养产生影响 对其它的染毒方式要加以特殊说明 若采用灌胃方式染毒, 则每日染毒时点应相同, 并定期 ( 每周 ) 按体重调整染毒剂量, 维持单位体重染毒水平不变 本项试验中, 如果接触水平超过 1000mg/kg 时仍未产生可观测到的毒性效应, 而且可以根据相关结构化合物预期受试物毒性时, 可以考虑不必进行三个剂量水平的全面试验观察 6.3 试验步骤染毒开始前至少要有 5d 时间使实验动物适应实验室饲养环境 实验动物随机分组 受试物可通过混入饲料或饮水 直接喂饲以及灌胃进行染毒 动物最好每周 7d 染毒, 但考虑到可行性, 每周可染毒 5d 试验期间所有动物染毒的方式应完全相同 若为染毒目的加入其它溶剂或添加剂, 这些溶剂或添加剂不应影响受试物的吸收或引起毒性作用

46 6.4 临床观察观察时间应至少为 90d 追踪观察组还要增加 28d, 但不作任何处理, 以了解毒性作用的可逆性 持续性及迟发毒作用 观察期间对动物的任何毒性表现均应记录, 记录内容包括发生时间 程度和持续时间 观察应至少包括如下内容 : 皮肤和被毛的改变 眼和粘膜变化 呼吸 循环 植物神经和中枢神经系统 肢体运动和行为活动等改变 应计算每周饲料消耗量 ( 或当通过饮水染毒时的饮水消耗量 ), 记录每周体重变化 6.5 临床检查 眼科检查在动物染毒前和染毒后, 最好对所有实验动物, 至少应对最高剂量组和对照组动物, 使用眼科镜或其它有关设备进行眼科检查 若发现动物有眼科变化则应对所有动物进行检查 血液检查在染毒前 染毒中期 染毒结束及追踪观察结束时应测定血球容积 血红蛋白浓度 红细胞数 白细胞总数和分类, 必要时测定凝血功能如凝血时间 凝血酶原时间 凝血激酶时间或血小板数等指标 临床血液生化检查在染毒前 染毒中期 染毒结束及追踪观察结束时进行, 检查指标包括电解质平衡 碳水化合物代谢 肝 肾功能 可根据受试物作用形式选择其它特殊检查 推荐的指标包括 : 钙 磷 氯 钠 钾 禁食血糖 ( 不同动物品系采用不同的禁食期 ) 血清谷丙转氨酶 血清谷草转氨酶 鸟氨酸脱羧酶 γ 谷氨酰转肽酶 尿素氮 白蛋白 血液肌酐 总胆红素及总血清蛋白 必要时可进行脂肪 激素 酸碱平衡 正铁血红蛋白 胆碱酯酶活性的分析测定 此外, 还可根据所观察到的毒性作用进行其它更大范围的临床生化检查, 以便进行全面的毒性评价 尿液检查一般不需要进行, 只有当怀疑存在或观察到相关毒性作用时方需进行尿液检查 6.6 病理检查 大体尸检所有动物均应进行全面的大体尸检, 内容包括动物的外观 所有孔道, 胸腔 腹腔及其内容物 肝 肾 肾上腺和睾丸应在分离后尽快称重以防水分丢失 应将下列组织和器官保存在固定液中, 以备日后进行病理组织学检查 : 所有大体解剖呈现异常的器官 脑 ( 包括延髓 / 脑桥 小脑和大脑皮层 脑垂体 ) 甲状腺/ 甲状旁腺 胸腺 肺 / 气管 心脏 主动脉 唾液腺 * 肝 脾 肾 肾上腺 胰 性腺 子宫 生殖附属器官* 皮肤* 食管 胃 十二指肠 空肠 回肠 盲肠 结肠 直肠 膀胱 有代表性的淋巴结 雌性乳腺 * 大腿肌肉 * 周围神经 胸骨( 包括骨髓 ) 眼 * 股骨( 包括关节面 )* 脊髓( 包括颈部 胸部 腰部 )* 和泪腺 * * 只有当毒性作用提示或作为被研究的靶器官时才需要检查这些器官 病理组织学检查应对下述器官和组织进行检查 : (1) 所有最高剂量组和对照组动物的重要的和可能受到损伤的器官或组织, 如高剂量组动物的器官或组织有病理组织学的病变, 则应扩展至其它剂量组的相应的器官和组织

47 (2) 各剂量组大体解剖见有异常的器官或组织 (3) 其它剂量组动物的靶器官 (4) 在追踪观察组, 应对那些在染毒组呈现毒性作用的组织和器官进行检查 7 试验结果的评价 7.1 结果的处理可通过表格形式总结试验结果, 显示试验开始时各组动物数 出现损伤的动物数 损伤的类型和每种损伤的动物百分比 对所有数据应采用适当的统计学方法进行评价, 统计学方法应在试验设计时确定 7.2 试验结果的评价亚慢性经口毒性试验结果应结合前期试验结果, 并考虑到毒性效应指标和尸检及病理组织学检查结果进行综合评价 毒性评价应包括受试物染毒剂量与是否出现毒性反应 毒性反应的发生率及其程度之间的关系 这些反应包括行为或临床异常 肉眼可见的损伤 靶器官 体重变化情况 死亡效应以及其它一般或特殊的毒性作用 成功的亚慢性试验应能够提出统计学上有意义的无有害作用水平 7.3 试验报告试验报告应包括如下内容 : (1) 受试物名称 理化性状 配制方法 所用浓度 ; (2) 实验动物的种属 品系和来源 ( 注明合格证号和动物级别 ); (3) 实验动物饲养环境, 包括饲料来源 室温 相对湿度 单笼饲养或群饲 实验动物房合格证号 ; (4) 试验方法 ; (5) 按性别和剂量的毒性反应数据 ; (6) 在试验期间动物死亡的时间或动物在染毒结束时是否存活 ; (7) 毒性作用或其它作用 ; (8) 观察到的每个异常症状的时间及其转归情况 ; (9) 食物摄入量和动物体重资料 ; (10) 眼科检查结果 ; (11) 血液学检查结果 ; (12) 临床生化检查结果 ; (13) 尸检所见 ; (14) 病理组织学检查所见的详细描述 ; (15) 对结果进行处理的统计学方法 ; (16) 结论 8 试验结果的解释亚慢性经口毒性试验能够提供受试物在经口反复接触时的毒性作用资料 其试验结果可在很有限的程度上外推到人, 但它可为确定人群暴露的无有害作用水平和允许暴露水平提供有用的信息 十五 亚慢性经皮毒性试验

48 Subchronic Dermal Toxicity Test 1 范围本规范规定了啮齿类动物亚慢性经皮毒性试验的基本原则 要求和方法 本规范适用于检测化妆品原料的亚慢性经皮毒性 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No. 411, May 1981 ) 3 试验目的在估计和评价化妆品原料的毒性时, 获得受试物急性经皮毒性资料后, 还需进行亚慢性经皮毒性试验 通过该试验不仅可获得在一定时期内反复接触受试物后可能引起的健康影响资料, 而且为评价受试物经皮渗透性 作用靶器官和慢性皮肤毒性试验剂量选择提供依据 4 定义 4.1 亚慢性经皮毒性 (Subchronic dermal toxicity) 是指在实验动物部分生存期内, 每日反复经皮接触受试物后所引起的不良反应 4.2 无有害作用水平 ( No-adverse-effect level ) 是指在试验中不引起任何有害作用的最大染毒剂量 用每日每单位动物体重给予受试物的重量 (mg/kg) 表示 5 试验的基本原则以不同剂量受试物每日经皮给予各组实验动物, 连续染毒 90d, 每组采用一个染毒剂量 染毒期间每日观察动物的毒性反应 在染毒期间死亡的动物要进行尸检 染毒结束后对所有存活的动物均要处死, 并进行尸检以及适当的病理组织学检查 6 试验方法 6.1 受试物若受试物为固体, 应将其粉碎并用水 ( 或适当的介质 ) 充分湿润, 以保证受试物与皮肤有良好的接触 若采用介质, 应考虑该介质对受试物皮肤通透性的影响 液体受试物一般不用稀释 6.2 实验动物和饲养环境 动物种系的选择可采用成年大鼠 家兔或豚鼠进行试验, 也可使用其它种属的动物 当亚慢性试验作为慢性试验的预备试验时, 则在两项试验中所使用的动物种系应当相同 动物的性别和数量每一剂量组实验动物至少应有 20 只 ( 雌雄各半 ), 皮肤健康 若计划在试验过程中处死动物, 则应增加计划处死的动物数 此外, 可另设一追踪观察组, 选用 20 只动物 ( 雌雄各半 ), 给予最高剂量受试物, 染毒 90d, 全程染毒结束后继续观察一段时间 ( 一般不少于 28d), 以了解毒性作用的持续性 可逆性或迟发毒作用 饲养环境实验动物及实验动物房应符合国家相应规定 选用常规饲料, 饮水不限制 6.3 剂量分组试验时至少要设三个染毒组和一个对照组 除不接触受试物外, 对照组的其它条件均与试验组相同 最高染毒剂量的设计应在引起中毒效应的前提下又不致造成动物过多死亡, 否则将会影响结果的评价 低剂量组应不出现任何毒性作用 若掌握人群接触水平,

49 则最低染毒剂量应高于人群的实际接触水平 中间剂量组应引起较轻的可观察到的毒性作用 若设多个中间剂量组, 则各组的染毒剂量应引起不同程度毒性作用 在中 低剂量组和对照组中, 动物死亡率应很低, 以保证得到有意义的评价结论 若受试物引起严重的皮肤刺激效应, 则应降低受试物的使用浓度, 尽管这样可导致原来在高剂量下出现的其它毒性作用减弱或消失 若在试验早期动物的皮肤受到严重损伤, 则有必要终止试验, 并使用较低的浓度重新开始试验 本项试验中, 如果接触水平超过 1000mg/kg 时仍未产生可观测到的毒性效应, 而且可以根据相关结构化合物预期受试物毒性时, 可以考虑不必进行三个剂量水平的全面试验观察 6.4 试验步骤动物在试验前至少要在实验室饲养环境中适应 5d 时间 染毒前 24h, 将动物躯干背部染毒区的被毛剪掉或剃除 大约每周要对染毒部位去毛 在使用剪刀或剃刀进行去毛时应特别小心, 以防损伤动物的皮肤从而引起皮肤通透性的改变 染毒部位的面积不应小于动物体表面积的 10%, 应通过对动物体重的测定确定染毒部位的面积 若受试物毒性较大, 则可相对减小染毒区域的面积, 但受试物应尽可能薄而均匀地涂敷于整个染毒区域 在染毒操作期间应使用玻璃纸和无刺激的胶带将受试物固定, 以保证受试物与皮肤有良好的接触, 并防止动物舔食 在 90d 试验期间, 实验动物最好是每周 7d 每天染毒 6h, 然而出于可行性的考虑, 每周进行 5d 染毒也是可以的 追踪观察组则要多进行 28d 观察, 以了解毒性作用的持续性 可逆性及迟发毒作用 6.5 临床观察试验中每天至少应进行一次仔细的临床检查 观察期间对动物的任何毒性表现均应记录, 记录内容包括发生时间 程度和持续时间 笼边观察应至少包括如下内容 : 皮肤和被毛的改变 眼和粘膜变化 呼吸 循环 植物神经和中枢神经系统 肢体运动和行为活动等改变 应计算每周饲料消耗量, 记录每周体重变化 6.6 临床检查 眼科检查在动物染毒前和染毒后, 最好对所有实验动物, 至少应对最高剂量组和对照组动物, 使用眼科镜或其它有关设备进行眼科检查 若发现眼科变化则应对所有动物进行检查 血液检查在染毒前 染毒中期 染毒结束及追踪观察结束时应测定包括血球容积 血红蛋白浓度 红细胞数 白细胞总数和分类 必要时测定凝血功能, 如凝血时间 凝血酶原时间 凝血激酶时间或血小板数等指标 临床血液生化检查染毒前 染毒中期 染毒结束及追踪观察结束时进行, 检查指标包括电解质平衡 碳水化合物代谢 肝 肾功能 可根据受试物作用形式选择其它特殊检查 推荐的指标包括 : 钙 磷 氯 钠 钾 禁食血糖 ( 不同动物品系采用不同的禁食期 ) 血清谷丙转氨酶 血清谷草转氨酶 鸟氨酸脱羧酶 γ 谷氨酰转肽酶 尿素氮 白蛋白 血液肌酐 总胆红素及总血清蛋白 必要时可进行脂肪 激素 酸碱平衡 正铁血红蛋白 胆碱酯酶活性的分析测定 此外, 还可根据所观察到的毒性作用进行其它更大范围的临床生化检查, 以便进

50 行全面的毒性评价 尿液检查一般不需要进行, 只有当怀疑存在或观察到相关毒性作用时方需进行尿液检查 6.7 病理检查 大体尸检所有动物均应进行全面的大体尸检, 内容包括机体的外观 所有孔道, 胸腔 腹腔及其内容物 肝 肾 肾上腺和睾丸应在分离后尽快称重以防水分丢失 应将下列组织和器官保存在固定液中, 以便日后进行病理组织学检查 : 所有大体解剖呈现异常的器官 脑 ( 包括延髓 / 脑桥 小脑和大脑皮层 脑垂体 ) 甲状腺/ 甲状旁腺 胸腺 肺 / 气管 心脏 主动脉 唾液腺 * 肝 脾 肾 肾上腺 胰 性腺 子宫 生殖附属器官* 皮肤* 食管 胃 十二指肠 空肠 回肠 盲肠 结肠 直肠 膀胱 有代表性的淋巴结 雌性乳腺 * 大腿肌肉 * 周围神经 胸骨( 包括骨髓 ) 眼 * 股骨( 包括关节面 )* 脊髓( 包括颈部 胸部 腰部 )* 和泪腺 * * 只有当毒性作用提示或作为被研究的靶器官时才需要检查这些器官 病理组织学检查应对下述器官和组织进行病理组织学检查 : (1) 所有最高剂量组和对照组动物的重要的和可能受到损伤的器官或组织, 如高剂量组动物的器官或组织有病理组织学病变则应扩展至其他剂量组的相应的器官和组织 (2) 各剂量组大体解剖见有异常的器官或组织 (3) 其它剂量组动物的靶器官 (4) 对追踪观察组, 应对那些在染毒组呈现毒性作用的组织和器官进行检查 7 试验结果的评价 7.1 结果的处理可通过表格形式总结试验结果, 显示试验开始时各组动物数 出现损伤的动物数 损伤的类型和每种损伤的动物百分比 对所有数据应采用适当的统计学方法进行评价, 统计学方法应在试验设计时确定 7.2 试验结果的评价亚慢性经皮毒性试验结果应结合前期试验结果, 并考虑到毒性效应指标和尸检及病理组织学检查结果进行综合评价 毒性评价应包括受试物染毒剂量与是否出现毒性反应 毒性反应的发生率及其程度之间的关系 这些反应包括行为或临床异常 肉眼可见的损伤 靶器官 体重变化情况 死亡效应以及其它一般或特殊的毒性作用 成功的亚慢性试验应能够提出统计学上有意义的无有害作用水平 7.3 试验报告试验报告应包括如下内容 : (1) 受试物名称 理化性状 配制方法 染毒剂量 染毒面积 染毒方式等 ; (2) 实验动物的种属 品系和来源 ( 注明合格证号和动物级别 ); (3) 饲养环境, 包括饲料来源 室温 相对湿度 单笼饲养或群饲 实验动物房合格证号 ; (4) 试验方法 ; (5) 按性别和剂量的毒性反应数据 ;

51 (6) 试验期间动物死亡时间或动物在实验结束时是否存活 ; (7) 毒性作用或其它作用 ; (8) 观察到每个异常症状的时间及其转归情况 ; (9) 食物摄入量和动物体重资料 ; (10) 眼科检查结果 ; (11) 血液学检查结果 ; (12) 临床生化检查结果 ; (13) 尸检所见 ; (14) 病理组织学检查所见的详细描述 ; (15) 对结果进行处理的统计学方法 ; (16) 结论 8 试验结果的解释亚慢性经皮毒性试验能够提供受试物在经皮反复接触时的毒性作用资料 其试验结果可在很有限的程度上外推到人, 但它可为确定人群暴露的无有害作用水平和允许暴露水平提供有用的信息 十六 致畸试验 Teratogenicity Test 1 范围本规范规定了动物致畸试验的基本原则, 要求和方法 本规范用于检测化妆品原料的致畸性 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No. 414, May 1981 ) 食品安全性毒理学评价程序 (GB ) 3 试验目的检测妊娠动物接触化妆品原料后引起胎鼠畸形的可能性 4 定义致畸性 : 能在胚胎发育期引起胎鼠永久性结构和功能异常的化学物质特性 5 试验基本原则在胚胎发育的器官形成期给妊娠动物染毒, 在胎鼠出生前将妊娠动物处死, 取出胎鼠检查其骨骼和内脏畸形 6 试验方法 6.1 试剂 茜素红溶液 : 茜素红 0.1g, 氢氧化钾 10g, 蒸馏水 1000mL 透明液 A: 甘油 200mL, 氢氧化钾 10g 蒸馏水 790mL 透明液 B: 甘油与蒸馏水等量混合 固定液 (Bouins 液 ): 苦味酸饱和液 75 份, 甲醛 20 份, 冰醋酸 5 份 6.2 实验动物和饲养环境